人端粒酶反转录酶转染大鼠许旺细胞的生物学特性

背景：研究表明,基因修饰许旺细胞可使许旺细胞在体内存活时间延长,促进神经再生和功能的恢复。目的：以反转录病毒PLXSN 为载体,将hTERT 基因转染入体外培养的大鼠许旺细胞,检测许旺细胞端粒酶活性及细胞生物学特性。方法：体外培养Wistar大鼠许旺细胞,经反转录病毒PLXSN为载体介导人端粒酶反转录酶基因转染,在同等条件下进行空载病毒转染,以正常培养的许旺细胞为对照组。采用RT-PCR,Western blot检测许旺细胞人端粒酶反转录酶基因和蛋白的表达,流式细胞仪测定细胞周期分布的变化。以细胞生长曲线、MTT比色法观察细胞生长的优化作用。结果与结论：人端粒酶反转录酶基因转染许旺细胞48 h后,检测到人端粒酶反转录酶mRNA和蛋白水平表达明显。与对照组和空载病毒组比较,细胞的生长速度明显增快,G₀/G₁期细胞数减少,S期细胞数增多,差异有显著性意义(P < 0.05)。结果表明通过反转录病毒PLXSN 为载体介导人端粒酶反转录酶基因转染使许旺细胞端粒酶活性明显升高,能够促进体外培养的大鼠许旺细胞增殖。中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞;骨髓干细胞;造血干细胞;脂肪干细胞;肿瘤干细胞;胚胎干细胞;脐带脐血干细胞;干细胞诱导;干细胞分化;组织工程全文链接：     

碱性成纤维细胞生长因子基因转染优化脐带间充质干细胞的培养

背景：目前多采取重组腺相关病毒作为载体介导碱性成纤维细胞生长因子基因转染的方法,将外源性碱性成纤维细胞生长因子基因转入脐带间充质干细胞内并持续表达,调控细胞增殖及定向分化,取得高效持久的治疗作用。 目的：了解采用重组腺相关病毒作为载体介导碱性成纤维细胞生长因子基因转染对体外培养的脐带间充质干细胞增殖及细胞周期的影响。 方法：体外培养脐带间充质干细胞,经重组腺相关病毒作为载体介导碱性成纤维细胞生长因子基因转染,分为对照组、空载病毒组、碱性成纤维细胞生长因子转染组。用RT-PCR,Western blot检测脐带间充质干细胞在转染前后碱性成纤维细胞生长因子基因和蛋白的表达。应用细胞生长曲线、CCK-8观察细胞生长的优化作用,采用流式细胞术测定细胞周期分布的变化。 结果与结论：转染碱性成纤维细胞生长因子后,转染组与对照组、空载病毒组相比碱性成纤维细胞生长因子基因和蛋白水平均有表达,细胞的生长速度明显增快,细胞周期G0/G1期减少,S期细胞数增多,各组间差异有显著性意义(P < 0.05)。说明,通过重组腺相关病毒作为载体介导碱性成纤维细胞生长因子基因转染能促进体外培养的脐带间充质干细胞增殖,对其培养有优化作用。     

Cx43基因干扰对鼠胎肝干细胞培养的优化效应

背景：胎肝干细胞具有分化成肝细胞、胆管细胞的潜能,参与肝脏的修复与重建,是肝细胞的重要来源,但是人体的胎肝干细胞含量极少,如何获取一定数量和较高纯度的胎肝干细胞是目前研究的热点。目的：构建能有效抑制大鼠胎肝干细胞Cx43基因表达的siRNA载体,探讨抑制 Cx43表达对体外培养的鼠胎肝干细胞增殖及细胞周期的影响。方法：体外培养鼠胎肝干细胞,设计及合成靶向Cx43的siRNA序列(Cx43-siRNA)以及阴性对照序列(NC-siRNA),采用电转法转染大鼠胎肝干细胞,即为实验组和对照组,未转染的胎肝干细胞为空白组。应用real-time PCR和Western blot法检测转染前后鼠胎肝干细胞Cx43基因和蛋白的表达;细胞生长曲线、CCK-8法观察细胞生长增殖情况;流式细胞术测定细胞周期分布的变化。结果与结论：转染Cx43-siRNA后,实验组与对照组、空白组相比Cx43基因和蛋白水平表达均明显降低,细胞的生长速度明显增快,G₀/G₁期细胞减少,S期细胞数增多,差异有显著性意义(P < 0.05),结果表明通过电转法转染靶向Cx43的siRNA能促进体外培养的鼠胎肝干细胞增殖,对其培养有优化作用。中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞;骨髓干细胞;造血干细胞;脂肪干细胞;肿瘤干细胞;胚胎干细胞;脐带脐血干细胞;干细胞诱导;干细胞分化;组织工程全文链接：     

