B-7.1转基因细胞株的表达和检测

目的 构建B-7.1基因真核表达载体并导入CAK-1肾细胞癌细胞表达,为进一步研究基因的功能做材料准备.方法 采用RT-PCR方法,以正常肝脏组织cDNA为模板,扩增B-7.1基因全长读码框架,并构建到真核表达载体pCDNA3.1中,将其导入CAK-1肾细胞瘤细胞,对转染后的细胞进行RT-PCR和Western blo...     

大鼠CD36基因真核表达载体的构建及表达

目的:构建大鼠CD36真核表达载体,并在293T细胞中表达.方法:应用RT-PCR技术,从大鼠肺泡巨噬细胞NR8383细胞提取的总RNA中,获得CD36基因编码序列片段,克隆至真核表达载体pEGFP-N1中,对重组质粒进行酶切和测序鉴定后,以脂质体介导法转染至293T细胞,通过荧光显微镜和Western blot检测其在293T细胞中的表达.结果:酶切和测序证明重组真核表达载体pEGFP-N1-CD36构建成功,荧光显微镜及Western blot确认目的基因序列在293T细胞中过表达.结论:成功构建大鼠CD36基因的重组真核表达载体pEGFP-N1-CD36,并在293T细胞中过表达.     

血管内皮细胞黏附分子胞外区基因真核表达载体构建及表达

目的构建并表达血管内皮细胞黏附分子(VCAM-1)胞外区基因真核表达载体。方法从小鼠NIH/3T3细胞提取总RNA,以其为模板通过RT-PCR扩增VCAM-1胞外区(D1-D4结构域)cDNA。利用PCR获得VCAM-1胞外区基因,连接pMD19-T载体,进行基因序列测序。将VCAM-1 D1-D4目的片段插入到真核表达载体pIRES2-AcGFP1-Nuc中,构建重组真核表达质粒pIRES2-AcGFP1-Nuc-VCAM-1。经双酶切鉴定VCAM-1胞外区基因真核表达载体构建的成功与否。利用脂质体把pIRES2-AcGFP1-Nuc-VCAM-1导入至人B淋巴性白血病细胞株(Raji)内。结果基因测序结果表明成功扩增出VCAM-1胞外区基因,双酶切鉴定表明重组的真核表达质粒pIRES2-AcGFP1-Nuc-VCAM-1构建成功。Western blot结果显示导入pIRES2-AcGFP1-Nuc-VCAM-1质粒的Raji细胞中VCAM-1高表达。细胞结合实验表明,表达的VCAM-1与前B细胞(70Z/3)表面的VLA-4特异性结合。结论 VCAM-1真核表达载体构建及表达成功,为前B细胞克隆形成机理以及为B细胞分化发育研究提供实验依据。     

人TRAM基因真核表达载体的构建

目的 构建TRAM基因真核表达载体,为研究TRAM的功能提供研究工具。方法 首先采用PCR方法扩增人TRAM蛋白相应的编码序列,将扩增的特定片段克隆至pCMV-N-Flag真核表达载体。然后,对重组载体进行DNA测序,确认序列正确后将重组载体转染至HEK-293T细胞,并用Western blot方法检测TRAM蛋白的表达以评价载体是否构建成功。结果 菌落PCR电泳可检测到800 bp附近出现目的条带,质粒DNA测序显示载体插入705 bp的核苷酸序列,其序列与TRAM完全一致。Western blot检测到HEK-293T细胞高表达带Flag标签的TRAM蛋白。结论 基于PCR扩增、双酶切、酶连接扩增片段和载体成功构建带Flag标签的TRAM真核表达载体。构建的质粒可为进一步研究干扰素的调控和抗病毒免疫治疗提供一种研究工具。     

人生长激素基因真核表达载体的构建及鉴定

目的 构建人生长激素的真核细胞表达载体,测定并分析目的 基因序列.方法 用PCR方法扩增出人生长激素基因,连接至T克隆载体,然后分别亚克隆至真核细胞表达载体pCDNA3.1、pCEP4中.使用DNA ssist软件分析序列.结果 所构建真核表达载体的酶切鉴定、PCR鉴定、测序鉴定均正确.结论 成功构建出多个人生长激素基因真核细胞表达载体,验证了基因序列的正确性,为下一步基因治疗研究打下基础.     

