人乳头瘤病毒16型晚期基因L1的原核表达质粒的构建和鉴定

目的 构建人类乳头瘤病毒（ＨＰＶ）１６型晚期基因Ｌ１的原核表达质粒,以期从中选出能够高效表达ＨＰＶ１６Ｌ１的重组子,为进一步表达Ｌ１蛋白奠定基础。方法 应用定向克隆策略,将ＨＰＶ１６Ｌ１基因分别克隆到原核表达载体ｐＴｒａｃ９９Ａ和ｐＥＴ－２１ｃ中。结果 通过酶切鉴定选出了重组子ｐＴｒｃ９９Ａ－ＨＰＶ１６Ｌ１和ｐＥＴ－２１ｃ－ＨＰＶ１６Ｌ１。结论 ＨＰＶ１６Ｌ１的原核表达质粒构建成功。     

人乳头瘤病毒16型L1的表达、病毒样颗粒组装及其免疫原性研究

目的 在原核表达系统中表达HPV16 L1蛋白,纯化后在体外自组装成VLPs并鉴定。方法 优化GenBank中HPV16 L1基因序列并截短C末端25个氨基酸,构建至原核表达载体pET-28a上,获得重组表达载体pET28a-16L1△C25。采用镍亲和层析法纯化超声上清,于体外解组装-重组装HPV16 VLPs,采用动态光散射和透射电镜进行形貌分析,纯化后于第0、2和4周免疫小鼠,假病毒中和试验检测HPV16 VLPs免疫后血清中和抗体。结果 双酶切和测序结果表明成功构建pET28a-16L1△C25重组质粒,诱导表达后,经SDS-PAGE和Western blotting分析显示表达的L1蛋白大部分以可溶性形式存在,纯化后的蛋白样品于体外重新组装,动态光散射和透射电镜能够观察到形态与天然病毒颗粒相似的VLPs,第6周小鼠血清中和抗体滴度Log10平均值达到4.43。结论 利用原核表达系统成功表达了截短型HPV16 L1蛋白,并于体外组装成结构完整的VLPs,且具有较好的免疫原性,为低成本HPV预防性疫苗的研发奠定基础。     

幽门螺杆菌L型和HPV16、18感染在人食管癌中同步检测的对比分析

目的研究幽门螺杆菌L型(Hp-L型)和HPV16、18感染与人食管癌的关系,探讨Hp-L型致癌机制。方法应用革兰染色和免疫组化染色技术,对112例食管鳞癌和30例对照组进行Hp-L型和HPV16、18同步检测。结果革兰染色L型检出率(67.9％)与对照组(26.7％)有显著性差异(P＜0.05);与免疫组化Hp-L型抗原检出阳性率(65.2％)无显著性差异(P＞0.05)。Hp-L型检出阳性事为61.6％(69／112)。HPV16、18表达阳性率为69.6％,与Hp-L型检出阳性率无显著性差异(P＞0.05);Hp-L型和HPV16、18同时阳性者占59.8％(67／112)结论Hp-L型和HPV16、18感染与食管癌发生相关。Hp-L型感染可能是食管癌除病毒之外的又一生物性致癌因素。     

人乳头瘤病毒与消化道肿瘤

一般认为，人乳头瘤病毒与生殖系肿瘤有关，但目前不少研究发现，人乳头瘤病毒也与生殖系以外的肿瘤有关。本文对人乳头瘤病毒与消化道肿瘤的关系研究作一综述。     

人乳头瘤病毒16亚型LAMP检测法的建立

目的本研究旨在建立一种简单、快速、灵敏的检测方法,使环介导等温扩增技术(LAMP)应用于HPV16亚型的检测。方法根据Gen Bank登录的HPV16亚型序列(FJ610152)中E7基因序列设计了多套特异引物,通过LAMP real-time Turbidimeter仪对HPV16亚型的LAMP引物进行筛选并对反应体系和反应条件进行检测和实时监控以检测其特异性和敏感性。反应结束后加入SYBR Green I染料肉眼判定并与仪器检测结果进行比对。结果建立的LAMP方法在61℃下可对HPV16核酸进行高效扩增,反应结束后加入染料肉眼判定结果与Real-time Turbidimeter仪检测结果一致;该方法具有较强的特异性和较高的敏感性(最低检出限量为3.0×103 copies/μL)。LAMP法与HPV分型试剂盒对35份样品的检测结果一致。结论本研究建立的可视化LAMP方法操作简便,适用于HPV16的快速检测。     

人乳头状瘤病毒E2蛋白相关疫苗的研究进展

人乳头状瘤病毒（HPV）感染与生殖器疣、生殖器肿瘤的发生有关,95％以上的宫颈癌伴有HPV感染。HPV基因组分为长控区（LCR）、早期区（E区）和晚期区（L区）,其中E区基因分别编码早期蛋白质E1、E2、E4、E5、E6和E7。目前的HPV治疗性疫苗主要是针对E6、研的重组基因疫苗。然而,在癌前病变中眩呈高表达,E6、E7则呈低表达。     

