人Flt3配体基因的克隆及其在CHO细胞中的表达

目的 克隆人Flt3配体(Flt3 LIg and,FL),并在CHO细胞中进行表达.方法 从健康人外周血中提取总RNA,通过RT-PCR技术,扩增Flt3配体胞外区cDNA功能性片段,经DNA测序证实后,将得到的片段基因插入pcDNA3.0表达载体,构建了pcDNA3.0-FL真核表达载体;将重组质粒pcDNA3.0-FL转染CHO细胞,经G418筛选出阳性细胞克隆,扩大培养,提取细胞总蛋白,用SDS-PAGE分离并Western blotting检测到在相对分子质量约24 000处有一显色条带.结果 FL胞外区cDNA被正确克隆到真核表达载体pcDNA3.0中并在CHO细胞中成功表达.结论 成功构建了真核表达载体pcDNA3.0-FL并在CHO细胞中成功表达,为FL的相关研究和应用开发奠定了基础.     

Flt3配体潜在的临床应用前景

Flt3配体是新近克隆的早期造血生长因子,具有刺激造血和调节免疫的双重作用,在造血干细胞动员、保护大剂量放化疗对骨髓的损伤、激发有效的抗肿瘤免疫、诱导主动的移植免疫耐受和调节肠道黏膜免疫等多个方面均有很好的临床应用前景.     

腺病毒介导的小鼠Flt3配体抗肝癌基因治疗的研究

目的　观察腺病毒载体介导的小鼠Flt3配体 (mFL)对小鼠肝癌的基因治疗效果。方法　腺病毒体外感染小鼠肝癌细胞株Hepa1 6 ,4 8h后 ,用绿色荧光蛋白的表达检测感染的效率 ,ELISA检测培养上清中mFL的表达量 ,每天细胞计数 (连续 14d)观察细胞的生长曲线。建立小鼠肝癌模型 ,肿瘤局部分别单次注射 1× 10 9表达形成单位的mFL重组腺病毒、空载体对照和PBS ,观察肿瘤大小和小鼠生存期。治疗 2 0d后 ,取肿瘤消退小鼠的脾细胞过继至正常小鼠 ,3d后接种Hepa1 6细胞 ,观察肿瘤大小 ;治疗 38d后 ,再接种Hepa1 6细胞或EL4细胞对照于肿瘤消退小鼠原接种部位的对侧 ,观察肿瘤大小并作统计学处理。结果　腺病毒体外能有效地感染靶细胞Hepa1 6 ,培养上清中mFL表达量为 80 .5ng·10 -6·2 4h-1± 7.3ng·10 -6·2 4h-1,感染后Hepa1 6的生长未受到明显抑制。瘤体内注射mFL重组腺病毒导致 90 %的小鼠肿瘤消退 ,并显著延长小鼠生存期 ;脾细胞过继能保护正常小鼠免于Hepa1 6细胞的攻击 ;再接种Hepa1 6细胞于肿瘤消退小鼠 ,未见肿瘤生长 ,而再接种的EL4细胞呈渐进性生长 ,与对照组无显著差异。结论　腺病毒介导的小鼠Flt3配体的基因治疗导致肿瘤消退 ,并能激发可过继的、特异性免疫保护反应 ,可能成为有效的肝癌基因治疗的候     

两个新的人Flt3配体差异剪接体的克隆

目的:寻找新的人Flt3配体(hFL)的差异剪接体.方法:从健康志愿者外周血中分离单个核细胞,一步法提取总RNA,逆转录成cDNA,应用胞外区特异性引物PCR扩增hFL的胞外区并克隆至真核表达质粒,进行序列测定分析.结果:序列分析发现了两个新的hFL的差异剪接体,均发生在重要的第5外显子功能域,分别在434 bp处有一个胞嘧啶的插入和在426～478 bp之间缺失了53个bp.结论:hFL存在两个新的差异剪接体,此项发现为进一步的功能研究提供了基础.     

