鹦鹉热嗜衣原体实时定量PCR检测方法的建立

目的建立一种简便、快速、特异的荧光定量PCR检测方法,用于鹦鹉热嗜衣原体的快速检测。方法以主要外膜蛋白(MOMP)基因为靶序列设计特异性引物,采用SYBR GreenⅠ随机渗入法建立实时定量PCR检测方法。结果循环阈值(Ct)与标准DNA模板在1.0×102-1.0×107拷贝/μl浓度范围内呈良好的线性关系,相关系数为0.989。该方法用于鹦鹉热嗜衣原体的检测具有很高的特异性,其敏感性与常规PCR相比可以提高100倍。结论本研究建立的检测鹦鹉热嗜衣原体的实时定量PCR检测方法具有很高的特异性和敏感性,可以用于鹦鹉热嗜衣原体的检测。     

TaqMan-MGB荧光定量PCR快速检测结核分枝杆菌katG基因突变

目的 建立一种特异、灵敏、快速检测结核分枝杆菌katG基因突变的TaqMan-MGB荧光定量PCR方法。方法 根据结核分枝杆菌katG基因主要发生315位点突变的特点,设计一对特异性TaqMan-MGB探针和引物,通过反应条件优化,建立荧光定量PCR方法;用克隆到PMD18-T载体上katG基因阳性标准品及不同菌株来评价该方法的特异性、敏感性和重复性。结果 灵敏度高,检测目的基因的最低检测下限10copies/μl,比常规PCR灵敏高100倍;特异性高,检测16株非结核分枝杆菌标准株和7种常见呼吸道感染细菌的标准株均为阴性;与测序法相比,野生型和突变型探针的敏感性和特异性均为100%。重复性好,批内批间CT值变异系数均小于1%。结论：TaqMan-MGB荧光定量PCR的方法能特异、灵敏、快速检测结核杆菌菌株katG 315位点突变。     

嗜水气单胞菌实时荧光三重TaqMan PCR快速检测体系的建立

目的 建立针对嗜水气单胞菌的高灵敏、高特异的实时荧光三重TaqMan聚合酶链式反应（PCR）快速检测体系。方法 根据嗜水气单胞菌的16S rDNA、气溶素基因（aerA）和丝氨酸蛋白酶基因（ahp）的特异性序列设计引物及TaqMan探针,利用高通量实时荧光PCR检测平台探讨该检测体系的灵敏度;用29种其他肠道致病菌及院内感染中常见的致病菌评价该检测体系的特异性。 结果 实时荧光三重TaqMan PCR快速检测体系对嗜水气单胞菌重组质粒的检测灵敏度为1×102拷贝/反应体系;对嗜水气单胞菌基因组的检测灵敏度为5×10-2 pg/反应体系;该体系的特异性引物探针在检测29种其他肠道致病菌及院内感染中常见的致病菌时未出现假阳性,整个反应在2h内完成。 结论 本研究建立的实时荧光三重TaqMan PCR检测体系可作为嗜水气单胞菌灵敏、特异、快速的检测方法,并同时评价嗜水气单胞菌的致病潜力。     

Taqman-MGB双重探针PCR技术检测军团菌

目的建立同时检测军团菌属和嗜肺军团菌的双重荧光定量PCR方法。方法利用军团菌16S rDNA和mip基因的特异性序列设计引物和MGB探针,两条探针5′端分别标记FAM和HEX,3′端标记MGB。优化了荧光定量PCR反应条件和反应体系,并对军团菌、嗜肺军团菌、非嗜肺军团菌及其它细菌进行检测,验证该方法的特异性、敏感性、重复性。结果该方法所检测菌株中军团菌属结果均为16S rDNA阳性(LP12、LP13除外);嗜肺军团菌均为mip阳性,非嗜肺军团菌属除L.micdadei外均为阴性;而非军团菌菌株16S rDNA和mip检测结果均为阴性。检测灵敏度达10个拷贝/反应;重复性实验中,变异系数为0.2%~0.6%;从菌株核酸的提取至检测完成仅需2h左右。结论本文建立的Taq Man-MGB双重探针荧光定量PCR是一种定量检测军团菌的特异、快速、敏感的方法,可区分嗜肺与非嗜肺军团菌属,该方法的建立将有益于今后开展对外环境污染源进行初步卫生学调查与评估,以及应急临床标本的快速定量检测。     