iNOS基因和iNOS-VP1融合基因真核表达载体的构建及初步表达

目的 构建pcDNA3．1介导的诱导性一氧化氮合成酶（iNOS）的基因表达载体和pcDNA3．1介导的iNOS与柯萨奇病毒B组3型（CVB3）结构蛋白VP1融和基因的表达载体。方法 应用PCR扩增和DNA重组技术构建pcDNA3．1-iNOS和pcDNA3．1-iNOS—VP1表达载体；应用真核细胞转染技术及间接免疫荧光技术进行所构建的真核表达载体的初步表达和鉴定。结果 经PCR扩增技术用特异引物从质粒pKSiNOS分离编码iNOS开放阅读框架的cDNA，TA克隆于pMD19-T载体，根据设计引物时加入的酶切位点将插入片断亚克隆于表达载体pcDNA3．1；经PCR扩增技术用特异引物从质粒pCR2．1-VP1分离编码CVB3VP1结构蛋白的cDNA，TA克隆于pMD19-T载体，根据设计引物时加入的酶切位点将VP1亚克隆于iNOS的表达载体pcDNA3．1-iNOS，从而构建含有iNOS和VP1融合基因的真核表达载体。限制性内切酶分析、PCR鉴定和测序证实重组体peDNA3．1-iNOS和peDNA3．1-iN—OS—VP1插入片断的大小和方向正确且开放阅读框架的读码框不变；重组质粒peDNA3．1-iNOS和peDNA3．1-iNOS．VP1在HeLa细胞中均有表达，但表达效率较低。结论 获得含iNOS基因和iNOS—VP1融合基因的真核表达载体，并将重组质粒进行了初步表达，为体外iNOS抗CVB3作用的研究奠定了物质基础。     

SV40TAg真核表达载体的设计与构建

目的 设计并构建SV40TAg真核表达载体。方法 采用重叠延伸拼接法从pUC19-SV40载体中克隆切除了内含子的SV40LT基因全长，在其5’端连上loxP位点，EcoR I、BamH I双酶切，同时采用重叠延伸拼接法从pEGFP-N1真核表达载体中克隆EGFP基因全长，并在3’端连上loxP位点，两个酶切产物连接后定向克隆至pEGFP-N1真核表达载体，DNA序列分析鉴定重组质粒。结果 SV40LT基因和两个loxP位点成功克隆至pEGFP-N1真核表达载体中。结论 本实验构建的SV40LT重组质粒为利用SV40T抗原进行黑素细胞发育、分化，黑素生成以及黑素瘤发生等研究提供了新的分子工具。     

人T细胞活化衔接因子基因真核表达载体的构建

目的构建人T细胞活化衔接因子（LAT）基因的真核表达载体。方法以人外周血单个核细胞的cDNA为模板,采用聚合酶链式反应（PCR）扩增LAT基因编码区的全部序列,克隆人真核细胞表达载体pCMV—Myc中,测序鉴定目的基因并运用核转染的方法转染人外周血T淋巴细胞。结果PCR扩增的特异性片段长度为729bp,以此构建重组质粒pCMV—Myc—LAT,测序结果与Genbank中的人LAT基因cDNA序列一致。转染人外周血T淋巴细胞后可检测到LAT蛋白的表达。结论成功构建了pCMV—Myc—LAT重组真核表达载体。     

人SYNOVIOLIN基因真核表达载体的构建及表达

目的：构建携EGFP的人SYNOVIOLIN基因真核表达载体。方法：应用基因重组技术,根据人SYNOVIOLIN基因序列和表达载体pIRES2-EGFP质粒上的多克隆位点设计引物,对含有SYNOVIOLIN基因的质粒pCDNA3-syno扩增,得到约1900 bp的目的片段,进行T-A克隆。SalⅠ/BamHⅠ双酶切测序正确的重组质粒,回收SYNOVIOLIN cDNA片段,将其亚克隆于pIRES2-EGFP载体的多克隆位点内得到质粒pIRES2-EGFP-syno。脂质体法转染HEK293细胞, 用激光共聚焦显微镜和Western blot检测EGFP和SYNOVIOLIN在HEK293细胞的表达。结果：PCR,酶切及测序结果表明pIRES2-EGFP-syno真核表达载体构建成功,激光共聚焦显微镜和Western blot显示EGFP和SYNOVIOLIN蛋白在HEK293细胞中成功表达。结论：成功构建pIRES2-EGFP-syno真核表达载体并在HEK293细胞表达,为抗肌腱粘连的　SYNOVIOLIN基因治疗研究奠定基础。     

