增殖型腺病毒载体介导mIL-12基因对胃癌细胞的杀伤作用

目的:观察增殖型腺病毒载体介导的mIL-12基因对胃癌细胞的杀伤作用.方法:利用携带mIL-12基因的增殖型腺病毒转染胃癌细胞株SGC-7901,通过病毒增殖实验、细胞病理效应、酶链免疫反应等分别观察病毒复制能力、病毒对胃癌细胞的杀伤作用及mIL-12表达水平.结果:携带mIL-12基因的增殖型腺病毒转染胃癌细胞株SGC-7901具有肿瘤增殖型腺病毒ONYX-015的相似作用,可在肿瘤细胞内复制、增殖并杀死肿瘤细胞,而并不能在正常细胞内复制及增殖.该病毒在肿瘤细胞内的增殖能力是传统载体的近千倍.该载体携带的mIL-12基因的表达量明显高于传统基因治疗的腺病毒载体体系,是传统基因治疗表达量的百倍.结论:CNHK200-mIL-12能在胃癌细胞中增殖并杀死胃癌细胞,并提高目的基因的表达水平,可能为胃癌治疗提供一新途径.     

在结肠癌细胞内高效表达内皮抑素的增殖型腺病毒载体的构建与鉴定

目的:构建携带内皮抑素基因的增殖型腺病毒载体,寻找结肠癌的有效治疗方法.方法:通过RT-PCR克隆内皮抑素基因,293细胞内分别重组携带内皮抑素基因的增殖型(CNHK200-hE)和增殖缺陷型(Ad-hE)腺病毒,分别体外感染结肠癌细胞HT-29后比较两者在细胞病理效应、病毒增殖和内皮抑素表达量方面的差异.结果:CNHK200-hE感染结肠癌细胞96 h后可增殖2 000多倍;感染后7 d肿瘤细胞死亡率达96.2%,而对正常肝细胞基本无杀伤作用;随着感染时间的延长,肿瘤细胞培养上清液中内皮抑素表达量不断增加,第5天达1 090 ng/ml,显著高于Ad-hE感染组(P<0.01).结论:携带内皮抑素基因的增殖型腺病毒CNHK200-hE具有高效表达内皮抑素和在结肠癌细胞内增殖并杀灭肿瘤细胞的作用.     

基因-病毒治疗系统CNHK300-murine endostatin治疗肝癌的实验研究

目的　探讨一种新的基因 病毒治疗系统CNHK30 0 murineendostatin(简称CNHK30 0 mE)对肝癌的治疗作用。方法　利用基因重组技术构建一种用人端粒酶逆转录酶 (hTERT)启动子控制腺病毒E1A基因表达并携带内皮抑素基因的基因 病毒治疗系统 ;通过 5 0 %组织培养感染剂量 (TCID5 0 )方法和细胞活性检测法四氮唑盐比色试验 (MTT法 )观察CNHK30 0 mE在 2种肝癌细胞株 (HepGII及Hep3B)及 1株正常的成纤维细胞株 (MRC 5 )中的病毒增殖能力和对细胞的杀灭能力 ;通过肝癌SMMC772 1细胞裸鼠皮下移植瘤模型观察该病毒对肝癌生长和对肿瘤血管生成的抑制作用 ;利用Western印迹法和酶联免疫吸附实验 (ELISA)法检测内皮抑素基因在体内和体外的表达。结果分别感染肝癌细胞株和正常细胞株 96h后病毒的增殖倍数相差 32 96倍 ,其达到半数杀伤量 (ED50 )时的感染复数 (MOI)值相差 2 5倍 ,差异有显著意义 ,且两者均明显优于ONYX 0 15 ;CNHK30 0 mE能明显抑制肝癌皮下移植瘤内血管的生成 ,对肿瘤生长的抑制作用与携带同一治疗基因的非增殖型腺病毒和不携带治疗基因的增殖型腺病毒ONYX 0 15相比均增强 (P均 <0 0 1) ;其所介导的内皮抑素基因在体内和体外的表达量均与携带该基因的非增殖型腺病毒载体相比均增高 (P <0 0 5和     

