p16基因转染对人胰腺癌细胞系生长抑制作用的研究

目的　探讨p16基因对人胰腺癌细胞系JF30 5的生长抑制作用。　方法　用脂质体介导法将外源野生型p16基因转染不表达p16的人胰腺癌细胞系JF30 5 ,对转染后细胞DNA、RNA和蛋白进行分析并观察其生物学特性变化。　结果　外源野生型p16基因已整合入细胞并获稳定表达 ,表达有外源p16基因的细胞生长速度及集落形成率均有部分抑制。细胞周期分析可见G1期增加 ,S期下降。电镜观察超微结构出现生长抑制特征。　结论　p16基因可作为胰腺癌基因治疗目的基因之一。     

细胞周期素D1反义cDNA治疗肝癌的研究

目的 通过基因反义封闭技术抑制细胞周期素D1（CydinD1）的表达，研究其对肝癌细胞增殖以及成瘤性的影响。方法 以肝癌HepG2细胞株为研究对象，通过转染可表达CyclinD1反义互补脱氧核苷酸（AScDNA）的质粒后，观察CyclinD1反义cDNA对肝癌细胞CyclinD1基因表达、体外增殖活性及裸鼠体内成瘤性的影响。结果 噻唑蓝（MTT）法检测细胞增殖活性显示转染表达反义CydinD1的质粒后，HepG2细胞的增殖受到抑制．抑制作用在48h左右最强；逆转录-聚合酶链反应（RT-PCR）检测显示CyclinD1 mRNA基因的表达明显被抑制；间接免疫荧光检测结果显示CyclinD1蛋白表达显著降低；流式细胞仪检测结果显示G0／G1期的细胞比例增高，G2＋M和S期的细胞比例下降，HepG2细胞周期在G1期被阻滞；裸鼠成瘤试验显示肝癌HepG2细胞的成瘤性受到明显抑制。结论 CyclinD1反义cDNA可以特异性的抑制肝癌HepG2细胞株CyclinD1蛋白的表达，从而调控细胞周期，抑制肝癌细胞增殖及体内成瘤性。CyclinD1反义cDNA对于肝细胞癌的生物治疗具有一定的应用前景。     

重组腺相关病毒介导抑癌基因联合诱导人肝癌细胞系凋亡与生长抑制研究

目的 观察腺相关病毒介导的抑癌基因p53,p16和p21联合治疗肝癌的可能性和效果。方法 用携带人野生型p53,p16和p21的腺相关病毒分别或联合转导人肝癌细胞系HLE，HepG2,QGY-7701,QGY-7703,BEL-7402,SMMC-7721，通过体外及裸鼠体内实验研究转基因的表达及对癌的促凋亡和生长抑制作用。结果 腺相关病毒介导的p53,p16及p21对人肝细胞肝癌细胞系均有明显的促凋亡作用，体外凋亡率约30％左右，体内生长抑制率30％－44％；联合感染肝癌细胞效果更明显，体外凋亡率达56％，体内癌生长抑制率65％。结论 腺相关病毒介导的外源抑癌基因p53，p16和p21不仅对多种肝癌细胞系均有诱导凋亡和抑制生长作用，联合应用治疗肝癌更具有明显的相互协同作用。进一步提高病毒滴度和纯度是腺相关病毒作为载体进行基因治疗的目标。     

p16基因对前列腺癌细胞的体外作用研究

目的：研究可控性表达的p16基因对前列腺癌细胞的生长抑制作用。方法：通过可诱导的真核表达载体pMDNA-3-p16将外源野生型p16基因转染至该基因表达功能丧失的人前列腺癌细胞PC3中,使用ZnSO4作为诱导物,观察p16基因的可控性表达及其对前列腺癌细胞生物学特性的影响。 结果：转染了野生型p16基因的人膀胱癌细胞PC3-pMDNA3-p16经ZnSO4诱导后,开放了p16基因的转录和翻译,p16蛋白得到高水平表达,细胞生长速度及集落形成率均有了部分抑制,细胞周期分析可见G1期增加,S期下降。结论：P16基因与前列腺癌的发生、发展有关,为用p16基因进行前列腺癌的基因治疗提供了实验依据。     

