斑秃的遗传学研究进展

近年来斑秃的遗传学研究取得了较大进展，发现某些HLA-Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ类基因区与斑秃关系密切，并发现了一些非HLA区域可能成为斑秃的候选基因区域。尤其HLA-DR4、DR5、DR6、DR7及DQ3的Ⅱ类基因与斑秃相关联，而DQ*0301和DRB1*0401等位基因仅在全秃和普秃患中出现；Ⅲ类基因区的TNF-α基因多态性与斑秃的发病相关。     

EB病毒膜抗原BLLF1基因转基因小鼠的制备

将Epstein－Bars病毒（EBV）膜抗原（MA）BLLF1基因用显微注射法导入昆明种小鼠受精卵的雄性原核以制备转基因小鼠模型。共注射受精卵450枚,存活291枚,植入假孕母鼠的输卵管使之发育,产出仔鼠12只。注射后卵的存活率和仔鼠出生率为65％和4％。用PCR法分析显示5只有BLLF1基因整合,整合率为42％。结果表明携带BLLF1基因的转基因小鼠已经制备成功。该转基因小鼠可作为研究EB病毒致病机理,特别是与自身免疫病关系的动物模型。     

严密型四环素调控系统转基因首建鼠的建立

目的制备ApoE-rtTA-tTS转基因小鼠1，为严密型四环素调控系统的体内研究提供调控部分的转基因小鼠，以便与反应部分小鼠交配得到双转基因小鼠。方法重组构建含目的基因的质粒pApoE-rtTA-tTS，应用显微注射法将其注入母鼠的受精卵，再植入代母输卵管，出生小鼠经PCR初步筛选出阳性，再经Southern杂交对阳性小鼠基因组DNA标本进一步鉴定。结果产生了2只整合ApoE-rtTA-tTS基因的首建鼠。结论成功制备了ApoE-rtTA-tTS转基因小鼠，为下一步建立严密型四环素调控系统的双转基因小鼠模型奠定了基础。     

携带淀粉样前体蛋白瑞典型突变基因转基因小鼠的制备及体内表达研究

目的 建立携带人类淀粉样前体蛋白瑞典型突变（Swedish mutation of amyloid precursor protein,APPSWE)基因的转基因小鼠模型。方法 采用受精卵原核显微注射法，将人类APPSWE转基因导入C57及昆明种小鼠受精卵内，然后将注射后保持完整的受精卵移植到假孕母鼠的输卵管内，然后应用聚合酶链反应（polymerase chain reaction,PCR)、荧光原位杂交及逆转录PCR分析子代小鼠中外源基因的整合及表达情况。结果 注射后卵的存活率和幼子出现率分别为76.62%和10.38%；外源基因整合率为35.29%；共获得6只首建小鼠，已稳定传3代，PCR检测共55只阳性；提取阳性小鼠心、脑、肝、肾组织及骨骼肌以人类APPSWE基因外显子特异的引物进行逆转录PCR分析，结果发现其心、脑组织及骨骼肌中具有人类APPSWE基因的表达。结论 说明携带淀粉样前体蛋白瑞典型突变基因的转基因小鼠模型已制备成功。     

肝脏特异HPPCn转基因小鼠的建立及表型分析

目的建立高表达HPPCn转基因小鼠,为研究该基因在肝癌发生发展中的功能提供研究模型。方法显微注射外源基因pGEM-A1b/his-HPPCn至FVB/N小鼠原核,注射受精卵移植到假孕受体出生个体。PCR和Southern blot鉴定转基因小鼠基因型,Western blot和Realtime-PCR检测转基因阳性和阴性小鼠肝脏HPPCn蛋白表达情况,HE染色和透射电镜观察肝脏病理改变。结果经检测,显微注射共产生2只首建鼠,转入的重组HPPCn基因能在肝脏中特异表达,并能够稳定遗传。转基因小鼠肝脏内HPPCn含量明显增高。转基因后并未对小鼠造成不良影响。结论 HPPCn参与了肝癌发生发展的过程,其在体内的高水平表达,为在体内研究该基因的功能提供了工具。     