宫颈人乳头瘤病毒感染快速检测方法及其临床意义

目的研究宫颈人乳头瘤病毒(HPV)感染的快速检测方法及其临床意义。方法选择十堰市2 000例于医院就诊的女作为观察对象,采取PCR-DNA杂交技术检测所有妇女的宫颈标本,并对不同年龄、不同程度宫颈病变者进行HPV分型与检测。结果发生HPV感染者663例,其阳性率为33.2%。感染者中宫颈光滑以及轻度糜烂的患者132例(19.9%),中重度糜烂531例(80.1%),检出包括HPV16。HPV18等在内的13类高危基因型562例(84.8%);低危基因型包括HPV11等在内的4种基因81例(12.2%),另外还有包括HPVCP8304等在内的3种常见基因亚型20例(3.0%)。其发病高峰在26～33岁,具有明显差异(χ2=132.525,P=0.001)。结论十堰市HPV感染与宫颈病变严重程度呈正比,高危亚型呈较为明显趋势。通过检测HPV感染程度不及时发现宫颈病变,做到早发现、早诊断、早治疗。     

人乳头瘤病毒与结直肠癌的关系

随着分子生物学技术的进步,有关人乳头瘤病毒（ｈｕｍａｎｐａｐｉｌｌｏｍａｖｉｒｕｓ,ＨＰＶ）与肿瘤关系的研究也得到了迅速的深入和发展．越来越多的证据表明,ＨＰＶ与人类许多严重疾病,特别是癌症等有着密切关系．已经肯定ＨＰＶ在宫颈癌［１］、肛周癌［２］、ＡＩＤＳ病［３］、口腔癌［４］等疾病发生、发展过程中起着重要的作用．在消化道肿瘤中,ＨＰＶ与食管癌的关系,呈现一定的区域性特点：即在食管癌高发区如中国、南非等,ＨＰＶ是食管癌的高危因素;而在食管癌低发区如西欧、北美等,ＨＰＶ与癌相关性较差［５］．近年…     

人乳头瘤病毒液态芯片基因分型和人乳头瘤病毒E6/E7 mRNA检测的应用比较

目的研究人乳头瘤病毒(HPV)液态芯片基因分型与HPV E6/E7 mRNA检测在宫颈癌早期筛查、预后、治疗中的应用。方法对680例患者进行HPV基因分型及E6/E7 mRNA检测,评价这两种方法对宫颈癌早期诊断、病变程度的效能。结果 HPV液态芯片基因分型阳性检出率为79.6%,HPV E6/E7 mRNA检测阳性检出率为35.3%,两种方法阳性检出率差异有统计学意义;在3个宫颈病理细胞学分级中,HPV液态芯片基因分型与HPV E6/E7 mRNA检测的阳性检出率、敏感性、特异性、阳性预测值均具有统计学差异。结论宫颈癌筛查中,结合HPV液态芯片基因分型和HPV E6/E7mRNA检测对临床诊疗、疾病预后具有很好的价值。     

鼠抗人醛脱氢酶1A1单克隆抗体的制备与鉴定

醛脱氢酶1A1（ALDH1A1）是醛脱氢酶家族的成员之一，以同源四聚体的形式存在，定位于细胞质，在肝脏、胰腺、生殖器和皮肤成纤维细胞中高表达。ALDH1A1具有视网膜脱氢酶、醛脱氢酶（NAD）、氧化还原酶活性，参与体内多种醛类代谢，氧化不同的脂肪族醛和芳香族醛变成相对应的羧基酸，并具有电子传递及药物解毒的功能。目前市售的抗ALDH1A1抗体均为多克隆抗体，我们在成人抗肝脏胞质蛋白单克隆抗体（mAbs）库的建立过程中，应用细胞质总蛋白免疫BALB／c小鼠得到多株mAbs，其中1株经鉴定确认为鼠抗人ALDH1A1单克隆抗体，并对其特异性进行了鉴定，为进一步研究ALDH1A1的功能提供了特异性检测工具。[第一段]     

高迁移率族蛋白1在急性坏死性胰腺炎伴器官功能损害中的作用及其抗体的保护作用

目的 探讨高迁移率族蛋白1(HMGB1)在急性坏死性胰腺炎(ANP)伴器官功能受损发生过程中的作用.方法 雄性ICR小鼠按数字表法随机分为对照组、ANP组和HMGB1单抗处理组(抗体组).采用20％L-精氨酸腹腔注射制备小鼠ANP模型,抗体组于建模成功后即刻给予腹腔内注射HMGB1单抗200 μg.制模后12、24、48 h分批处死小鼠,取血检测血清淀粉酶活性及肝、肾功能指标,ELASA法检测血HMGB1水平,取胰腺及肝脏组织行常规病理检查并评分,实时荧光定量PCR法检测胰腺和肝脏组织HMGB1 mRNA表达.结果 对照组、ANP组、抗体组12 h时的血清HMGB1水平分别为(9.09±1.03)、(25.04±4.30)、(16.84 ±4.27) μg/L;胰腺病理评分为(1.50±0.55)、(4.33±0.52)、(3.03±0.32)分;胰腺组织HMGB1 mRNA表达量为0.48 ±0.18、7.53 ±2.71、3.26 ±2.33;肝脏组织HMGB1 mRNA表达量为-1.23±0.37、0.15 ±0.65、-1.27 ±0.72.ANP组的上述指标均显著高于对照组(P值均＜0.05),而抗体组均显著低于ANP组(P值均＜0.05).造模后24 h血清HMGB1水平与胰腺病理评分呈线性正相关(r=0.768,P＜0.05).此外,各组血清淀粉酶、谷草转氨酶、谷丙转氨酶、乳酸脱氢酶、尿素氮、肌酐水平的变化趋势同血清HMGB1的变化,血清HMGB1水平与肌酐、尿素氮、谷丙转氨酶水平呈线性正相关(r值分别为0.824、0.719、0.590,p值均＜0.05).结论 HMGB1可能是ANP小鼠体内炎症反应和器官功能损害的关键因子,外源性给予其抗体可减轻ANP时胰腺及其他器官功能受损程度.     