p16ink4a/hRb1对骨肉瘤细胞周期协同的调控作用

目的 观察外源性p16ink4a／hRb1基因联合导入骨肉瘤细胞后，对其细胞周期的协同调控作用。方法 利用本室构建的pIRES-p16ink4a-hRb1、pIRES-p16ink4a与pIRES-hRb1质粒，脂质体介导转染p16缺失，hRb1表达阳性的骨肉瘤细胞株MG63，G418筛选获得抗性克隆，通过逆转录-聚合酶链反应（RT-PCR）和Western blot半定量分析外源基因表达；SubG1法流式细胞术分析细胞周期特异性和凋亡率，噻唑蓝（MTT）比色法与细胞生长曲线观察细胞增殖情况。结果 外源基因在靶细胞mRNA和蛋白水平分别有独立表达。与对照组比，所有外源性基因导入组细胞周期均显著阻滞在G1期（P〈0．01）并存在凋亡，且双基因导入组凋亡率分别比单基因组高4．04和6．94倍（P〈0．01）；所有外源性基因导入组各时间点细胞生长抑制率均显著上升，且双基因导入组细胞高于单基因组（P〈0．01）。结论 p16ink4a／hRb1联合导入骨肉瘤细胞后，干扰了p16ink4a-CyclinD1／CDK-hRb1负反馈循环，比单基因导入更能抑制肿瘤细胞生长和杀灭肿瘤细胞。     

腺病毒介导的p16基因转染对膀胱癌细胞生长影响的研究

目的　探讨复制缺陷型腺病毒介导的 p16基因转染对人膀胱癌细胞生长的影响。 　方法　将 p16重组腺病毒 (Ad p16 )感染p16蛋白表达阴性的人膀胱移行细胞癌T2 4细胞株 ,Ad LacZ、X gal染色法检测重组腺病毒的转染效率 ;Westernblot法检测 p16蛋白的表达 ;MTT法及流式细胞术评估Ad p16对T2 4细胞增殖的影响。　结果　在感染复数 (MOI)为 5 0时 ,重组腺病毒对T2 4细胞的转染率达 97% ;此Ad p16在T2 4细胞中可获高效表达 ;与转染Ad LacZ组及未转染组相比 ,转染Ad p16组T2 4细胞生长受到明显抑制 (P <0 .0 5 ) ,细胞周期分析表明生长抑制主要发生在G1 S节点。　结论　腺病毒载体可有效地将外源 p16基因导入T2 4细胞 ;p16基因重组腺病毒载体转染能抑制T2 4细胞的生长。     

他克莫司在体外对肝癌细胞HepG2和HepG2.2.15增殖的影响

目的：研究他克莫司（tacrolimus ,FK506）在体外对肝癌肿瘤株HepG2和乙肝相关肝癌株HepG2.2.15增殖的影响。方法：体外培养肝癌细胞HepG2和HepG2.2.15,采用MTT法、流式细胞技术,分别检测细胞增殖、细胞周期、CyclinA。结果：FK506可以显著抑制HepG2和HepG2.2.15细胞增殖,其抑制增殖作用随剂量增加而增强;FK506诱导细胞产生G0/G1期阻滞,这种抑制作用有浓度依赖性;FK506对周期蛋白CyclinA表达的影响呈浓度负相关性,FK506浓度越高,周期蛋白CyclinA表达越少。结论：FK506可以抑制肝癌细胞HepG2和乙肝相关肝癌细胞HepG2.2.15的增殖,这种作用可能与诱导细胞周期阻滞有关。     