SV40T胃壁细胞定位表达转基因小鼠的建立

目的 构建胃壁细胞定位表达SV40T的真核表达载体并制备转基因小鼠动物模型,为研究胃癌发病机制提供动物模型.方法 从构建的胃壁细胞特异性表达载体pcDNA3.1(-)/HKSV中酶切回收3.8kb的基因片段H -K ATPase β promoter/SV40T,通过显微注射的方法制备转基因小鼠,PCR和Southern blotting检测阳性转基因小鼠并建系繁殖,RT-PCR检测基因的表达情况.结果 将422枚注射过的受精卵移植给16只假孕雌鼠,共生出77只仔鼠,移植成功率为18.2%.在出生的77只仔鼠中,2#、4#、8#、16#、24#、51#、57#、61#、68#、73#经PCR检测为阳性首建鼠.除68#不育外,其他9个品系首建鼠共生出99只F1代鼠.8#品系23只F1代尚未发现阳性鼠,另8个品系F1代经PCR和Southern blotting检测发现31只阳性鼠,阳性率为40.8%(31/76).RT-PCR检测F1代阳性鼠均仅在胃组织中有SV40T基因的表达,而在心、肝、肾、肺、食道、肠、骨骼肌等组织中均不表达.不育首建鼠处死解剖发现胃组织有肿瘤存在.结论 建立了胃壁细胞定位表达SV40T基因的转基因小鼠动物模型.     

MagA转基因小鼠模型的建立

目的建立MagA转基因小鼠,为活体MRI成像系统提供重要的实验动物模型。方法采用显微注射法．将MagA基因导入小鼠受精卵,再培育成转基因小鼠并繁殖传代。利用PCR方法鉴定转基因首建鼠及其子代基因型。结果酶切和DNA测序分析证实MagA基因准确克隆表达载体设计位点,目的基因序列与GenBank中MagA序列完全一致。通过PCR分析,进行转基因整合检测。目前转基因小鼠已稳定传代至第5代。结论MagA基因在转基因小鼠中整合,成功建立了MagA转基因小鼠。MagA转基因小鼠将成为MRI影像系统的重要实验动物模型。     

实时荧光定量PCR检测转基因小鼠外源基因拷贝数方法的建立和应用

目的建立实时荧光定量PCR方法检测CaMKⅡα-Cre转基因小鼠外源基因拷贝数的方法。方法以CaMKⅡα-Cre转基因首建鼠及其仔代阳性鼠为研究对象,利用绝对定量的实时荧光定量PCR法检测转基因小鼠的拷贝数,并筛选出纯合子小鼠再经遗传育种方法以确定为纯合子小鼠。结果绝对定量标准曲线公式为:△Ct=-2.402log5N(拷贝数)+8.654,相关系数为0.9999,扩增效率为95.4%。三只CaMKⅡα-Cre首建鼠的拷贝数分别为19、7、5;三个转基因小鼠品系均成功获得纯合子小鼠。结论成功建立了检测转基因小鼠外源基因拷贝数的实时荧光定量PCR方法,该方法可用于检测各种转基因小鼠中外源基因的拷贝数。     

人Man2c1转基因小鼠模型的建立

目的 为在体内研究MAN2C1的生物学意义而建立转hMan2c1基因的小鼠。方法 构建pIRKS2-EGFP-hMan2c1重组表达载体，经体外转染实验鉴定转染的基因能在COS-7细胞表达后，注射人ICR小鼠受精卵，以制备转基因小鼠。用基因组PCR鉴定目的基因在宿主基因组DNA的整合。用RT-PCR和Westernblot分析hMan2c1在转基因小鼠的表达。结果 在116只原代小鼠中，有7只hMan2c1基因组PCR阳性。在所检测的20只F1代小鼠中，有9只hMan2c1基因组PCR阳性。在所检测的21只F2代小鼠中，有16只基因组PCR阳性。用鼠尾组织RT-PCR和Western blot检测hMan2c1基因表达，确定基因组PCR阳性的7个系中有4个系阳性。结论 建立了4个稳定表达hMan2c1的转基因小鼠系，为深入研究MAN2C1的生物学意义打下了基础。     

慢病毒载体法制备荧光素酶转基因小鼠

目的基于慢病毒介导的转基因方法制备荧光素酶（Luc）转基因小鼠。方法制备携带Luc基因的慢病毒,将其注入小鼠单细胞受精卵卵周隙以感染受精卵,然后将胚胎移植进假孕母鼠体内以获得仔鼠,应用小动物活体成像仪及PCR等在蛋白和DNA水平上筛选和鉴定Luc转基因小鼠。结果移植慢病毒隙感染后的成活胚胎63枚。将其移植至3只假孕母鼠,其中2只怀孕,共生仔鼠11只;利用小动物活体成像仪检测Luc表达,在蛋白水平证实11只F0代中,3只（命名为S1、S2、S3）表达Luc;DNA水平检测证实,3只Luc阳性小鼠的基因组中整合有外源转基因Luc。此外,Luc转基因首建鼠基因组中整合的Luc转基因可稳定遗传至下一代,并能正常表达。Luc转基因小鼠主要脏器如睾丸、肾脏、胃、肠、肺、脑、胸腺、肝脏和心脏等均可见Luc信号,但不同脏器间Luc强度有差异。结论成功制备Luc报告基因转基因小鼠。     