医院临床标本中阴沟肠杆菌遗传多样性分析及应用TaqMan荧光定量PCR方法快速检测阴沟肠杆菌的研究（英文）

目的调查医院临床标本中阴沟肠杆菌基因群的构成比例,并建立TaqMan荧光定量PCR方法对阴沟肠杆菌进行特异、灵敏、快速检测。方法通过hsp60基因分型分析临床标本中基因群的构成,并以外膜蛋白基因(ompX)为靶基因设计引物及FAM探针,建立TaqMan荧光定量PCR方法对阴沟肠杆菌基因群检测,并评价该方法的特异性、灵敏性和稳定性。结果 237株临床标本共归为10个基因群。其中群III,VI和VIII菌株数量最多,占总菌株数的71%;群I占11%;其他6个群总共占18%。无基因群VII,X和XII。TaqMan荧光定量PCR方法能对阴沟肠杆菌不同基因群进行特异检测:对十个基因群和群I的质粒标准品的检测下限分别为36拷贝/μL和21拷贝/μL,对粪便模拟标本的检测下限为104个菌落形成单位/μL;TaqMan荧光定量PCR方法对质粒标准品和粪便模拟标本检测的扩增曲线良好;结论医院临床标本中可以检测到十个基因群,具有遗传多样性的特征。本研究建立的TaqMan荧光PCR方法特异性好、灵敏度高,能够用于阴沟肠杆菌的快速检测。     

鹦鹉热衣原体套式PCR和DNA测序方法研究

目的　建立特异、灵敏、快速的鹦鹉热衣原体 (Cps)分子生物学检测方法。 方法　采用套式PCR扩增检测和DNA测序方法 ,并进行实验室评价。结果　 4株Cps均能被套式PCR扩增出 2 14bp目的条带 ,而沙眼衣原体、肺炎衣原体、肺炎支原体等其它微生物均不能检出 ;Cps套式PCR灵敏度高于CpsPCR ;模拟样本均能被检出。Cps(CS株 )套式PCR产物直接测序与Cps典型株序列完全一致。结论　套式PCR是检测Cps特异、灵敏 ,且快速的分子生物学检测方法     

医院临床标本中阴沟肠杆菌遗传多样性分析及应用TaqMan荧光定量PCR方法快速检测阴沟肠杆菌的研究

目的 调查医院临床标本中阴沟肠杆菌基因群的构成比例,并建立TaqMan荧光定量PCR方法对阴沟肠杆菌进行特异、灵敏、快速检测.方法 通过hsp60基因分型分析临床标本中基因群的构成,并以外膜蛋白基因(ompⅩ)为靶基因设计引物及FAM探针,建立TaqMan荧光定量PCR方法对阴沟肠杆菌基因群检测,并评价该方法的特异性、灵敏性和稳定性.结果 237株临床标本共归为10个基因群.其中群Ⅲ,Ⅵ和Ⅷ菌株数量最多,占总菌株数的71％;群Ⅰ占11％;其他6个群总共占18％.无基因群Ⅶ,Ⅹ和Ⅻ.TaqMan荧光定量PCR方法能对阴沟肠杆菌不同基因群进行特异检测:对十个基因群和群Ⅰ的质粒标准品的检测下限分别为36拷贝/μL和21拷贝/μL,对粪便模拟标本的检测下限为104个菌落形成单位/μL;TaqMan荧光定量PCR方法对质粒标准品和粪便模拟标本检测的扩增曲线良好;结论 医院临床标本中可以检测到十个基因群,具有遗传多样性的特征.本研究建立的TaqMan荧光PCR方法特异性好、灵敏度高,能够用于阴沟肠杆菌的快速检测.     