腺病毒介导MDA-7/IL-24选择性杀伤肝癌 细胞HepG2的研究

目的 ：观察MDA-7/IL-24基因对肝癌的选择性杀伤作用，为肝癌的基因治疗提供理论基础。 方法 ：将携带人MDA-7/IL-24基因的腺病毒Ad.mda-7感染人正常肝细胞L02和肝癌细胞HepG2;用RT-PCR法观察MDA-7/IL-24基因的表达;ELISA方法检测细胞培养上清液中MDA-7/IL-24蛋白的浓度;4甲基偶氮唑蓝染色法（MTT）及Hoechst染色观察MDA-7/IL-24对肝癌细胞的生长抑制和杀伤作用;Annexin-V和PI双染后流式细胞仪检测2种细胞的凋亡;用流式细胞仪检测细胞周期。 结果 ：复制缺陷型腺病毒能介导外源基因MDA-7/IL-24在肝癌细胞株HepG2和正常细胞L02中的高效表达;细胞培养上清液中有MDA-7/IL-24蛋白的表达; MDA-7/IL-24能明显抑制肝癌细胞生长并可促进肝癌细胞的凋亡;MDA-7/IL-24阻滞肝癌细胞于G2/M期，能选择性杀伤肝癌细胞而对正常的肝细胞无阻滞作用和毒性作用。结论 ：复制缺陷型重组腺病毒载体Ad.mda-7能介导MDA-7/IL-24基因在人肝癌细胞中高效表达，促使细胞增殖阻滞及诱导肿瘤细胞凋亡，选择性地杀伤肝癌细胞HepG2，而对正常肝细胞L02无任何毒性作用。     

人甲胎蛋白增强子驱动自杀基因靶向杀伤肝癌细胞的实验研究

目的 探讨人AFP增强子驱动的单纯疱疹病毒胸苷激酶(HSV-TK)/丙氧鸟苷自杀基因系统体内外靶向杀伤肝癌细胞的效应.方法 构建人AFP增强子驱动的pAFP-cDNA3.1-TK自杀基因真核表达质粒;利用脂质体将质粒转染入AFP阳性肝癌细胞株HcpG2和AFP阴性肝癌细胞株SMMC7721;采用RT-PCR和Western blot检测TK mRNA和蛋白表达;MTT检测细胞的存活率;观察丙氧鸟苷对肝癌细胞体外增殖、生长曲线和细胞凋亡的作用,以及丙氧鸟苷体内抑制肿瘤生长的效应.采用t检验分析相关数据.结果 成功构建pAFP-cDNA3.1-TK自杀基因真核表达质粒并转染入肝癌细胞;AFP阳性肝癌细胞株HepG2中能检测到TKmRNA和蛋白表达;丙氧鸟苷呈剂量和时间依赖性抑制转染后肝癌细胞株HepG2的生长并诱导其凋亡;AFP阴性肝癌细胞株SMMC7721中没有TKmRNA和蛋白表达,细胞增殖、生长曲线和凋亡均不受影响,两者比较,差异有统计学意义(t=2.58,2.73,3.12,P＜0.05).丙氧鸟苷可以特异性地抑制转染后肝癌细胞株HepG2治疗组中肿瘤的生长,肿瘤抑制率为46%,而在转染后肝癌细胞株SMMC7721治疗组中,对肿瘤生长无明显抑制作用,两者比较,差异有统计学意义(t=3.36,P＜0.05).结论 人AFP增强子驱动的HSV-TK/丙氧鸟苷自杀基因系统可以靶向杀伤AFP阳性肝癌细胞,抑制肿瘤生长.     

siRNA沉默乙型肝炎病毒表达对HepG2.2.15细胞生长的影响

目的探讨应用siRNA抑制乙型肝炎病毒表达对HepG2.2.15细胞生长的影响。方法我们将siRNA转入含HBV病毒基因的肝癌细胞中（HepG2.2.15）,测定上清中HBsAg表达及HBV DNA拷贝数;用MTT法评估其增殖能力。结果实验发现siRNA能有效减少HBsAg分泌和HBV DNA拷贝数,其中HBsAg抑制率最高至83.9%,HBV DNA拷贝数抑制率从最高至73.4%。MTT法发现抑制率最高的siRNA转染细胞后,第五天其增殖能力均较空白组明显减弱,而其他组与空白组无明显区别。结论siRNA能有效减少HBV复制及蛋白表达;抑制HBV表达后能抑制HepG2.2.15细胞的增殖能力。     