Flt3配体修饰小鼠肝癌疫苗的制备及其体内抗肿瘤活性观察

目的:以小鼠Flt3配体(murine flt3 ligand, mFL)的重组腺病毒载体(AdmFL)体外感染小鼠肝癌细胞株Hepa1-6制备肝癌疫苗,并观察其体内抗肿瘤活性.方法:腺病毒载体体外感染Hepa1-6细胞,48 h后通过载体所携带的绿色荧光蛋白(GFP)的表达检测感染的效率;并用ELISA方法检测第0、2、4、6、8天培养上清中mFL的表达量;每天进行细胞计数(连续14 d),观察细胞的体外生长曲线;取5×106个修饰后的Hepa1-6细胞接种C57BL/6小鼠,4周后于原接种部位的对侧再接种2×106个野生型Hepa1-6或EL4细胞.结果:AdmFL能有效感染靶细胞Hepa1-6,培养上清中mFL表达量在第2天最高,达到(71.1±6.3) ng/ml,感染后Hepa1-6的体外生长未受到明显抑制;修饰后Hepa1-6细胞的体内成瘤性下降;4周后再接种Hepa1-6细胞,肿瘤生长速度明显降低;而再接种的EL4细胞呈渐进性生长,与对照组相比无显著差异.结论:腺病毒介导的Flt3配体基因修饰后的肝癌细胞的体内成瘤性下降,并能激发特异性免疫保护反应,是有效的肝癌疫苗.     

乙型肝炎病毒核心抗原及Flt3配体双表达核酸疫苗的构建与体外表达

目的:构建可同时表达乙型肝炎病毒核心抗原(HBcAg)和Flt3配体(FL)胞外段的双表达核酸疫苗。方法:将HBcAg和FL胞外段的基因用PCR方法扩增并分别引入相应的限制性内切酶酶切位点,然后克隆入真核双表达载体pIRES,获得含双基因片段的表达质粒;再取该表达质粒中的内部核糖体切入位点(IRES)序列和基因片段克隆入pJW4303载体中,获得相应的双表达核酸疫苗,经筛选鉴定后,以293T细胞瞬时表达检测两基因的表达水平。结果:构建成功以pIRES、pJW4303为载体的4种HBcAg和FL胞外段的双表达核酸疫苗,体外表达证实HBcAg和FL胞外段均能高效表达,基因位于IRES上游时表达水平较高。结论:用IRES元件实现了HBcAg和FL胞外段双表达核酸疫苗的构建,pJW4303为载体的核酸疫苗两基因表达水平优于pIRES为载体的核酸疫苗。     

Flt3配体在急性髓系白血病化疗过程中的变化及意义

目的通过检测FLt3配体(FL)浓度在急性髓系白血病患者化疗前后的变化情况,统计分析其与白细胞数量变化的相关性。方法对48例急性髓系白血病患者进行追踪观察,于化疗前、化疗结束后5～7 d和20～30 d取外周血2,0例健康人为正常对照,应用酶联免疫吸附技术(ELISA),检测FL在白血病初治和缓解患者化疗前后浓度的动态变化。结果在急性髓系白血病初治组患者,化疗结束后5～7 d FL浓度明显大于化疗前,且明显大于对照组FL浓度([392±55.07)pg/mL,P<0.05]。在缓解组中,3个阶段的浓度差异无统计学意义(P<0.05),但明显低于对照组FL浓度(P<0.05)。并且根据直线相关分析,FL浓度与外周血白细胞数量呈明显负相关(r=-0.464,P<0.05)。结论在急性髓系白血病化疗后,FL浓度与外周血白细胞总数有一定相关性。FL浓度一定程度上反映了患者的骨髓代偿能力。     