小分子干扰RNA介导的RhoA沉默优化胎肝干细胞培养*

背景：细胞移植治疗是目前的研究热点之一,寻找良好的细胞来源并有效扩增,是大量临床应用的基础。 目的：通过沉默RhoA基因优化胎肝干细胞培养方法。 方法：体外培养胎肝干细胞,经小分子干扰RNA转染以沉默RhoA基因表达,分为3组：A组为干细胞组,B组为经随机打乱顺序的小分子干扰RNA转染干细胞组,C组为经小分子干扰RNA转染的干细胞组。应用反转录-聚合酶链反应、Western blot法检测胎肝干细胞在转染前后RhoA基因和蛋白的表达;四甲基偶氮唑蓝比色法观察细胞生长的优化作用;流式细胞术测定细胞周期分布的变化。 结果与结论：转染小分子干扰RNA后C组与A、B组相比,RhoA基因和蛋白表达量明显降低(P < 0.05),细胞的生长速度明显增快,细胞周期G0/G1期减少,S期细胞数增多,各组间差异有显著性意义(P < 0.05)。提示通过沉默RhoA基因的方法可以促进胎肝干细胞增殖,对其培养有优化作用。 关键词：胎肝干细胞;细胞培养;RhoA;RNA干扰;细胞增殖 doi:10.3969/j.issn.1673-8225.2012.10.021     

构建人端粒酶反转录酶修饰的永生化大鼠骨髓间充质干细胞株

背景：骨髓间充质干细胞具有取材方便、多向分化及低免疫原性等优点,是转基因细胞移植镇痛领域中的理想载体细胞,但由于骨髓中间充质干细胞含量有限、体外培养的复制性衰老等问题,制约其在镇痛研究中的应用。 目的：构建永生化大鼠骨髓间充质干细胞株,为转基因细胞移植镇痛提供载体细胞来源。 方法：构建携带人端粒酶反转录酶基因的慢病毒pLV-Puro-EF1α-hTERT并转染第3代骨髓间充质干细胞后进行嘌呤霉素筛选,获得阳性细胞克隆并扩大培养,分别采用RT-PCR和TRAP法检测转染细胞人端粒酶反转录酶的表达和端粒酶活性,同时观察细胞形态、增殖和诱导分化能力、表面分子以及Nestin、MHC-Ⅰ和MHC-Ⅱ的表达,检测细胞染色体核型和致瘤性。 结果与结论：人端粒酶反转录酶基因修饰的骨髓间充质干细胞可以体外连续培养超过30代。与未转染的细胞和对照病毒转染的细胞相比,慢病毒转染的骨髓间充质干细胞人端粒酶反转录酶mRNA表达、端粒酶活性以及细胞增殖能力均提高,细胞周期主要处于G2/M以及S期,增殖指数明显升高;细胞表面分子CD29、CD44、CD90表达阳性率大于70%,而CD34、CD45表达阳性率不足5%,胞浆Nestin的表达阳性,而MHC-Ⅰ和MHC-Ⅱ未见表达,保留了干细胞成骨、成脂、成神经的分化能力,细胞形态、染色体核型均正常,裸鼠接种无致瘤性。以上结果提示成功构建了人端粒酶反转录酶基因修饰的永生化大鼠骨髓间充质干细胞株,为转基因细胞移植用于镇痛研究提供了生物学性状均一、稳定的安全载体细胞。 中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞;骨髓干细胞;造血干细胞;脂肪干细胞;肿瘤干细胞;胚胎干细胞;脐带脐血干细胞;干细胞诱导;干细胞分化;组织工程     