过表达的p27KIP1基因诱导HCC-9204细胞凋亡

目的：研究P27KIP1基因对肝癌细胞凋亡的潜在调节作用。方法：采用一种可诱导性真核表达载体pMD-neo，通过外加Zn离子诱导目的基因的表达，脂质体转染法将p27^KIP1全长cDNA转入肝癌细胞系HCC－9204中，通过免疫组化及RT－PCR检测p27^KIP1基因在蛋白质和mRNA水平的表达，流式细胞仪，TUNEL染色及透射电镜等方法观察目的基因对该细胞凋亡的影响，结果：转染P27KIP1的HCC－9204细胞在mRNA和蛋白质水平均有高水平P27KIP1的表达，P27KIP1的过表达使G1期前出现一个亚二倍体的凋亡峰，占20％，并且其凋亡指数也显著增加（P＜0．01），结论：P27KIP1基因能够诱导HCC－9204细胞凋亡。     

p27KIP1基因过表达诱导HCC-9204细胞在G1期停滞并导致细胞凋亡

目的：研究p27^KIPI基因对肝癌细胞的细胞周期和细胞凋亡的调节作用。方法：采用一种可诱导性真核表达载体pMD-neo，通过外加Zn^2 诱导目的基因的表达。脂质体转染法将p27^KIPI全长cDNA转入肝癌细胞系HCC-9204中，检测p27^KIPI基因的表达，对细胞增殖的作用及目的基因对细胞的细胞周期和细胞凋亡的影响。结果：免疫组织化学及RT-PCR显示转染的p27^KIPI基因有高水平的表达。在外加Zn^2 48h后细胞生长被抑制35%，G1期细胞数由35%增加到76%，P=0.000；凋亡指数显著增加（P=0.000）。结论：p27^KIPI基因能够使HCC-9204细胞的G1期延长并导致细胞凋亡。     

TRAIL的抗肝细胞癌作用研究

目的 探讨TRAIL对HCC的治疗作用。方法 用不同浓度TRAIL处理肝癌细胞株HepG2、SMMC7721，观察经药物处理前后肿瘤细胞的凋亡发生率。采用分子克隆技术构建了真核表达质粒pIRES-EGFP-TRAIL，转染肝癌细胞株HepG2、SMMC7721细胞，观察其疗效。体内实验建立裸鼠肝癌模型，观察TRAn。的抑癌作用。结果TRAR，(100ng／m1)处理24h，肝癌细胞凋亡发生率约10％，而Jurkat细胞凋亡率达70％以上，胆管癌细胞QBC939凋亡发生率约50％。真核表达质粒TRAIL体外转染肝癌细胞后对肝癌细胞的生长无显著性的抑制作用。体内直接瘤体注射pIRES-EGFP-TRAIL可有效的导入TRAIL基因并获得高表达，但对裸鼠肝癌无明显抑制作用。结论 肝细胞癌对TRAIL诱导的凋亡有耐药现象，提示HCC中存在抑制TRAIL诱导凋亡的因素，单一的TRAIL疗HCC疗效有限。     

nm23-H1抑制原发性肝癌细胞转移的初步机理研究

为了更深入阐明ｎｍ２３－Ｈ１抑制原发性肝癌转移的作用机理，观察ｎｍ２３－Ｈ１表达状况对肝癌细胞浸润相关因素的影响。本实验采用基因转染手段将外源ｎｍ２３－Ｈ１全长ｃＤＮＡ导入肝癌细胞并以此观察细胞体外浸润能力，细胞内游离Ｃａ＾２＋以及Ｎ－ｒａｓ基因ｍＲＮＡ表达的变化。     

组蛋白去乙酰化酶抑制剂曲古抑菌素A对肝癌细胞蛋白质差异表达谱的影响

目的 观察组蛋白去乙酰化酶(HDAC)抑制剂-曲古抑菌素A(TSA)对肝癌细胞(BEL-7402)蛋白质表达谱的影响.方法 采用150 g/LTSA处理BEL-7402细胞16hr为试验组,未处理的细胞为对照组,分别抽提其总蛋白质,蛋白定量恒定为200 mg.经第一向固相pH梯度等电聚焦电泳和第二向垂直平板SDS-PAGE,凝胶银染后获得二维凝胶图并扫描输入计算机进行软件分析.将三次重复实验所获得的二维凝胶图进行统计学分析.将差异表达的蛋白质斑点从银染后的二维凝胶中切下,进行质谱分析.结果 实验组BEL-7402细胞90%～95%的蛋白质表达与对照组一致,5%～10%的蛋白质为差异表达;通过质谱对差异点的鉴定,获得了16个差异表达蛋白质,包括:Triosephosphate isomerase、47-KDa heat shock protein、TRAF1,5(up)、annexin A1、Heat shock70 protein、prohibitin、thioredoxin peroxidase、DP-1等分子,这些蛋白质涉及基因表达调控、信号转导、细胞代谢、抑制细胞增殖等众多分子事件.结论 TSA能够通过影响蛋白质的差异表达影响BEL-7402肝癌细胞的生长和增殖.     