端粒酶逆转录酶启动子调控的肿瘤增殖腺病毒CNHK300对肝癌细胞的杀伤作用

目的观察端粒酶逆转录酶(hTERT)启动子调控的肿瘤增殖腺病毒CNHK300对肝癌细胞的杀伤作用。方法采用Western印迹检测了腺病毒E1A在细胞中的表达;通过病毒增殖实验和细胞生长抑制实验,验证CNHK300选择性复制和杀伤能力,并与ONYX-015(E1B55000蛋白缺失的2型和5型嵌和型腺病毒)和wtAd5(野生型腺病毒)进行比较;用携带绿色荧光蛋白的CNHK300-EGFP感染BJ和Hep3B,直观的观察其增殖过程。结果CNHK300病毒48h在Hep3B和HepGⅡ中的增殖倍数分别为40625和65326倍,与wtAd5增殖能力相近,较ONYX-015强几倍至十几倍。在BJ正常成纤维细胞中CNHK300病毒增殖能力减弱,CNHK300病毒48h增殖倍数为180倍,而wtAd5增殖能力仍可高达4000倍。CNHK300在MOI 0．5集落形成单位／细胞以下就可以有效地杀伤肝癌细胞,MOI 0．002集落形成单位／细胞时就可以杀伤半数Uep3B细胞,较ONYX-015具有更强的肿瘤杀伤能力。CNHK300对正常成纤维细胞的杀伤力明显弱于wtAd5,CNHK300在MOI100集落形成单位／细胞时BJ细胞存活率近50％。结论肿瘤选择性增殖腺病毒CNHK300可选择性地在端粒酶阳性的肝癌细胞中复制,并产生溶瘤作用,在正常细胞中复制能力和杀伤能力明显减弱,且无论选择性和杀伤能力均优于ONYX-015。     

溶瘤病毒CNHK300-mIFN-γ表达mIFN-γ及体外胃肠道肿瘤杀伤实验

目的研究携带鼠干扰素-γ(mIFN-γ)基因的溶瘤病毒CNHK300-mIFN-γ(简称CNHK300-Mγ)对胃肠道肿瘤细胞的体外杀伤作用和mIFN-γ的表达情况。方法采用CNHK300-Mγ、CNHK300、ONYX-015和AdEasy-mIFN-γ(简称AdEasy-Mγ)感染胃癌细胞株SGC-7901、大肠癌细胞株HT-29和正常成纤维细胞株MRC-5,通过TCID50法、CPE和四唑盐比色试验(MTT)检测CNHK300-Mγ、CNHK300和ONYX-015在上述肿瘤细胞和正常细胞中的增殖能力和杀伤作用,通过酶联免疫吸附试验(ELISA)检测CNHK300-Mγ和AdEasy-Mγ在上述肿瘤细胞和正常细胞中不同时相的mIFN-γ表达量。结果 CNHK300-Mγ具有类似于CNHK300的肿瘤细胞选择增殖性特性,能在胃肠道肿瘤细胞中大量增殖并杀灭肿瘤细胞,均强于ONYX-015,而在正常细胞中增殖和杀伤作用均较弱,类似于ONYX-015。CNHK300-Mγ感染胃肠道肿瘤细胞后有大量的mIFN-γ表达,并随着感染时间延长表达量也相应上升,而AdEasy-Mγ感染后只有少量mIFN-γ的表达,而且感染的时间延长表达量变化也不大。结论 CNHK300-Mγ能选择性增殖、杀灭肿瘤细胞,同时大量表达具有抗肿瘤作用的治疗基因,发挥多重抗瘤作用,有良好的临床应用前景。     

Gene-viral vectors: a promising way to target tumor cells and express antican cer genes simultaneously