人端粒酶反转录酶转染的骨髓间充质干细胞移植治疗大鼠糖尿病

背景：人端粒酶反转录酶是调控增殖及定向分化的首选生长因子之一,具有多重生物学效应。 目的：观察人端粒酶反转录酶表达的骨髓间充质干细胞移植治疗大鼠糖尿病的效果。 方法：体外培养SD大鼠骨髓间充质干细胞,经反转录病毒PLXSN 为载体介导人端粒酶反转录酶基因转染骨髓间充质干细胞,在转染前后用RT-PCR检测骨髓间充质干细胞人端粒酶反转录酶基因的表达。60只雌性SD大鼠中随机取15只作为正常对照组,一次性注射生理盐水,余45只按45 mg/kg的剂量注射链脲霉素建立糖尿病模型后,随机分为3组,分别通过大鼠尾静脉注射移植人端粒酶反转录酶基因转染的骨髓间充质干细胞0.2 mL、骨髓间充质干细胞0.2 mL、生理盐水0.2 mL。 结果与结论：转染48 h后发现,骨髓间充质干细胞有人端粒酶反转录酶mRNA的表达,且重点集中于胞核内。移植后14 d,糖尿病组大鼠空腹血糖维持在较高水平,且高于正常对照组(P < 0.05);与糖尿病组相比,各移植组大鼠空腹血糖水平显著下降(P < 0.05);与骨髓间充质干细胞移植组相比,人端粒酶反转录酶基因转染的骨髓间充质干细胞移植组大鼠空腹血糖水平显著下降(P < 0.05),接近正常对照组水平(P > 0.05)。结果提示人端粒酶反转录酶表达的骨髓间充质干细胞移植能有效治疗大鼠糖尿病。中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞;骨髓干细胞;造血干细胞;脂肪干细胞;肿瘤干细胞;胚胎干细胞;脐带脐血干细胞;干细胞诱导;干细胞分化;组织工程全文链接：     

构建人端粒酶反转录酶基因腺相关病毒2载体在人髓核细胞的表达

背景：动物研究显示,自体髓核细胞移植能有效修复椎间盘退变。然而髓核细胞体外增殖能力差,这就限制了其作为种子细胞在椎间盘退变性疾病治疗中的研究及应用。 目的：构建包含外源性人端粒酶反转录酶基因的腺相关病毒2载体,观察其转染人髓核细胞后人端粒酶反转录酶基因的表达。 方法：构建pSNAV2.0-pRSV-hTERT质粒并鉴定,采用AAVMaxTM包装系统进行重组腺相关病毒2-人端粒酶反转录酶载体的构建,以PCR及酶切方法验证构建的质粒,构建成功后扩增,并纯化。利用腺相关病毒2-增强型绿色荧光蛋白载体转染第1代人髓核细胞,测定最佳感染复数。参照此感染复数值,确定腺相关病毒2-人端粒酶反转录酶对人髓核细胞转染的相关感染复数;对照组采用不含外源性人端粒酶反转录酶基因的腺相关病毒2进行转染。转染后1,2,4周分别采用RT-PCR对人端粒酶反转录酶基因mRNA水平进行半定量检测。 结果与结论：实验成功构建了腺相关病毒2-人端粒酶反转录酶载体;并获得了滴度达2×10¹¹ v•g/mL的腺相关病毒2-人端粒酶反转录酶载体。测得腺相关病毒2-人端粒酶反转录酶载体对人髓核细胞的最佳感染复数为5×10⁴ v•g/cell。在以1×10⁴,5×10⁴,1×10⁵ v•g/cell转染人髓核后,均可检测到人端粒酶反转录酶基因mRNA的高量表达。采用RT-PCR半定量检测方法,发现以转染后2周时人端粒酶反转录酶 mRNA表达量相对最高(P < 0.05),4周时仍可见人端粒酶反转录酶基因mRNA的稳定表达。而对照组无论在何时间点均未能检测到人端粒酶反转录酶mRNA的表达。提示利用腺相关病毒2可以成功构建包含外源性人端粒酶反转录酶基因的病毒载体,腺相关病毒2-人端粒酶反转录酶能有效转染人髓核细胞并稳定表达人端粒酶反转录酶基因mRNA,此结果可能为增强髓核细胞性能提供新的策略。 中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建;骨细胞;软骨细胞;细胞培养;成纤维细胞;血管内皮细胞;骨质疏松;组织工程全文链接：     