四环素调控的PTA1/CD226转基因小鼠的初步建立

为研究小鼠PTA1分子在体内的功能,建立四环素调控的小鼠PTA1/CD226转基因小鼠,我们构建了pBI-5-mPTA1载体,显微注射入B6D1F1受精卵,使用PCR检测新生小鼠基因组DNA中的PTA1与荧光素酶(luciferase)基因。将mPTA1和荧光素酶双阳性小鼠耳成纤维细胞转染含rtTA的pUHD17.1质粒,用含有盐酸强力霉素(Dox)的培养基进行培养,检测细胞裂解液中荧光素酶的活性。将荧光素酶表达依赖Dox的小鼠与C57BL/6小鼠交配,采用PCR对子代鼠进行检测。最终共获得7只首建鼠,其目的基因表达高度依赖Dox,并得到了其中2只首建鼠的F1代小鼠。     

EB病毒膜抗原ELLF1基因转基因小鼠的制备

将Ｅｐｓｔｅｉｎ－Ｂａｒｒ病毒（ＥＢＶ）膜抗原（ＭＡ）ＢＬＬＦ１基因用显微注射法导入昆明种小鼠受精卵的雄性原以制备转基因小鼠模型。共注射受精卵４５０枚，存活２９１枚，植入假孕母鼠的输卵管使之发育，产出仔鼠１２只。     

转人载脂蛋白Eε4和突变淀粉前体蛋白基因小鼠的建立

将人载脂蛋白(ApoEε4)转基因鼠和突变前体蛋白(APP)转基因小鼠交配,以建立h-ApoEε4／突变APP双转基因小鼠。共产出仔鼠23只,经PCR初步筛选,并用Southern杂交对阳性小鼠基因组DNA作进一步鉴定,得到3只双转基因小鼠。该双转基因鼠的建立为进一步阐明ApoEε4的致病作用以及对AD的研究提供了理想的研究模型。     

可诱导心肌特异性表达IL-22转基因小鼠模型的建立

目的建立心肌特异性、高效表达白介素22的转基因小鼠模型。方法将TRE-Tight-IL-22转基因载体显微注射入C57BL/6小鼠受精卵细胞中,得到含有其中1段转基因载体的转基因小鼠,再将这种转基因小鼠与含有能够控制TRE-Tight下游基因在心肌特异性表达的α-MHC-rtA-hGH的转基因小鼠进行交配,获得同时含有TRE-Tight-IL-22和α-MHC-rtTA-hGH这2段基因的双阳性子代转基因小鼠。使用强力霉素(Dox)持续诱导6周龄双阳性小鼠6周,再用ELISA方法检测转基因小鼠心肌细胞中IL-22表达量。结果与野生型C57BL/6小鼠比较,经过强力霉素诱导的双阳转基因小鼠心肌细胞有高表达量的IL-22(P0.05)。结论得到了可诱导、高效表达IL-22的转基因小鼠系,为IL-22与心力衰竭关系的深入研究和治疗提供新的研究思路。     

HBD-2转基因小鼠的建立及鉴定

人β防御素2（Human beta defensin 2，HBD-2）是人体抗菌肽的重要分子，体外试验研究证明具有广谱抗微生物活性，为开展其在整体水平上的功能研究，建立HBD-2转基因小鼠模型。用分子克隆方法构建了带CMV启动子的HBD-2全长cDNA真核重组表达质粒pCDNA3．1-HBD2，以此为摸板，PCR扩增出带CMV启动子和BGH polyA尾的HBD-2基因片段，用显微注射技术将此微基因导入小鼠雄原核中，于M16培养液培养后经输卵管移植到受体鼠体内让其怀孕产生子代小鼠。PCR法检测外源基因在小鼠基因组中的整合，RT—PCR和免疫组化法检测HBD-2在小鼠组织的表达。PCR检测结果显示17只F1代转基因鼠中4只检测到阳性信号，RT—PCR和免疫组化检测显示HBD-2在其F1代转基因小鼠生殖道、呼吸道、泌尿道以及血管内皮等组织部位广泛表达。实验表明HBIN2基因已整合到小鼠基因组且广泛表达，为进一步研究HBD-2的生物学功能及基因调控提供了有用的整体动物模型。     