目的：研究一种结合肿瘤基因治疗与美丽治疗优势的新型肿瘤治疗载体系统,即基因-病毒载体系统。方法：利用病毒重组技术将抗癌基因插入肿瘤细胞特异性的增殖病毒基因组中,通过细胞病理作用、荧光显微镜、免疫酶链技术及电镜等技术分别观察病毒的杀伤效应、报告基因绿色荧光蛋白、抗癌基因小鼠白细胞介素12表达量及病毒复制情况。结果：构建了一种新型基因-病毒载体系统,该载体系统腺病毒E1b-55kDa蛋白缺失,保留了腺病毒E1a蛋白。该载体系统具有肿瘤增殖病毒ONYX-015相似功能,即它可在肿瘤细胞内复制及增殖,而在正常细胞内不能复制及增殖,从而特异性杀灭肿瘤细胞。它还具有更大的优势,即该载体系统可携带各种抗癌基因以进一步提高抗肿瘤的疗效。应用该载体系统携带该报告基因绿色荧光蛋白可使绿色荧光蛋白在肿瘤细胞内高效表达,其表达量明显高于传统基因治疗的腺病毒载体系,而在正常细胞内低表达,与传统腺病毒载体系统相似或更低。应用该载体系统携带抗癌基因小鼠白细胞介素12,也产生类似结果,并在电镜中证实该载体系统携带抗癌基因小鼠白细胞介素12可在肿瘤细胞株中复制及增殖。结论：基因-病毒载体是将抗癌基因插入肿瘤增殖病毒基因组,通过肿瘤增殖病毒在肿瘤细胞内特异性复制及增殖,从而数百倍乃至上万倍提高抗癌基因的表达量。它充分利用了肿瘤基因治疗与病毒治疗优势,进一步提高抗肿瘤的疗效,克服了传统基因治疗转染率低、表达量少及靶向性弱等缺点及病毒治疗的杀伤力低的缺点。它将成为肿瘤治疗最有希望的治疗方案之一。     

携带IL-24的溶瘤腺病毒作用于乳腺癌的体外实验研究

目的 构建携带IL-24基因的溶瘤腺病毒CNHK600-IL-24,评估CNHK600-IL-24在体外对乳腺癌细胞的杀伤能力.方法 将IL-24基因插入腺病毒穿梭载体SG502-ΔCR2,与5型腺病毒骨架载体pPE3共转染至人胚肾293细胞,获得溶瘤腺病毒CNHK600-IL-24.荧光显微镜观测及病毒体外增殖实验测...     

基因病毒治疗系统CNHK300-mIFN-γ治疗肝癌的实验研究

目的 比较基因病毒治疗系统CNHK300-mIFN-γ(以下简称CNHK300-Mγ)与单纯病毒治疗(CNHK300)或基因治疗(AdEasy-mIFN-γ,以下简称AdEasy-Mγ)对裸鼠移植瘤的抑瘤差异.方法 观察CNHK300-Mγ、CNHK300和AdEasy-Mγ在裸鼠肝癌SMMC-7721动物模型中的抑瘤差异,并用ELISA 法检测血清中mIFN-γ的表达量,HE染色观察肿瘤坏死情况,免疫组织化学染色观察肿瘤内腺病毒外壳蛋白表达情况和肿瘤内微血管生成情况.结果 CNHK300-Mγ具有明显的肿瘤生长抑制作用,与CNHK300、AdEasy-Mγ和对照组的差异均有统计学意义(P<0.05);CNHK300-Mγ组中HE染色肿瘤内见大片坏死,免疫组织化学染色肿瘤内见大量腺病毒外壳蛋白,肿瘤微血管生长明显受抑制,与CNHK300、AdEasy-Mγ和对照组的差异均有统计学意义(P<0.01).结论 基因病毒治疗系统对肿瘤细胞的杀伤能力提高,CNHK300-Mγ能明显抑制肿瘤生长,具有良好的临床应用前景.     