人端粒酶反转录酶基因修饰骨髓间充质干细胞调控肝细胞增殖和凋亡

背景：研究表明人端粒酶反转录酶基因的导入可以使骨髓间充质干细胞的生命周期得到显著延长,使其能够继续保持多向分化潜能。 目的：探讨人端粒酶反转录酶基因修饰骨髓间充质干细胞对肝细胞增殖和凋亡的影响。 方法：采取直接贴壁法,分离、培养大鼠骨髓间充质干细胞,利用脂质体转染法,将编码hTERT基因的真核表达质粒pCIneo-hTERT导入骨髓间充质干细胞。将hTERT基因转染骨髓间充质干细胞与肝细胞按1︰1共培养(观察共培养组),同时设未转染骨髓间充质干细胞与肝细胞按1︰1共培养组(对照共培养组)和肝细胞单独培养组,采用MTT比色法和免疫荧光染色法观察骨髓间充质干细胞对肝细胞增殖和凋亡的影响。 结果与结论：观察共培养组的肝细胞增殖率明显高于对照共培养组和肝细胞单独培养组,差异有显著性意义(P < 0.05);观察共培养组的肝细胞存活率明显高于肝细胞单独培养组,差异有显著性意义(P < 0.05)。结果表明人端粒酶反转录酶基因修饰的骨髓间充质干细胞可以抑制肝细胞的凋亡,并促进其增殖,具有改善肝细胞功能的作用。 中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞;骨髓干细胞;造血干细胞;脂肪干细胞;肿瘤干细胞;胚胎干细胞;脐带脐血干细胞;干细胞诱导;干细胞分化;组织工程     

人端粒酶反转录酶基因修饰骨髓间充质干细胞静脉移植治疗糖尿病

背景：胰腺或胰岛细胞移植以及干细胞移植治疗为根治糖尿病带来了希望,但是胰腺或胰岛移植会出现供者缺乏和免疫排异反应问题而限制了其在临床的发展,因此干细胞移植治疗成为目前研究的热点。目的：观察人端粒酶反转录酶基因修饰的骨髓间充质干细胞移植对SD大鼠糖尿病的治疗效果。方法：以反转录病毒PLXSN为载体介导人端粒酶反转录酶基因转染骨髓间充质干细胞。从36只雄性SD大鼠中随机取6只作为对照组,注射生理盐水,其余30只注射链脲霉素(按45 mg/kg)建立糖尿病模型后,随机等分为干细胞组、人端粒酶反转录酶基因转染干细胞组和糖尿病组。造模后干细胞组、人端粒酶反转录酶基因转染干细胞组大鼠通过尾静脉注入1 mL骨髓间充质干细胞(1.5×10¹⁰ L^-1)和1 mL人端粒酶反转录酶基因转染骨髓间充质干细胞(1.5×10¹⁰ L^-1)。结果与结论：注射链脲霉素24 h后,与对照组相比,糖尿病组大鼠空腹血糖明显增加,且高于正常值       (6.7 mmol/L);移植后15 d,与糖尿病组相比,干细胞组、人端粒酶反转录酶基因转染干细胞组大鼠空腹血糖水平显著下降(P < 0.05),体质量显著增加(P < 0.05),人端粒酶反转录酶基因转染干细胞组较干细胞组更为明显;移植后45 d,干细胞组、人端粒酶反转录酶基因转染干细胞组大鼠空腹血糖水平与体质量接近对照组(P > 0.05),人端粒酶反转录酶基因转染干细胞组优于干细胞组,而糖尿病组大鼠空腹血糖维持较高水平,且体质量持续下降。上述结果提示人端粒酶反转录酶基因转染的骨髓间充质干细胞能有效治疗大鼠糖尿病。 中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞;骨髓干细胞;造血干细胞;脂肪干细胞;肿瘤干细胞;胚胎干细胞;脐带脐血干细胞;干细胞诱导;干细胞分化;组织工程     