大鼠Akt1基因真核表达载体的构建及其在293细胞中的表达

目的构建Akt1基因真核表达载体pDC316-Akt1，观察其在293细胞（人胚肾母细胞）中的表达。方法采用RT-PCR方法自大鼠肝组织总RNA中克隆Akt1 DNA片段，测序鉴定正确后，插入真核表达载体pDC316的EcoRⅠ、HindⅢ的酶切位点，构建Akt1真核表达载体Akt—pDC316，脂质体介导法转染293细胞，36h后Western blot检测转染293细胞中Akt1的含量。结果经测序鉴定，构建的Akt1氨基酸序列与野生型Akt1序列完全相符。将Akt-pDC316转入293细胞，可见55000位置有Akt1的表达。经Western blot检测，具有良好的表达浓度。结论构建Akt1基因真核表达载体在293细胞中可以充分表达。     

t-PA基因新型真核表达载体的构建及鉴定

目的构建人组织型纤溶酶原激活因子(tPA)基因的新型真核表达载体,为血栓性疾病的基因治疗奠定基础。方法将tPA基因克隆到真核表达载体pcDNA3.1MycHisB()中,进行酶切鉴定及DNA测序分析,并将携带有tPA基因的该真核表达载体,通过脂质体介导,转染鼠血管平滑肌细胞,底物发色法测定转基因血管平滑肌细胞tPA活性。结果经双酶切鉴定和测序证实已将tPA基因DNA片段正确插入到真核表达载体中,并能在真核细胞中表达、分泌有活性的tPA。结论成功构建pcDNA3.1MycHisB()/tPA基因新型真核表达载体。     

五羟色胺-N-乙酰转移酶基因真核表达载体的构建、表达及活性检测

目的构建pTARGET^TM—AANAT真核表达载体并转化L6成肌细胞，检测目的基因的表达并初步探讨AANAT转基因细胞的生物活性。方法提取大鼠松果体组织mRNA，RT-PCR技术扩增五羟色胺-N-乙酰转移酶基因（AANAT）cDNA，酶切连接pTARGET^TM载体，脂质体法导入L6成肌细胞。倒置显微镜观察转化细胞体外存活、RT-PCR及Western blotting技术检测pTARGET^TM-AANAT的基因表达产物及转化细胞的功能表达。结果酶切分析、DNA测序及凝胶电泳检测结果证实，pTARGET^TM-AANAT真核表达载体构建成功。RT-PCR及Western blotting检测表明，转化后的L6细胞表达AANAT mRNA，细胞具备AANAT蛋白的表达能力。结论成功构建pTARGET^TM-AANAT的真核表达载体，转化的L6细胞株能表达AANAT蛋白活性。     

Construction and Expression of Eukaryotic Expression Vector and Plasmid Expressing siRNA of Human Protection of Telomeres 1

1 IntroductionThe POT1 (protection of telomeres 1) protein binds the single-stranded overhang at the ends of chromosomes in diverse eukaryocytes. It is essential for chromosome end-protection in the fission yeast Schizosaccharomyces pombe, and it is involved in regulation of telomere length in human cells. Human POT1 had been identified in 2001 year. Its amino terminal is highly conservative in eukaryocytes. Since Pot1 can bind internal loops and directly adjacent DNA-binding sites, it is…     

Construction and Expression of Eukaryotic Expression Vector and Plasmid Expressing siRNA of Human Protection of Telomeres 1

1 Introduction The POT1 (protection of telomeres 1 ) protein binds the single-stranded overhang at the ends of chromosomes in diverse eukaryocytes. It is essential for chromosome end-protection in the fission yeast Schizosaccharomyces pombe, and it is involved in regulation of telomere lengthin human cells. Human POT1 had been identified in 2001year. Its amino terminal is highly conservative in eukaryocytes. Since Pot1 can bind internal loops and directly adjacent DNA-binding sites, it is likely to fully coat and protect both G-strand overhangs and the displaced G strand of a T-loop. It also participates in the regulation of telomere maintenance by telomerase or of chromosome by other enzymes. But its biological function and mechanism are still unknown. hPOT eukaryotic expression vector(pcDNA3- hPOT1 ) and 3 kinds of siRNA expression vectors(pmU6-shDNA1, pmU6-shDNA2 and pmU6-shDNA3)had been constructed. And there were overexpression and RNA silence in HeLa cells.     

