二甲双胍调控自噬促PD神经细胞修复的研究

目的 观察二甲双胍(metformin)对1-甲基-4-苯基吡啶离子(1-methyl-4-phenylpyridine ion,MPP+)诱导损伤的神经细胞SH-sy5y的保护作用,探索二甲双胍治疗帕金森病(Parkinson's disease,PD)的作用机理.方法 采用(MPP+)诱导PD细胞模型24h,分组为Control组、MPP+组(800mol)、Metformin组(二甲双胍预保护2h,1mM),以CCK-8检查细胞的存活率,检测乳酸脱氢酶(lactate dehydrogenase,LDH)释放情况,细胞免疫荧光观察细胞形态,流式仪检测细胞凋亡情况,Western blot检测各组细胞凋亡相关蛋白Bcl-2,Bax表达以及自噬相关蛋白LC3,p62表达情况.结果 与MPP+组相比,Metfrmin组可促进细胞的存活,减少细胞膜破坏,与MPP+组相比,Metformin组Bcl-2水平升高,Bax表达下降,同时LC3含量升高,p62表达下降.结论 二甲双胍能够减轻MPP+诱导的PD模型细胞的损伤,其机制可能与诱导自噬及抑制细胞凋亡有关.     

美满霉素对MPP+诱导的PC12细胞凋亡的保护作用

目的在离体细胞培养中探讨美满霉素(Minocycline,MC)对1-甲基-4-苯基吡啶离子(MPP )诱导的帕金森病细胞凋亡模型的保护作用.方法将MC或MPP 加入培养的PC12细胞中,建立多巴胺神经元凋亡模型,四甲基偶氮唑盐法(MTT法)检测细胞代谢活性,电泳法检测细胞凋亡,流式细胞术检测细胞凋亡率.结果MPP 浓度为10μmol/L时建立多胺神经元凋亡模型;MC 100 μmol/L预处理可明显升高MPP 处理的PC12细胞活性;MC MPP 组细胞凋亡率显著低于MPP 组(P＜0.01),但仍明显高于阴性对照组(P＜0.05).结论MC对MPP 诱导的细胞凋亡有一定的保护作用.     

H2O2预处理通过上调14-3-3蛋白表达减轻MPP+对PC12细胞的毒性作用

目的 探讨H2O2预处理(HPP)1-甲基4-苯基吡啶离子(MPP )诱导PC12细胞损伤的保护作用和可能的机制.方法 采用4甲基偶氮唑盐法(MTT法)、自动生化分析仪、4,6-二氨基-2-苯基吲哚(DAPI)染色法及免疫印迹(western blot)技术分别检测细胞活力、乳酸脱氢酶(LDH)活性、细胞凋亡及14-3-3蛋白的表达.结果 H2O2预处理能够上调14-3-3蛋白表达,增加PC12细胞活力(MPP 组52.46%±6.15%,HPP MPP 组83.78%±5.84%),抑制LDH的活性[MPP 组(37.31±3.99)U/L,HPP MPP 组(12.49±2.26)U/L];抑制细胞凋亡(MPP 48.72%±6.68%,HPP MPP 组17.56%±5.21%).结论 H202预处理能减轻MPP 对PCI2细胞的毒性损伤作用,这种保护作用是通过上调14-3-3蛋白的表达实现的.     

促红细胞生成素对1-甲基-4-苯基吡啶损伤的PC12细胞的保护作用(英文)

目的探讨促红细胞生成素(erythropoietin,EPO)对1-甲基-4-苯基吡啶离子(MPP+)诱导的PC12细胞变性损伤的保护作用及机制。方法用MPP+处理PC12细胞制作帕金森病细胞模型,采用四甲基偶氮唑蓝法检测暴露于不同浓度EPO后细胞的活性;流式细胞术与DNA断端原位标记法(terminal deoxynucleotidyl transferase dUTPnick end labeling, TUNEL)检测各组的细胞凋亡率;免疫印迹法检测不同处理组PC12细胞Bcl-2和Bax的表达,并采用荧光法观察不同处理组PC12细胞活性氧(reactive oxygen species,ROS)与线粒体膜电位水平以及caspase-3活性的变化。结果 MPP+可以使PC12细胞存活率下降,凋亡率增高;同时PC12细胞内ROS增多,线粒体膜电位下降。MPP+还可以明显地提高Bax/Bcl-2比值并激活caspase-3。而EPO可以抑制这些由MPP+引发的改变,并在1 U/mL时发挥最大保护作用。结论 EPO可抑制MPP+诱导的PC12细胞死亡,其作用机制可能与其自身抗氧化和抗凋亡的特性有关。     

14-3-3蛋白过表达减轻1-甲基-4-苯基吡啶离子对PC12细胞的毒性(英文)