法舒地尔和RhoA沉默对神经干细胞增殖的影响

背景：Rho及其相关分子在神经轴突生长、分化、延伸及突触形成中起重要作用,阻断和抑制RhoA/ROCK通路可促进神经干细胞的增殖与生长。 目的：观察Rho激酶抑制剂法舒地尔和RNAi介导的RhoA基因沉默对大鼠神经干细胞增殖的影响。 方法：体外培养Wistar胎鼠神经干细胞,分6组干预：空白对照组,5,10,15,20 μmol/L 法舒地尔组,siRNA 沉默RhoA基因组。干预后第3天,采用RT-PCR,Western blot检测各组神经干细胞RhoA基因及蛋白的表达。应用MTT比色法观察神经干细胞增殖情况;采用流式细胞术测定神经干细胞周期分布的变化。 结果与结论：15,20 μmol/L 法舒地尔组、siRNA 沉默RhoA基因组神经干细胞RhoA基因及蛋白表达量较5,10 μmol/L 法舒地尔组、空白对照组明显降低(P< 0.05),细胞的生长速度较5,10 μmol/L 法舒地尔组、空白对照组明显增快(P < 0.05),细胞周期G0/G1期减少(P< 0.05),S期细胞数增多(P< 0.05)。当法舒地尔浓度增加到20 μmol/L时对细胞的作用并非随浓度的增加而增强,与15 μmol/L组的差异无显著性意义(P > 0.05)。15,20 μmol/L 法舒地尔组与siRNA 沉默RhoA基因组相比差异无显著性意义(P> 0.05)。说明Rho激酶抑制剂法舒地尔和RNAi介导的RhoA基因沉默在体外均能促进神经干细胞增殖,法舒地尔最佳作用浓度为15 μmol/L。     

碱性成纤维细胞生长因子基因转染对人牙周韧带细胞的作用

背景：主要来源于因正畸或阻生拔除的健康牙培养而成的人牙周韧带细胞已成为牙周组织工程理想的种子细胞来源之一。 目的：了解采用重组腺相关病毒作为载体介导碱性成纤维细胞生长因子基因转染对体外培养的人牙周韧带细胞增殖及细胞周期的影响。 方法：体外培养人牙周韧带细胞, 经重组腺相关病毒作为载体介导碱性成纤维细胞生长因子基因转染,分为3组：对照组、空载病毒组、碱性成纤维细胞生长因子转染组。用RT-PCR,Western blot检测人牙周韧带细胞在转染前后碱性成纤维细胞生长因子基因和蛋白的表达。应用细胞生长曲线、四甲基偶氮唑蓝比色法观察细胞生长的优化作用;采用流式细胞术测定细胞周期分布的变化。 结果与结论：对照组、空载病毒组未检测到碱性成纤维细胞生长因子mRNA和蛋白表达;碱性成纤维细胞生长因子转染组碱性成纤维细胞生长因子mRNA和蛋白水平均有表达,细胞的生长速度明显增快,细胞周期G₀/G₁期减少,S期细胞数增多。各组间比较差异有显著性意义(P < 0.05)。     

构建人端粒酶催化亚单位基因慢病毒表达载体转染人骨髓基质细胞

背景：骨髓基质细胞不表达端粒酶,因而在体外传代扩增过程中端粒长度逐渐缩短,导致细胞衰老,这是限制其用于细胞治疗应用的一个重要因素。 目的：构建人端粒酶催化亚单位基因慢病毒表达载体,探讨以慢病毒介导的人端粒酶催化亚单位基因修饰人骨髓基质细胞的可行性。 方法：以pReceiver-M02-hTERT质粒为模板PCR扩增获得目的基因。用BP重组系统将目的片段重组到载体pDONR221上。然后使用LR重组系统将目的序列重组到载体pLenti6.3/V5-DEST上。将重组载体与包装质粒充分混合,利用脂质体共转染293FT细胞获得慢病毒颗粒。 结果与结论：成功构建人端粒酶催化亚单位慢病毒表达载体,病毒的平均物理滴度为1.07×10¹² LP/L。以之转染人骨髓基质细胞,目的基因表达水平有显著提升,细胞正确表达人端粒酶反转录酶蛋白。说明以慢病毒介导的人端粒酶催化亚单位基因修饰人骨髓基质细胞能强化细胞表达人端粒酶催化亚单位。     