吉林省鸽子鹦鹉热衣原体的分子流行病学调查和基因型分布研究（英文）

目的 2015年3-5月调查吉林省长春市和吉林市肉鸽与信鸽中鹦鹉热衣原体的流行情况及基因型分布。方法本研究共采集鸽子粪便样本399份,其中长春市样本282份,吉林市样本117份。利用PCR技术进行鹦鹉热衣原体ompA基因扩增、测序以及基因型分析。结果本实验结果显示:鹦鹉热衣原体的感染率为5.01%(21/399),其中吉林市鹦鹉热衣原体的感染率(9.40%)明显高于长春市的感染率(3.19%)。此外,品种也是与衣原体感染相关的主要风险因素,肉鸽的感染率为7.49%,而信鸽的感染率为0。ompA基因的序列分析显示,这些鹦鹉热衣原体都属于B型。结论综上所述,我国吉林省肉鸽具有较高的B型鹦鹉热衣原体流行,给人类的健康带来了潜在的威胁。     

荧光定量PCR检测嗜吞噬细胞无形体

目的采用新型TaqMan-MGB探针建立检测嗜吞噬细胞无形体的实时荧光定量PCR(quantitativereal-timePCR)方法。方法依据gltA基因序列设计嗜吞噬细胞无形体特异引物和探针,以克隆的嗜吞噬细胞无形体gltA基因片段作DNA模板,在荧光定量PCR检测仪(ABI7900HT)上建立实时荧光定量检测方法。结果建立的定量标准曲线的循环阈值(Ct)与模板拷贝数呈良好的线性关系(r=0.996);与套式PCR相比较,荧光定量PCR检测的灵敏度是其100倍。用荧光定量PCR检测其它相关立克次体和细菌DNA样本,检出结果几乎为0;对荧光定量PCR检测重复性进行分析,变异系数(CV)批内和批间误差在0~2.1%之间,证明该荧光定量PCR具有种特异性和良好的重复性。用荧光定量PCR检测体疑染嗜吞噬细胞无形体的10份蜱和30份小鼠脾脏标本,结果与套式PCR检测结果有密切相关性,但是定量PCR检测敏感性和准确率均高于套式PCR。结论本研究建立的检测嗜吞噬细胞无形体的实时荧光定量PCR具有很高的特异性和敏感性,特别适合检出样本中微量嗜吞噬细胞无形体。     

沙眼衣原体荧光定量PCR检测方法的建立

目的建立沙眼衣原体实时荧光定量PCR检测技术,以期用于沙眼衣原体的感染检测。方法针对沙眼衣原体ompA基因序列保守区域设计引物和TaqMan探针,构建标准质粒并制作标准曲线,建立沙眼衣原体实时荧光定量检测方法,通过对人型支原体等的检测评价方法的特异性。结果建立的沙眼衣原体荧光定量PCR体系能特异性检测沙眼衣原体,与人型支原体、解脲脲原体、淋球菌、大肠埃希菌EDL933、金黄色葡萄球菌无交叉反应;标准曲线在3.9×109～3.9×103 copies/μl之间线性关系良好(r2=0.99);方法的灵敏度高,检测最低拷贝数为3.9copies/μl;组内及组间变异系数均5%。结论建立的检测沙眼衣原体实时定量PCR方法特异、灵敏,可用于沙眼衣原体感染的早期筛查和临床快速诊断。     