目的研究14-3-3蛋白过表达对1-甲基-4苯基吡啶离子(MPP )诱导的PC12细胞死亡的影响作用及其可能的机制。方法构建pcDNA3.1( )-14-3-3 真核表达质粒,用脂质体2000转染PC12细胞;Western blot技术检测PC12细胞中14-3-3蛋白、Bcl-2 蛋白, 和BAD蛋白的表达;然后分别用MTT法、酶标仪及流式细胞仪检测PC12细胞的活力、caspase的活性及PC12细胞的凋亡率。结果(1)将pcDNA3.1( )-14-3-3质粒转染PC12细胞3周后,14-3-3蛋白的表达显著增加;(2)MPP 诱导PC12细胞存活率的下降是剂量依赖性的,当MPP 的浓度达100 μmol/L时,PC12细胞的存活率丧失约50%;(3)caspase 的活性随着MPP 浓度的增加而增高,当MPP 浓度到达100 μmol/L时caspase的活性也到达最大值,而当MPP 浓度超过100 μmol/L时,caspase的活性急剧下降;(4)用100 μmol/L 的MPP 处理PC12细胞24 h后,PC12细胞的凋亡率为26.5%,14-3-3蛋白的过表达使PC12细胞的凋亡率下降到8.6%;(5)用100 μmol/L MPP 处理PC12细胞后,Bcl-2蛋白的表达趋于下调而BAD蛋白的表达上调,14-3-3蛋白的过表达能显著的增加Bcl-2蛋白的表达而使BAD蛋白的表达下调。结论14-3-3蛋白过表达通过上调Bcl-2蛋白的表达并下调BAD蛋白的表达,减少了MPP 诱导的PC12细胞的凋亡,从而发挥对PC12细胞的保护作用。这些结果可能为PD的治疗提供新的药物靶点。     

大鼠脑创伤后海马CA3区细胞凋亡及相关基因表达研究

目的研究弥漫性脑损伤后不同时间,大鼠海马CA3区细胞凋亡及相关基因Bcl-2、Bax和Caspase-3蛋白的表达情况,探讨脑创伤后神经细胞凋亡的分子生物学机制.方法应用流式细胞仪和免疫组化法,分别检测脑创伤后不同时间海马CA3区细胞凋亡率及Bcl-2,Bax和Caspase-3基因在蛋白质水平的表达情况.结果脑创伤后海马CA3区存在不同程度细胞凋亡,Bcl-2在脑损伤后表达下降,而Bax和Caspase-3在脑创伤后表达升高;Caspase-3表达的峰值时间(72 h)出现在Bax之后(48 h).结论弥漫性脑损伤后,大鼠海马CA3区存在细胞凋亡及Bcl-2,Bax和Caspase-3的表达变化.Bcl-2/Bax表达比值下降早于Caspase-3的上升,Bcl-2/Bax表达比值改变可能与Caspase-3活化有关,进而启动并加重脑损伤后神经细胞凋亡.     

14-3-3蛋白过表达减轻MPP+对PC12细胞的毒性损伤

目的 探讨14-3-3蛋白过表达对1-甲基-4-苯基吡啶离子(MPP+)诱导PC12细胞损伤的保护作用和可能的机制.方法 构建pcDNA3.1(+)-14-3-3真核表达质粒,转染PC12细胞,建立稳定过表达14-3-3蛋白细胞株;通过四甲基偶氮唑盐法(MTT法)、流式细胞术和酶标仪分别检测14-3-3蛋白过表达对MPP+诱导的PC12细胞存活力、凋亡率和SOD及谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)活性的影响.结果 14-3-3蛋白过表达显著增加PC12细胞SOD活性[质粒转染组(9.13±0.41)U/mg,MPP+组(6.45±0.52)U/mg]和GSH-Px活性[质粒转染组(89.66±3.42)μmol/mg,MPP+组(82.73±4.15)μmol/mg]、增强细胞活力[吸光度(A570):质粒转染组0.78±0.06,MPP+组0.54±0.07]、抑制细胞的凋亡(质粒转染组11.87%±3.26%,MPP+组36.30%±2.39%).结论 14-3-3蛋白过表达对MPP+的毒性有保护作用,这是通过增加SOD和GSH-Px的活性,减少氧化应激实现的.     