Fgfr3基因374点突变致软骨发育不全小鼠模型的建立与分析

目的建立模拟人成纤维细胞生长因子3型受体(fibroblastgrowthfactorreceptor3,Fgfr3)374号甘氨酸至精氨酸点突变小鼠模型并进行初步表型分析。方法应用双重PCR法及分子克隆技术构建小鼠Fgfr3-Gly374Arg点突变打靶载体,对胚胎干细胞(embryonicstemcells,ES细胞)进行打靶后,采用G418、Ganciclovir正负双向选择和Southern杂交对打靶ES细胞进行筛选,选发生正确同源重组的ES细胞进行胚泡显微注射,携带Neo基因的Fgfr3-Gly374Arg点突变鼠与EIIa-Cre转基因鼠杂交后,得到只含Fgfr3-Gly374Arg点突变鼠。用PCR法进行了基因型鉴定,并应用骨骼染色、组织学等技术对其表型进行了初步分析。结果Fgfr3-Gly374Arg点突变小鼠体小尾短、头大,前额圆凸,骨骺生长板区明显缩短、结构紊乱,肥大软骨细胞区也有明显减少。同时伴有多数雌性小鼠不孕、子宫、卵巢变小、乳腺发育不良等变化。结论成功地建立了模拟人Fgfr3-Gly374Arg点突变所致软骨发育不全的小鼠模型。     

四环素调控的小鼠LAIR-1/CD305转基因小鼠的初步建立

目的：建立四环素调控的小鼠LAIR-1/CD305转基因小鼠,为进一步研究mLAIR-1分子的体内功能奠定基础.方法：构建pBI-5-mLAIR-1载体,显微注入B6D1F1受精卵,PCR检测新生小鼠基因组DNA中LAIR-1与荧光素酶（Luciferase）基因.将mLAIR-1和荧光素酶双阳性小鼠耳成纤维细胞转染含rtTA的pUHD17.1质粒,用含盐酸强力霉素（Dox）的培养基进行培养,检测细胞裂解液中荧光素酶活性.将荧光素酶表达依赖Dox小鼠与C57BL/6交配,采用PCR对子代鼠进行检测.结果：共获得9只首建鼠,其目的基因表达高度依赖Dox,并得到其中5只首建鼠的F1代小鼠.结论：获得了四环素调控的小鼠LAIR-1转基因小鼠,可用于该分子体内功能的研究.     

建立阿尔茨海默症的转基因动物模型

目的 建立阿尔茨海默症转基因动物模型,为病因研究和药物筛选提供了一个合适的运动模型。方法 通过显微注射方法将外源ＤＮＡ注射到小鼠受精卵的雄性原核,移植到假孕母鼠的输卵管。仔鼠出生后,经ＰＣＲ及ＰＣＲ－Ｓｏｕｔｈｅｒｎ杂交检测阳性小鼠。结果共注射８８７枚受精卵,存活４８２枚,称卵后产仔３５只,阳性３只,阳性鼠分别传代,在Ｆ２代获得纯合子后建系。免疫组织化学显示在大脑皮层、小脑及海马的神经细胞有ＡＰ     

转人溶菌酶基因小鼠乳腺生物反应器的建立

目的 研究人溶菌酶（human lysozyme，hLYZ）动物乳腺生物反应器制备的可行性。方法 将hLYZ基因与动物乳腺特异表达载体p205C3连接，所得重组载体p205C3-hLYZ用显微注射法建立转基因小鼠。结果 共出生了136只F0代小鼠，PER和Southern杂交检测基因整合阳性率分别为5．15％（2♀5♂）和2．94％（1♀3♂）。Western印迹检测结果表明，分泌在小鼠乳汁中的表达产物与正常hLYZ具有相同的分子量。目前转基因小鼠已经繁殖到B代，每一代基因整合阳性母鼠的乳腺均表达hLYZ，乳汁中的表达量最高达750mg/L。斑点杂交试验证明，表达有较强的组织特异性，除在乳腺表达外，仅在脾脏和小肠有一定的异位表达。结论 成功建立了hLYZ小鼠乳腺生物反应器。