端粒酶逆转录酶基因修饰人骨髓间质干细胞的实验研究

目的： 观察外源性hTERT基因的异位表达对人骨髓间质干细胞（MSCs）端粒酶活性及细胞生命周期的影响。方法： 将携带有增强型绿色荧光蛋白（EGFP）报告基因和人端粒酶逆转录酶（hTERT）目的基因的质粒pEGFP-hTERT通过脂质体转染法转入人骨髓MSCs中，并用G418筛选法进行抗性克隆的筛选与扩增。通过RT-PCR和PCR-ELISA对转染前后hTERT mRNA的表达情况及其对端粒酶活性的影响进行检测。将转染细胞在EGF和bFGF的联合诱导下向神经元样细胞定向诱导分化，并用RT-PCR进行鉴定。结果： 未转染的人骨髓MSCs hTERT mRNA表达阴性，且端粒酶呈阴性而转染hTERT基因的人骨髓MSCs hTERTmRNA表达阳性，且端粒酶呈阳性。转染hTERT基因的人骨髓MSCs在体外已连续传到第35代，而未转染的人骨髓MSCs传到第20-25代左右已衰老死亡。 转染hTERT基因的人骨髓MSCs经EGF和bFGF的联合诱导后，较多细胞出现了典型的神经元样形态，且经RT-PCR检测表明，神经元特征性蛋白微管相关蛋白（MAP₂）和神经丝亚单位M（NF-M）表达增强。结论： 外源性hTERT基因可以在人骨髓MSCs中获得异位表达，并能诱导人骨髓MSCs的端粒酶活性。外源性hTERT基因的异位表达不仅可以使人骨髓间质干细胞的寿命明显延长而且不影响其维持干细胞的多向分化潜能特性。     

反义hTERT/PTEN联合基因治疗恶性胶质瘤的体内外研究

目的探讨腺病毒介导的反义hTERT和野生型PTEN联合基因转染对恶性胶质瘤细胞生长的影响。方法用细菌内高效同源重组系统构建的含有hTERT反义序列及野生型PTEN的腺病毒在体内外单独或联合转染恶性胶质瘤细胞系U251，检测肿瘤细胞生长情况、端粒酶活性、蛋白表达、细胞周期变化等。结果在体外试验中单独或联合转染都能明显抑制肿瘤细胞的生长，以联合转染效果最明显，转染后第6天联合转染组的细胞生存率为37．6％，端粒酶活性水平和hTERT蛋白表达水平明显下降，分别为28．8TPG、0．2106，PIEN蛋白表达水平上升为0．9630；在体内试验中肿瘤生长也明显减慢。结论腺病毒介导的反义hTERT和野生型PTEN联合转染能明显抑制恶性胶质瘤细胞的生长。     

反义hTERT基因对白血病细胞端粒酶表达及活性的抑制作用

目的探讨反义hTERT基因体外对白血病细胞端粒酶基因表达及其活性的抑制作用。方法采用基因重组技术设计并构建了针对端粒酶活性蛋白催化亚单位mRNA的5’端序列的反义pcDNA-hTERT真核表达载体,通过SuperFect(QIAGEN)将其瞬时转染人早幼粒白血病细胞株Hk及人红白血病细胞株K562,并运用流式细胞术测定其细胞凋亡与细胞周期的变化,同时运用实时荧光定量逆转录-聚合酶链反应方法对其端粒酶蛋白催化亚单位基因的表达水平进行了检测,端粒酶活性的检测则采用了非放射性TRAP-银染法。结果成功地构建了反义pcDNA-hTERT真核表达载体,并将其转染至K562和HL60白血病细胞株。结果与空载体组、空白组相比,反义pcDNA-hTERT组体外显示出明显有效地抑制端粒酶的基因表达及其活性的作用;在细胞凋亡与细胞周期方面,反义组能引起细胞周期左移,增殖分裂能力降低,同时伴有细胞凋亡数的增加。结论研究构建的反义hTERT基因体外确实能明显有效地下调白血病细胞端粒酶的基因表达及其活性,在抗肿瘤基因治疗中具有特异的靶向性和潜在应用的广谱性。