IFITM3真核表达载体的构建和细胞内定位研究

目的构建人干扰素诱导的跨膜蛋白3(IFITM3)的真核表达载体并观察其表达产物的细胞内定位,以研究IFITM3的蛋白功能及作用机制。方法提取人外周血淋巴细胞mRNA,行RT-PCR扩增IFITM3编码序列并经琼脂糖凝胶电泳鉴定片段大小,PCR产物及真核表达载体pEGFP-C2经酶切、连接、转化入Top10菌株进行筛选和扩增,重组的pEGFP-C2-IFITM3载体用酶切及DNA测序鉴定其插入序列的正确性,进而转染该重组真核表达载体进入sy5y细胞,倒置荧光共聚焦显微镜观察融合蛋白在细胞内定位。结果琼脂糖凝胶电泳显示经RT-PCR的扩增产物与IFITM3编码区的实际长度相吻合,重组入绿色荧光载体pEGFP-C2的pEGFP-C2-IFITM3经酶切和测序显示实际连入的DNA片段大小、序列及读码框均正确。经真核表达后,重组蛋白定位于细胞膜和在细胞内存在颗粒样聚集。结论成功构建IFITM3的真核表达载体,该载体表达的IFITM3融合蛋白在细胞内定位清晰,为后续的IFITM3功能研究奠定了基础。     

HBsAg真核表达质粒的构建和鉴定

目的 构建HBsAg真核表达质粒。方法 用PCR的方法从质粒pEcob6中扩增出HBsAg基因，并定向克隆到真核表达质粒pcDNA3．1( )，构建成重组质粒pcDNA3.1—S；然后用限制性内切酶消化和DNA序列测定鉴定结果经酶切和DNA序列测定鉴定，证实重组质粒构建正确。结论 真核表达质粒pcDNA3．1—S构建成功。     

HBsAg真核表达质粒的构建和鉴定

目的构建HBsAg真核表达质粒.方法用PCR的方法从质粒pEcob6中扩增出HBsAg基因,并定向克隆到真核表达质粒pcDNA3.1(+),构建成重组质粒pcDNA3.1-S;然后用限制性内切酶消化和DNA序列测定鉴定.结果经酶切和DNA序列测定鉴定,证实重组质粒构建正确.结论真核表达质粒pcDNA3.1-S构建成功.     

人p27^kip1基因的克隆及其真核表达载体的构建

目的克隆人p27^kip1基因并构建其真核表达载体，为进一步研究其功能奠定基础。方法根据p27^kip1已知序列设计引物，分别在上下游引入Mlu I和Spe I酶切位点，从人肾脏组织中提取总RNA，经逆转录PCR得到cDNA，亚克隆入携带GFP报告基因的pWPXL真核载体中，经筛选获得正确的克隆，并通过双酶切凝胶电泳及测序鉴定。将成功构建的质粒在脂质体介导下转染肾癌786．0细胞，并通过RT—PCR及Western-blot检测表达情况。结果克隆了人p27^kip1基因，与GenBank中序列比对无误；真核表达载体经酶切鉴定表明为正确重组子，成功构建了真核表达载体。转染肾癌786-0细胞48h后，p27^kip1蛋白出现高表达。结论成功克隆了p27即基因，构建了其真核表达载体并在肾癌细胞中成功表达，为p27^kip1在肾肿瘤中的进一步研究提供了工作基础。     

人β-神经生长因子基因真核细胞表达载体的构建与鉴定

目的构建人β-神经生长因子基因(β-NGF)的真核细胞表达载体,为运用进行基因治疗和细胞移植的研究奠定基础。方法采用RT-PCR方法从人脑肿瘤旁组织的mRNA中扩增人β-神经生长因子的基因片段,将目的基因、真核表达载体pcDNA3同时经HindⅢ和Apa双酶切、纯化、连接、转化及筛选而构建重组载体pcDNA3-β-NGF;经酶切和测序对重组体进行分析和进一步鉴定。结果RT-PCR产物琼脂糖电泳结果显示：在预期位置有阳性条带。重组载体经酶切、测序等分析插入的基因片段为表达β-NGF的基因。结论人β-NGF基因重组真核细胞表达载体pcDNA3-β-NGF构建成功,为进一步开展β-NGF基因治疗脑部疾患、脊髓损伤修复等研究奠定基础。