Flt-3配体对树突状细胞融合疫苗的制备和抗结直肠癌效应的影响

目的：研究Flt-3配体对树突状细胞．结直肠癌细胞融合疫苗的制备和抗肿瘤免疫效应的影响。方法：①酪氨酸激酶受体3配体（FL）与粒细胞．巨噬细胞集落刺激因子（GM-CSF）、白细胞介素4（IL-4）、肿瘤坏死因子（TNF）联用，刺激外周血单个核细胞（PBMC）中的树突状细胞（DC）前体细胞成熟，应用聚乙烯二醇（PEG）融合技术融合DC和Lovo细胞，制备融合疫苗。②通过细胞生长曲线、细胞表面表达和细胞形态来观察细胞的生物学特性。③裸鼠体内融合疫苗的成瘤活性的检测。④MTT比色法检测肿瘤细胞体外杀伤细胞毒活性。结果：在FL的参与下，成熟DC的细胞数目及细胞形态无显著改变；CD80、CD83、CD86等在细胞表面的表达较未加FL组显著丰富；融合疫苗呈悬浮生长，具有两种亲代细胞的细胞形态结构特点，融合细胞数量较稳定，不出现明显的细胞倍增；融合疫苗接种裸鼠体内后观察30d，未见肿瘤组织生长；FL组融合疫苗对肿瘤细胞具有明显的抑制作用。结论：Flt3-L可显著促进DC的成熟；FL组融合细胞的分子表达较非FL组有很大提高，融合细胞具有作为抗肿瘤疫苗应具备的低增殖能力和不成瘤的安全性；DC与结直肠癌细胞融合后作为肿瘤疫苗在体外具有高效而特异的抗肿瘤效应，说明FL对增强融合疫苗抗结直肠癌特异性免疫效应有明显的作用。     

Flt3配体重组腺病毒感染胃癌细胞的体外研究

目的 研究Flt3配体重组腺病毒(AdmFL)体外感染前小鼠前胃癌细胞的情况。方法 体外分别以不同MOI(mutiplicity of infection)的AdmFL感染胃癌细胞,荧光显微镜下计算感染率,对体外感染后的胃癌细胞连续计数并绘制生长曲线,RT-PCR检测转染后的细胞内mRNA表达,ELISA法检测培养上清中mFl蛋白的浓度。结果 MOI为10、100、500的AdmFL感染小鼠胃癌细胞,荧光显微镜下2 d后根据GFP的表达计算的感染率分别是5％、60％和98％;以MOI为100的AdmFL对体外感染后的胃癌细胞无直接的生长抑制作用;在感染后的胃癌细胞内RT-PCR扩增到了mFL的mRNA,ELISA法检测到mFL蛋白的浓度为60.3±5.2 ng／ml。结论 Flt3配体重组腺病毒能有效地感染小鼠前胃癌细胞,并能介导所携带的mFL高效表达。     

白血病患者外周血Flt3基因表达

目的 检测白血病患者外周血Flt3在不同类型白血病中的表达及分布情况．阐明Flt3的表达与疾病发生和发展的关系,与骨髓标本Flt3的表达作对照,确定检测外周血Flt3对白血病基因诊治的临床意义。方法 采用RT—PCR方法分析34例白血病患者外周血及部分骨髓标本Flt3的表达。结果 19例急性髓系白血病患者中16例阳性（84．2％）,其中6例强阳性,1例化疗后完全缓解的M3患者Flt3表达阳性;6例急性淋巴细胞白血病中3例阳性（50％）;5例慢性淋巴细胞白血病中2例（1例慢性期,1例急变期）阳性;2例骨髓异常综合征中1例阳性;2例急性混合细胞白血病均阳性。7例骨髓与外周血配对标本中阳性率差别无统计学意义。10例正常人表达均阴性。结论 外周血可以替代骨髓作为检测Flt3表达;急非淋患者Flt3表达强弱与外周血白细胞数相关（P〈0．05）;Flt3表达可作为白血病基因诊断及微小残留病灶的检测标志。     

Flt3l与肿瘤关系的研究进展

酪氨酸激酶受体3配体(Fms-like tyrosine kinase 3 ligand,Flt3l)是新发现的一种细胞因子.该因子与fms样酪氨酸激酶受体3 (fms-like tyrosine kinase 3 receptor,Flt3R)特异性结合,可促进多种干细胞、血细胞及其前体细胞的生成与分化.     