中东呼吸综合征冠状病毒实时荧光定量PCR检测方法的建立

目的建立一种快速、敏感、特异的实时荧光定量PCR(Real-time PCR)方法,用于中东呼吸综合征冠状病毒(MERS-CoV)的检测。方法根据中东呼吸综合征冠状病毒S蛋白基因的保守序列设计并合成一对引物及一条特异性TaqMan探针。通过条件优化,以10倍系列稀释重组质粒为标准品,进行Real-time PCR扩增,绘制标准曲线,并进行重复性、准确性、特异性及敏感性检测。结果建立的Real-time PCR方法检测中东呼吸综合征冠状病毒所绘制标准曲线的相关系数0.99,灵敏度为1.00×101拷贝,高于常规PCR方法(1.00×102拷贝);用该方法检测中东呼吸综合征冠状病毒基因为阳性,其他6种对照呼吸道病原体及冠状病毒基因检测均呈阴性;批内、批间重复试验的变异系数均1%。结论建立的中东呼吸综合征冠状病毒Real-time PCR检测方法灵敏、特异、重复性好,可用于中东呼吸综合征冠状病毒感染的快速诊断和流行病学调查。     

TaqMan MGB探针实时荧光定量PCR快速检测布鲁氏菌

目的利用新一代TaqMan MGB探针技术,建立特异敏感的实时荧光定量PCR方法,用于布鲁氏菌的快速检测。方法针对布鲁氏菌基因组中16SrRNA序列设计特异性引物和探针,建立一套基于TaqMan MGB探针技术的实时荧光定量PCR方法,验证方法的特异性、敏感性和稳定性,对2008-2010年期间采集的773份动物样本中的布鲁氏菌进行检测,并与普通PCR方法进行比较分析。结果建立的TaqMan MGB探针实时荧光定量PCR方法对布鲁氏菌的检测具有高度的特异性,对小肠结肠耶尔森菌、假结核耶尔森菌、肠炎沙门氏菌、大肠埃希菌、铜绿假单胞菌、空肠弯曲菌、泰泽氏菌均无交叉反应。生成的标准曲线的相关系数为0.999,斜率为-3.301,TaqMan MGB探针实时荧光定量PCR效率为100.872%。TaqMan MGB探针实时荧光定量PCR能够准确地从布鲁氏菌阳性样本中检测到布鲁氏菌DNA,最低能够检测到的布鲁氏菌数量为9.3拷贝,比常规PCR方法的灵敏度高100倍。对773份动物样本进行检测,结果TaqMan MGB探针实时荧光定量PCR能检出53份布鲁氏菌阳性样本,而常规PCR只检出37份阳性。结果显示,TaqMan MGB探针实时荧光定量PCR方法比常规PCR方法更敏感,能够直接从动物样本中检出布鲁氏菌DNA,检测时间仅为2h。结论本研究首次建立了直接用于检测动物样本中布鲁氏菌的TaqMan MGB探针实时荧光定量PCR方法,该技术适用于传染性病原体的快速检测与鉴定。     

实时荧光定量PCR法检测日本血吸虫

目的 运用实时荧光定量PCR法检测日本血吸虫。 方法 根据日本血吸虫18 S小亚基单位核糖体核酸（18S rRNA）基因设计特异性引物,PCR扩增出1 450 bp序列,经TA克隆后转入大肠埃希菌DH5α,提取重组质粒,鉴定后作为模板制作荧光定量PCR 标准曲线。方法重现性评价,用初始循环数（Ct,拷贝/反应）进行标准差分析,并计算变异系数（CV）。 结果 制作的标准曲线循环阈值与模板浓度具有良好的线性关系,相关系数为0.998 7。方法重现性评价,在1.05×107～1.05×103个拷贝范围内,对应的Ct平均值分别为17.55、20.93、24.32、27.59和30.95;CV值分别为1.31%、1.53%、0.90%、1.85%及0.90%,在重复性试验中试验间数据平均变异系数为1.27%,无非特异性扩增。 在试验检测范围内（Ct≤30.95）,可检测的日本血吸虫基因组浓度为6.15 pg,3 h内完成。 结论 运用荧光定量PCR方法检测日本血吸虫DNA,快速、灵敏、特异性高。     