单抗MGb1的噬菌体呈现型ScFv片段的制备

目的 制备胃癌单抗ＭＧｂ１的噬菌体呈现型单链可变区片段（ＳｃＦｖ）,为获得用于胃癌体内诊疗研究的靶向载体分子奠定基础。方法 从杂交瘤细胞分离ｍＲＮＡ,扩增抗体重,轻链可变区（ＶＨ和ＶＬ）ｃＤＮＡ,经ｌｉｎｋｅｒＤＮＡ连接形成ＳｃＦｖ ＤＮＡ。将ＳｃＦｖＤＮＡ与ｐＣＡＮＴＡＢ５Ｅ的连接产物转化于大肠杆菌ＴＧ１,经Ｍ１３ＫＯ７感染后,获得重组噬菌体抗体ＳｃＦｖ。经亲和筛选和ＥＬＩＳＡ检测获得呈现ＭＧｂ     

单克隆抗体SC3A在胃癌及癌前病变的表达意义

目的研究单克隆抗体ＳＣ３Ａ在胃癌及癌前病变的表达意义．方法应用免疫组化ＡＢＣ法及粘液组化染色检测１０１例胃良恶性病变组织中ＳＣ３Ａ的表达．结果胃癌７１例中ＳＣ３Ａ阳性５７例（８０３％），但与癌组织类型、分化程度、转移及术后生存率无明显关系．ＳＣ３Ａ阳性率在酸性粘液（＋）组胃癌明显高于酸性粘液（－）组（９０２％对２００％，Ｐ＜００１），硫酸粘液（＋）组胃癌明显高于硫酸粘液（－）组（９１３％对６００％，Ｐ＜００１）．而且癌旁肠化硫酸粘液阳性率明显较良性病变伴肠化高（８８９％对３５３％，Ｐ＜００１）；硫酸粘液（＋）组肠化ＳＣ３Ａ阳性率明显高于硫酸粘液（－）组（６０９％对３１３％，Ｐ＜００５）．结论单克隆抗体ＳＣ３Ａ的表达对胃癌诊断及组织发生探讨有一定意义．     

Human papillomavirus 16 E6 is associated with the nuclear matrix of esophagesl carcinoma cells

AIM: To explore the etiologic role of HPV infection in esophageal carcinoma, and the association of HPV-16 E6with the nuclear metrix of carcinoma cells. METHODS: Two esophageal carcinoma cell lines, EC/CUHK1 and EC/CUHK2, were tested for HPV-16 E6subgenetic fragment by polymerase chain reaction amplification of virus DNA associated nuclear matrix. RT-PCR and immunocytochemistry were also used to visualizethe expression of E6 subgene in the cells. RESULTS: The HPV-16 E6 subgenetic fragment wes found to be present in nuclear metrix-associeted DNA, E6oncoprotein localized in the nucleus where it is tightly associated with nuclear matrix after sequential extraction in EC/CUHK2 cells. It was not detected, however, in EC/CUHK1 cells. CONCLUSION: The interaction between HPV-16 E6 and nuclear matrix may contribute to the virus induced carcinogenesis in esophageal carcinoma.     

抗人胃癌相关蛋白GCRG213多克隆抗体的制备鉴定及初步应用

目的 制备胃癌相关蛋白GCRC213的多克隆抗体. 方法在大肠杆菌中表达Thioredoxin/GCRG213融合蛋白,并以所获蛋白免疫新西兰白兔,制备兔抗GCRG213的抗体.酶联免疫吸附测定(ELISA)、Western blot法鉴定抗体的效价及特异性.免疫组化染色观察GCRG213在胃癌和止常组织中的表达. 结果在大肠杆菌中高效表达出相对分子质量(Mr)约为29 400的thioredoxin/GCRG213融合蛋白,经凝胶回收法得到纯度近100%的蛋白产品.制备兔抗GCRG213抗体.ELISA法检测抗体的效价达到1:256 000.Western blot证实该抗体可与原核表达的GCRG213蛋白特异性结合.免疫组化染色显示GCRG213在胃癌组织中的表达明显强于正常胃黏膜组织. 结论兔抗GCRG213抗体的成功制备,为进一步研究GCRG213的牛物学功能及其在胃癌发牛发展中的作用奠定了基础.