莱菔硫烷拮抗PC12细胞氧化应激损伤的机制

目的 探讨莱菔硫烷对体外1-甲基-4-苯基吡啶离子(MPP+)诱导的PC12细胞氧化损伤模型是否具有保护作用及其机制.方法 以MPP+损伤PC12细胞制备氧化损伤模型.不同浓度的莱菔硫烷加入培养基观察各组细胞生长情况.后续实验分成4组:正常对照组(A)、莱菔硫烷组(B)、MPP+损伤组(C)、莱菔硫烷预处理+MPP+损伤组(D).通过MTT比色法检测细胞活力,观察不同浓度莱菔硫烷预处理PC12细胞活力变化及不同分组PC12细胞活力变化;流式细胞术检测不同分组PC12细胞中细胞凋亡率的变化;免疫印迹法测定不同分组PC12细胞内转录因子相关因子2(Nrf2)、血红素加氧酶1(HO-1)及醌还原氧化酶1(NQ01)蛋白的表达变化.结果 A组细胞存活率(98.70％)与MPP+(500μmol/L)组(58.16％)相比差异有统计学意义(F =21.83,P＜0.05),D组细胞存活率明显提高.C组细胞凋亡率升高,D组细胞与C组相比差异有统计学意义,莱菔硫烷预处理后细胞凋亡率明显减低.C组Nrf2、HO-1、NQ01蛋白表达下降,D组Nrf2、HO-1、NQ01蛋白表达升高.结论 莱菔硫烷对MPP+诱导的PC12细胞损伤具有保护作用,莱菔硫烷对MPP+诱导的PC12细胞损伤的保护作用可能通过激活Nrf2-抗氧化反应元件通路途径实现.     

黄连碱上调miR-146a-5p后通过PI3K/AKT通路减轻由MPP+诱导的帕金森病细胞模型损伤

目的探讨黄连碱对1-甲基-4-苯基吡啶离子(MPP+)诱导的帕金森病(PD)细胞损伤的影响及其机制。方法用0.3 mmol/L的MPP+处理SK-N-SH细胞作为PD细胞模型,记为MPP+组,以正常培养的细胞作为空白对照组。用浓度分别为10μmol/L、20μmol/L、40μmol/L的黄连碱预处理4h后再用0.3 mmol/L的MPP+处理作为不同浓度黄连碱处理组。将miR-con、miR-146a-5p转染至SK-N-SH细胞后再用0.3 mmol/L的MPP+处理记为MPP++miR-con组、MPP++miR-146a-5p组;将anti-miR-con、anti-miR-146a-5p转染至SK-N-SH细胞后用20μmol/L的黄连碱预处理4h及0.3 mmol/L的MPP+处理记为MPP++Cop+anti-miR-con组、MPP++Cop+anti-miR-146a-5p组。四甲基偶氮唑盐比色法(MTT)检测细胞存活率;Western blotting实验检测活化的半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3(caspase-3)、细胞周期蛋白D1(Cyclin D1)、磷酸化蛋白激酶B(p-AKT)、磷酸化磷脂酰肌醇3激酶(p-PI3K)蛋白表达水平;流式细胞术检测细胞凋亡;实时荧光定量PCR(RT-qPCR)检测miR-146a-5p表达水平。结果与空白对照组比较,MPP+处理后SK-N-SH细胞存活率显著降低,活化caspase-3表达水平显著升高,细胞凋亡率显著升高,CyclinD1、miR-146a-5p表达水平显著降低,差异均有统计学意义(P<0.05)。黄连碱处理及miR-146a-5p过表达后MPP+诱导的SK-N-SH细胞中细胞存活率显著升高,活化caspase-3表达水平显著降低,细胞凋亡率显著降低,CyclinD1、miR-146a-5p表达水平显著升高,差异均有统计学意义(P<0.05)。低表达miR-146a-5p逆转了黄连碱对SK-N-SH细胞增殖促进和凋亡抑制的作用。黄连碱处理后MPP+诱导的SK-N-SH细胞中p-AKT、p-PI3K表达水平显著升高,低表达miR-146a-5p逆转了黄连碱对p-AKT、p-PI3K表达水平的促进作用。结论黄连碱可促进细胞存活,抑制MPP+诱导的细胞凋亡,其机制可能与miR-146a-5p及PI3K/AKT信号通路有关。     

IGF-1对MPP~+诱导PC12细胞凋亡的保护作用及其机制

目的探讨胰岛素样生长因子-1(IGF-1)对1-甲基-4-苯基吡啶离子(MPP+)诱导的PC12细胞凋亡的保护作用及机制。方法以250μmol/L的MPP+损伤PC12细胞作为帕金森病(PD)细胞模型,实验分组如下:空白对照组、MPP+组,IGF-1+MPP+组和抑制剂组。抑制剂组再分为:(1)空白对照组;(2)MPP+组;(3)IGF-1组;(4)IGF-1+MPP+组;(5)MPP++LiCL组;(6)IGF-1+MPP++LiCL组。孵育24h后采用AO-EB法检测细胞凋亡率;采用MTT法检测细胞存活率;孵育4h之后采用Western Blot免疫印迹法检测糖原合成酶激酶-3β(GSK-3β)、phospho-GSK-3β蛋白表达。结果(1)100nmol的IGF-1对MPP+处理的PC12细胞有保护作用,减少了MPP+所致的细胞凋亡。(2)LiCL起到了与IGF-1相似的对PC12细胞的保护作用。(3)总GSK-3β含量各处理组没有太大改变,但磷酸化的GSK-3β含量IGF-1组高于与MPP+单独处理组。结论IGF-1可减少MPP+所致的细胞凋亡,其保护作用与上调磷酸化的GSK-3β的表达相关。