阪崎肠杆菌实时荧光双重TaqMan PCR快速检测体系的建立

目的建立针对阪崎肠杆菌的高灵敏、高特异的实时荧光双重TaqMan聚合酶链式反应（PCR）快速检测体系。方法根据阪崎肠杆菌基因组16SrRNA～23SrRNA的内部转录间隔区（ITS）基因和外膜蛋白A（OmpA）基因的特异性序列设计引物及TaqMan探针,利用高通量实时荧光PCR检测平台探讨该检测体系的灵敏度;用50种其他肠道致病菌及院内感染中常见的致病菌评价该检测体系的特异性。结果实时荧光双重TaqMan PCR快速检测体系对阪崎肠杆菌重组质粒的检测灵敏度为1×102拷贝/反应体系;对阪崎肠杆菌基因组的检测灵敏度为4×10-1pg/反应体系;该检测体系在检测50种其他肠道致病菌及院内感染中常见的致病菌时未出现特异性扩增,整个反应在2h内完成。结论本研究建立的实时荧光双重TaqMan PCR检测体系可作为阪崎肠杆菌灵敏、特异、快速的检测方法,并同时检测阪崎肠杆菌的致病力。     

基于SYBR Green检测微小隐孢子虫的实时荧光定量PCR方法的建立及应用

目的建立一种方便快捷的检测微小隐孢子虫的实时荧光定量PCR（Real-time PCR）方法。方法根据GenBank公布的微小隐孢子虫18s rRNA基因序列设计1对引物,通过质粒DNA和卵囊检测标准曲线的绘制及特异性和重复性的研究,建立检测微小隐孢子虫的基于SYBR Green的Real-time PCR方法,进而对奶牛粪便进行检测。结果建立的Real-time PCR法对检测微小隐孢子虫具有很高的特异性,质粒DNA和卵囊的检测阈值分别达到1个拷贝和10个卵囊,奶牛粪便阳性率为25.93%（21/81）,高于普通PCR检测率20.99%（17/80）。结论建立的Real-timePCR方法简便、快速,特异性强,敏感度高,可用于微小隐孢子虫的快速定量检测。     

鹦鹉热嗜衣原体两对荧光定量PCR引物的应用与比较

针对鹦鹉热嗜衣原体(Cps)的主要外膜蛋白(MOMP)基因和多形态膜蛋白(PMP)基因分别设计引物,建立荧光定量PCR方法,比较两对引物的灵敏度和特异性。试验结果表明,两对引物均可用于Cps检测,在样本中靶标浓度高时,PMP引物的检测灵敏度优于MOMP引物;但前者的扩增效率低于后者,后者更适合用于Cps的实时定量PCR检测。相对定量研究表明国内不同Cps流行株的PMP基因在基因组上的拷贝数可能存在较大差异。     

Taqman-MGB双重探针PCR技术检测含89K毒力岛猪链球菌2型

目的建立同时检测猪链球菌(Streptococcus suis,SS)种特异性16S rRNA及其89K毒力岛基因的SS2中国毒力株双重荧光定量PCR方法。方法利用SS种特异性16S rRNA和89K毒力岛基因的特异性序列设计引物和MGB探针。优化荧光定量PCR反应条件和反应体系,并对21株猪链球菌2型(Streptococcus suis serotype 2,SS2)、18株其它链球菌、9株葡萄球菌、5株其它菌株进行检测,验证该方法的特异性、敏感性、重复性。结果该技术的种特异性16S rRNA及其89K毒力岛两基因检测灵敏度分别为6个拷贝/反应(或12cfu/mL)及27拷贝/反应(或58cfu/mL);重复性实验,变异系数为0.30%～2.11%;从菌株核酸的提取至检测完成仅需2h左右。用该方法对有关菌株进行考核,21株SS2菌检测结果均为SS种特异性16S rRNA基因阳性,其中15株含有89K毒力岛的SS2菌株的89K毒力岛基因检测均阳性;而非SS菌株的16S rRNA和89K毒力岛基因检测结果均为阴性。对49份呼吸道咽拭子、血液应急样本等进行实际考核,有2份血液样本16S rRNA基因阳性,其中1份血液样本89K毒力岛基因阳性。结论本次建立的Taq Man-MGB双重探针荧光定量PCR方法特异、快速、敏感,可特异性鉴定SS2中国毒力株(含有89K毒力岛),区分SS与非SS菌以及是否含有89K毒力岛基因,该方法的建立将有益于目前针对猪链球菌2型中国毒力株快速定量检测,以及疑似猪链球菌病患者病原的早期甄别、猪链暴发疫情调查及猪群暴发或带菌调查与评估等。     