基因-病毒载体的研制及其抗肿瘤作用的初步研究

目的：研究一种结合肿瘤基因治疗与病毒治疗优势的新型肿瘤治疗载体系统,即基因－病毒载体系统。方法：利用病毒重组技术将抗癌基因插入肿瘤细胞特异性的增殖病毒的病毒基因组中,通过细胞病理作用、荧光显微镜、免疫酶链技术及电镜等技术分别观察病毒的杀伤效应、报告基因绿色荧光蛋白、抗癌基因小鼠白细胞介素12表达量及病毒复制情况。结果构建了一种新型基因－病毒载体系统,该载体系统腺病毒E1b55000蛋白缺失,保留了腺病毒E1a蛋白。该载体系统具有肿瘤增殖病毒ONYX－015的相似功能,即它可在肿瘤细胞内复制及增殖,而在正常细胞内不能复制及增殖,从而特异性杀灭肿瘤细胞。该载体系统还可携带各种抗癌基因以进一步提高抗肿瘤的疗效。应该该载体系统携带该报告基因荧光蛋白可使绿色荧光蛋白在肿瘤细胞内高效表达,其表达量明显高于传统基因治疗的腺病毒载体系,而在正常细胞内低表达,表达量与传统腺病毒载体系统相似或更低。应用该载体系统携带抗癌基因小鼠白细胞介素12,也产生类似结果。电镜也证实该载体系统携带抗肿瘤基因小鼠白细胞介素12可在肿瘤细胞株中复制及增殖。结论：基因－病毒载体将抗癌基因插入肿瘤增殖病毒基因组,可数百倍乃至上万部提高抗癌基因的表达量,进一步提高抗肿瘤的疗效。     

癌症的基因-病毒靶向治疗

基因治疗最早要追溯到1990年,Anderson 用ADA基因治疗由ADA基因缺乏而引起的一种严重免疫综合缺乏症(SCID).至今19年多,基因治疗方案有1000多种,其中63%～67%用于治疗肿瘤,但无突破.溶瘤病毒是能特异地靶向肿瘤并在其中复制的病毒,并最后将肿瘤裂解,因此而得名.溶瘤病毒ONYX-015与化疗药物合用,在治疗肿瘤的Ⅱ期临床研究中虽曾达到63%疗效,但单用溶瘤病毒ONYX-015治疗肿瘤,只有15%～20%疗效,故它虽曾进入Ⅲ期临床,但最后还是未能继续,故也没有重大突破.     

携带mIL—12基因的增殖腺病毒在鼻咽癌细胞中增殖及mIL—12高效表达

OBJECTIVE: To enhance the therapeutic effects on nasopharyngeal carcinoma by combining treatment with selectively replicating adenovirus and IL12. METHODS: Replicating adenovirus with mouse IL12 gene insert (CNHK200-mIL12) was constructed to transfect nasopharyngeal carcinoma cell lines CNE3 and 915. Adenovirus hexon was detected by immunohistochemical staining and flow cytometry (FCM), and mIL12 expression examined by enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA). The replication rates of CNHK200-mIL12 and dl1520 was determined by 50% tissue culture infectious dose (TCID50). RESULTS: Twenty-four hours after transfection with CNHK200-mIL12, most of cells were positive for adenovirus hexon and FCM demonstrated increased positivity rates of 39% and 4% among CNE3 and 915 cells respectively. It was observed that CNHK200-mIL12 replication increased by 1 000 folds with mIL12 expression level reaching as high as 84.5+/-4.6 ng in CNE3 cells and 75.6+/-3.4 ng in 915 cells as determined 72 h after transfection with 1x10(5) PFU CNHK200-mIL12 into 1x10(4) cells. CONCLUSION: CNHK200-mIL12 can replicate in vitro in nasopharyngeal carcinoma cells (dl1520 cells, for instance) with high mIL12 expression, which suggests that CNHK200-mIL12 may potentially be used to treat nasopharyngeal carcinoma.