鼻腔黏膜免疫佐剂鞭毛蛋白的研究进展

疫苗接种是预防传染病最为有效的措施。鉴于大多数病原主要通过黏膜途径感染机体,预先在黏膜表面建立有效的免疫应答是预防病原入侵的最佳方式。鼻腔免疫是一种高效、无痛的黏膜免疫途径,既可诱导系统免疫应答,又能诱导广泛的黏膜免疫应答。然而,大多数疫苗尤其是亚单位疫苗经鼻腔接种后难以诱导有效的黏膜免疫应答,需要借助佐剂的辅助作用。佐剂是一种非特异性免疫增强剂,通过激活天然免疫来增强适应性免疫应答从而达到提高疫苗保护效力的目的,是疫苗尤其是亚单位疫苗的重要组成部分。鞭毛蛋白作为鼻腔黏膜免疫佐剂的效应已被广泛证实：在增强系统免疫应答的同时,还能增强黏膜应答,尤其是分泌型IgA的产生。该文就鞭毛蛋白的分子结构、诱导的信号通路、作为疫苗佐剂的应用及机制方面的研究进展作一综述。     

树突状细胞抗肿瘤作用研究进展

树突状细胞(dendritic cell,DCs)是体内最有效的专职抗原递呈细胞(antigen presenting cell,APC),是识别病原侵入的第一道防线.机体的免疫识别首先由DCs捕获、加工和处理抗原,再将抗原递呈给T、B淋巴细胞,从而引发一系列免疫应答,在体内发挥强大的免疫监视功能[1].近年来,DCs在抗肿瘤免疫中所发挥的重要作用日益受到人们的重视.随着对DCs肿瘤抗原识别、摄取、加工处理及提呈的分子基础和作用机制的进一步阐明,以DCs为基础的肿瘤疫苗治疗得到快速发展.目前在DCs疫苗抗肿瘤实验研究和临床研究方面已取得了令人振奋的进展,显示了广泛的应用前景.     

RT-PCR法检测白血病干细胞Flt3和N-ras基因的表达

目的：采用逆转录一聚合酶链反应（RT-PCR）法检测益气养阴方及其拆方后的扶正方组、祛邪方组急性白血病干细胞Fh3和N-ras基因的表达,以期阐明Flt3和N-ras基因表达与疾病发生、发展的关系。方法：RT-PCR法检测中药益气养阴方组、扶正方组、祛邪方组及对照组AML患者骨髓单个核细胞Fh3和N-ras基因表达的情况。结果：Fh3和N-ras基因表达阳性率益气养阴组、扶正组、祛邪组与对照组比较,差异有显著性意义（P均〈0．01）;益气养阴组与扶正组和祛邪组比较,差异有显著性意义（P均〈0．01）;扶正组与祛邪组比较,差异无显著性意义（P〉0．05）;各FAB亚型AML间Fh3与N-ras表达阳性率比较,差异无显著性意义（P〉0．05）。结论：中药益气养阴方可降低Flt3和N-ras基因在AML细胞的表达水平,抑制AML细胞的克隆性增殖,对AML具有治疗作用。     

Flt3、c-kit和SHP-1基因在急性白血病中的作用

目的探讨Flt3、造血细胞磷酸酶（SHP-1）基因与原癌基因c-kit在髓系白血病患者中的表达以及其与白血病发生和预后的关系。方法用半定量逆转录-聚合酶链反应法检测52例髓系白血病患者（实验组）及33例正常对照组Flt3、SHP-1与c-kitmRNA表达。结果急性髓系白血病（AML）患者的Flt3及c-kit平均表达水平高于对照组,SHP-1平均表达水平均低于对照组（P〈0.05）;34例初治AML患者中,Flt3＋及c-kit＋的完全缓解率低于Flt3-及c-kit-者,而SHP-1则相反。结论Flt3、c-kit对于白血病的转归、预测白血病的复发、监测微小残留病变有重要的意义,SHP-1可能作为潜在的抑癌基因与Flt3、c-kit基因参与白血病的发生。     