SYBR Green荧光PCR检测美洲钩虫方法的建立

目的建立荧光定量PCR检测美洲钩虫的方法。方法提取虫体基因组DNA、根据GenBank中美洲钩虫ITS 2序列设计特异引物,PCR扩增ITS 2序列、克隆、测序和比对。常规PCR检验引物特异性。将ITS 2序列扩增产物回收、纯化后经T克隆转入大肠埃希菌DH5α,提取重组质粒,鉴定后作为标准品模板建立荧光定量PCR标准曲线,并做灵敏性和重复性试验。结果构建的荧光定量PCR标准曲线循环阈值与模板浓度呈良好的线性关系,溶解曲线的吸收峰单一,实验重复性良好。结论成功构建了SYBR Green I荧光定量PCR检测美洲钩虫的方法,可用于快速、准确、定量检测美洲钩虫。     

用多重PCR技术检测小管福寿螺体内广州管圆线虫幼虫

目的建立一种多重PCR方法检测小管福寿螺体内的广州管圆线虫幼虫。方法根据广州管圆线虫核糖体小亚基rDNA基因序列(GenBank登录号为AY295804)设计特异性引物,并与小管福寿螺16srDNA的特异性引物组合,建立多重PCR检测方法。分别以阳性和阴性小管福寿螺DNA为模板进行多重PCR扩增,电泳鉴定并测序。用阴性小管福寿螺DNA倍比稀释200条广州管圆线虫Ⅲ期幼虫DNA模板,使之浓度分别为1200ng/μl、120ng/μl、12ng/μl、1200pg/μl、120pg/μl和12pg/μl,检测该方法的敏感性。野外采集小管福寿螺172只,肺检法检测后,进行多重PCR扩增,计算敏感性和特异性。结果电泳和测序结果证实该多重PCR检测方法能有效扩增出目的片段,小管福寿螺和广州管圆线虫的目的片段分别为550和405bp。该方法可检测出广州管圆线虫Ⅲ期幼虫DNA的最小浓度为120pg/μl。肺检法和多重PCR法检测均为阳性结果的45只,两法均为阴性的100只。肺检法为阴性、多重PCR法为阳性的24只,肺检法为阳性而多重PCR法检测为阴性的3只。多重PCR的敏感性和特异性分别为93.8%(45/48)和80.6%(100/124)。多重PCR法的阳性检出率为40.1%(69/172),肺检法阳性检出率为27.9%(48/172),差异具有统计学意义(χ2=14.8,P0.01)。结论建立了检测小管福寿螺体内广州管圆线虫的多重PCR方法。     

空肠弯曲菌实时荧光定量PCR检测方法的研究

目的建立一种快速廉价的检测空肠弯曲菌的实时荧光定量PCR方法。方法根据空肠弯曲菌flaA、gyrA基因设计引物,建立空肠弯曲菌实时荧光定量PCR检测方法。结果以flaA基因引物对空肠弯曲菌DNA进行实时荧光定量PCR,扩增曲线呈S形指数增长,大肠埃希菌等对照菌扩增阴性。方法的灵敏度为10CFU/ml菌悬液。结论建立的空肠弯曲菌荧光定量PCR检测方法具有快速、简便、准确等特点,具有一定的使用价值。