p16基因蛋白在肝癌中的表达及其意义

目的研究ｐ１６基因在肝细胞癌中的表达,探讨ｐ１６基因与肝细胞癌的关系。方法采用免疫组织化学方法,检测２５例肝细胞癌及癌旁组织中ｐ１６基因蛋白的表达。结果①ｐ１６蛋白在肝癌组织与癌周肝组织中的表达差异有显著意义（Ｐ＜０．０１）。②ｐ１６蛋白的表达与ＨＣＣ分化程度关系密切（Ｐ＜０．０５）,而与肿瘤大小、ＡＦＰ值无密切关系（Ｐ＞０．０５）。结论ｐ１６基因蛋白的表达与肝癌的恶性程度有非常密切的关系。ｐ１６基因在肝细胞癌变过程中起一定作用。     

雄激素和雌激素受体与食管癌的关系

目的 通过测定食管癌组织中雄激素受体（AR）和雌激素受体（ER）的含量,探讨食管癌生物学行为与AR和ER的关系。方法 应用放射配体结合分析法定量测定31例食管癌患者癌组织中AR和ER的含量,并与正常食管黏膜组织作对照。结果 与正常食管组织比较,食管癌组织中存在较多的AR和ER,其含量与患者性别、分化程度、浸润程度、有无淋巴结转移有关（P＜0．05）,而与患者年龄、肿瘤的部位无明显关系（P＞0．05）。结论 AR和ER含量与食管癌生物学行为关系密切,可能为食管癌的防治提供新的方法,并作为评价食管癌患者预后的新指标。     

外源性p16基因对食管癌患者癌细胞系的生长抑制作用

目的 观察外源性p16基因质粒导入食管癌患者食管鳞癌细胞系Ec109后的表达及其对Ec109细胞增殖生长状况的影响。方法 根据转染质粒的不同或是否行p16 cDNA质粒转染分为三组,每组分别为5个样本。PcDNA3-P16转染组（P16转染组）：采用脂质体（Lipofectamine）为载体,将PcDNA3-P16表达质粒寻入Ec109细胞;空载体转染组：用PcDNA－3－neo空载体以上述相同方法转染,作空白对照;未转染组：未用PcDNA3－P16质粒转染,作阴性对照。应用Northern斑点杂交、免疫组织化学、免疫荧光检测转化细胞的P16蛋白变化;流式细胞仪分析细胞周期变化,DNA片段化电泳检测细胞凋亡。结果 P16转染组外源性p16基因在Ec109细胞中表达后,细胞生长速度减慢,克隆形成能力下降,瞬时表达时有细胞凋亡发生,稳定表达后细胞存在G1期阻滞;空载体转染组和未转染组均未观察到以上结果。结论 脂质体介导的外源性p16基因转染对Ec109细胞有生长抑制作用,p16基因瞬时表达可诱导细胞凋亡。     

细胞周期蛋白A与p16蛋白在肝细胞癌发生中的协同作用

目的 探讨细胞周期蛋白A(Cyelin A)与p16蛋白在原发性肝细胞肝癌(HCC)中的表达、相互关系及其临床意义.方法 以Western blot检测35例肝细胞肝癌及相应的非癌组织中Cychn A与p16蛋白的表达;免疫组织化学检测Cyclin A的表达.结果 35例HCC中2l例(60.0%)有Cyclin A的过表达,22例(62.9%)出现p16蛋白表达缺失,Cyclin A蛋白过表达标本中19例(90.5%)存在p16蛋白表达缺失,无Cyclin A蛋白过表达的14例标本中3例(21.4%)出现p16蛋白表达缺失,两组间差异有统计学意义(P<0.05).结论 肝细胞癌中存在Cyclin A蛋白过表达及p16蛋白表达缺失,两者引起肝细胞周期失控并可能相互加强促进.