Flt3基因突变与急性髓系白血病发生和预后的关系

Fms样酪氨酸激酶3（Fms-like tyrosine kinase3,Flt3）是Ⅲ型受体型酪氨酸激酶（receptor tyro-sine kinase,RTK）家族成员之一,在正常造血及免疫系统发育中起着重要作用。Fh3基因突变与急性髓系白血病（acute myelogenous leukemia,AML）的发生、预后密切相关。以Flt3作为靶分子已成为AML治疗的一种新策略。     

Flt3的原核表达、纯化及多克隆抗体制备

Flt3(fms-like receptor tyrosine kinases)又称FLK-2(foetal liver kinase2)、STK-1(stem cell tyrosine kinase 1),为Ⅲ型受体酪氨酸激酶(receptor tyrosine kinases,RTK)成员之一,在血细胞中表达仅限于造血干/祖细胞表面,与其配体在正常造血及免疫系统发育中起重要的调节作用.     

组胺H3受体配体研究进展

目的 阐述组胺H3受体配体的研究进展.方法 结合国内外文献简述组胺H3受体配体及其构效关系的发展,组胺H3受体配体的治疗应用前景以及H3受体配体发展的新方向.结果与结论 选择性的H3受体激动剂及桔抗剂具有广泛的生物活性,是目前抗组胺药物研究开发中的一个新的热点领域,随着对H3受体配体研究的深入,极有希望开发出可用于临床的新药.     

pIRES2-FL-IL-3转染协同促进脐血干细胞增殖的研究

目的观察真核共表达质粒载体pIRES2-FL-IL-3转染对脐血干细胞增殖的影响及目的蛋白IL-3和FL（Flt3 ligand）的表达变化。方法分为4组：空白对照组（对照组）、pIRES2-IL-3组（IL-3组）、pIRES2-FL组（FL组）和pIRES2-FL-IL-3组（共表达组）。通过台盼蓝染色及MTT法检测pIRES2-FL-IL-3转染（共表达组）对脐血干细胞细胞存活率及增殖的影响,RT-PCR技术、Western blot技术检测脐血干细胞FL和IL-3的mRNA水平和蛋白表达。结果共表达组细胞存活率无显著变化（P〉0．05）,MTT法检测细胞增殖显著高于对照组,共表达组IL-3及FL mRNA水平和蛋白均显著高于对照组,并且高于IL-3组和FL组。真核共表达质粒载体pIRES2-FL-IL-3转染脐血干细胞后细胞存活率无显著变化（P〉0．05）,结论脐血干细胞增殖显著增强,目的蛋白能得到有效表达。     

Flt3配体在肿瘤免疫治疗中的应用

肿瘤是一类严重威胁人类健康和生命的疾病,因此,有关肿瘤早期诊断和治疗一直是科学研究的热点问题。近年针对肿瘤患者的免疫监视功能缺损,以提高树突状细胞（DC）、T细胞及NK细胞介导的肿瘤免疫治疗为策略的癌症治疗方法已经取得了多项进展,基于Flt3配体(FL)免疫治疗就是其中之一。FL是主要表达于造血干细胞/祖细胞上的Ⅲ型酪氨酸激酶受体Flt3的配体,是一种与早期造血调控有关的生长因子。FL联合其他细胞因子,能够在体内外显著地扩增DC,刺激T细胞和NK细胞增殖,为肿瘤免疫治疗提供了良好的基础。目前采用FL治疗乳腺肿瘤、前列腺肿瘤、颅内肿瘤等,已经显示了其在肿瘤免疫治疗领域中的良好临床应用前景。