TaqMan探针法荧光定量PCR检测食品中金黄色葡萄球菌

目的:建立食品中金黄色葡萄球菌快速、简便、准确、高效的检测方法。方法:以金黄色葡萄球菌FemB基因中保守序列为目标,设计并合成引物和Taqman探针,构建重组质粒作为标准阳性模板,建立荧光定量检测体系,并考察该方法的灵敏性、特异性和重复性。结果:该法的灵敏度60拷贝/反应体系,能特异区分金黄色葡萄球菌与其它类型的细菌,同时,具有良好的重复性。结论:使用Taqman探针法荧光定量PCR技术能够对金黄色葡萄球菌进行快速准确地定量检测。     

多重荧光定量PCR检测沙门菌、志贺菌和金黄色葡萄球菌

目的基于SYBR Green I染料建立沙门菌、志贺菌和金黄色葡萄球菌的多重荧光定量PCR检测方法。方法针对沙门菌invA基因、志贺菌ipaH基因和virA基因、金黄色葡萄球菌nuc基因和femA基因片段设计引物,根据Tm值的差异分析确定荧光定量PCR扩增的靶基因和特异性引物,通过优化PCR反应体系,建立了用SYBR GreenⅠ多重荧光定量PCR熔解曲线来检测多种致病菌的方法。结果该方法检测的菌液灵敏度分别是沙门菌168 CFU/ml,志贺菌136CFU/ml,金黄色葡萄球菌1240CFU/ml,特异性强,整个过程只需要2h。结论该方法能快速、灵敏、特异检出沙门菌、志贺菌和金黄色葡萄球菌。     

实时荧光定量PCR检测耐甲氧西林金黄色葡萄球菌方法的建立与应用评价

目的利用实时荧光定量PCR技术,建立快速敏感特异的检测耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)的方法。方法以MRSA mecA基因为靶序列设计引物和探针,以自MRSA中提取的DNA为模板,优化引物、探针的浓度和退火温度,同时验证方法的特异性、敏感性、重复性、灵敏度和线性范围,并与K-B法和微量琼脂稀释法(MIC)相比较。结果建立的反应体系在上游引物、下游引物浓度为0.2 mmol/L、退火温度为55℃时,具有良好的特异性和敏感性,与大肠埃希菌等8种细菌均无交叉反应;对MRSA检测的灵敏度达到10 CFU/ml。结论建立的实时荧光PCR方法特异、灵敏、快速,能对MRSA做出快速准确的报告,实现准确、快速和定量检测。     

荧光PCR方法快速检测食物中毒标本中的金黄色葡萄球菌

目的快速检测食物中毒标本中的金黄色葡萄球菌。方法采集到的肛拭子和剩余食物标本直接进行金黄色葡萄球菌荧光定量PCR检测，并做分离培养。结果从采集到的肛拭子和剩余食物标本分离到金黄色葡萄球菌，而且PCR检测结果阳性。结论金黄色葡萄球菌是此次食物中毒的病原体。     

EMA-qPCR检测金黄色葡萄球菌活菌方法的建立

目的利用叠氮溴乙锭(EMA)结合实时荧光定量聚合酶链反应(qPCR)技术,建立快速、定量检测金黄色葡萄球菌活菌的方法。方法菌悬液72℃水浴,每隔1 min取样计数,用不同浓度EMA作前处理后进行qPCR反应,选择最佳处理浓度和曝光时间,样品10倍梯度稀释后做叠氮溴乙锭-实时荧光定量聚合酶链反应(EMA-qPCR),结合平板计数法探索该方法的灵敏度,用表皮葡萄球菌、副溶血性弧菌、福氏志贺菌等验证该方法的特异性,将模拟样品用2种方法检验并比较。结果水浴14 min及以上能完全杀死活菌,EMA处理浓度≥2μg/mL时PCR结果判定为阴性,曝光时间对实验结果影响不大,菌量的对数值与循环阈值(Ct)有较好的线性关系,且y=-3.59x+40.59,R2=0.988。理论上该方法的最低检测浓度约为36.3 CFU/mL,非金黄色葡萄球菌的Ct值均>35或无Ct值,普通qPCR实验结果 Ct值均低于EMA-qPCR实验结果。结论 EMA-qPCR是一种快速、灵敏度较高、特异性强且能分辨死活金黄色葡萄球菌的方法。     

应用实时荧光PCR技术检测金黄色葡萄球菌肠毒素基因

目的:建立一种简便、特异的荧光PCR检测方法,用于金黄色葡萄球菌肠毒素的检测。方法:按金黄色葡萄球菌SEA～SEE型肠毒素基因序列设计引物,在普通PCR检测体系中,加入SYBR Green I荧光染料,建立荧光PCR检测体系。结果:46株金黄色葡萄球菌中检出22株携带肠毒素基因,阳性率为47.83%。以SEA、SEB检出率较高,分别为31.82%和27.27%;不同来源的分离株携带肠毒素基因的比例不同,同时携带2种及以上毒素基因的菌株占27.27%。结论:荧光PCR检测金黄色葡萄球菌肠毒素的方法具有快速、敏感、特异性高的特点,适用于肠毒素基因的分型与分布的研究,适合基层疾控部门使用。     

实时定量PCR检测人全血中金黄色葡萄球菌DNA方法的建立

目的建立实时定量PCR（RQ—PCR）快速检测人全血中金黄色葡萄球菌DNA的方法,以便早期定量评估肠屏障损伤所致肠道内细菌移位引起或加重的全身感染。方法对15份模拟全血标本及26份外科发热患者全血标本进行RQ—PCR检测。选择金黄色葡萄球菌高度保守的看家基因femA基因作为靶基因设计引物和Taqman探针,建立20ul的RQ—PCR反应体系,采用含靶基因扩增片段的重组质粒建立标准曲线,提取血标本中的细菌基因组DNA。结果引物和探针特异性好,检测限为10^0拷贝／ul（10^3CFU／ml）,灵敏度为99．7％,特异度为94．6％。标准曲线线性关系好,R。在0．9918—0．9997。不同浓度的金黄色葡萄球菌样本检测的平均准确性为（96．25±2．26）％,批内及批间重复性的平均变异系数分别为（8．06±0．07）％和（10．01±4．40）％。全血标本中金黄色葡萄球菌DNA平均回收率为（111．72±20．72）％。临床血标本RQ-PCR检测阳性率为15．4％（4／26）,血培养结果皆为金黄色葡萄球菌阴性。结论RQ—PCR可用于定量检测全血标本中的金黄色葡萄球菌DNA含量,具有快速、灵敏、特异性强、重复性好的优点。     

荧光探针PCR检测金黄色葡萄球菌的研究

目的 研究并建立荧光探针聚合酶链反应(PCR)技术,用于金黄色葡萄球菌(SAU)及耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)的临床检测.方法 采用标准化荧光探针PCR技术及操作流程,进行灵敏性及特异性的鉴定.结果 分析性灵敏性达到1×10 2拷贝/reaction,达到设计要求,具备高重复性;对1196例临床标本应用荧光探针PCR检测SAU,临床灵敏性为97.41％,临床特异性为98.47％,对527例SAU的临床样本进行MRSA筛查,临床灵敏性为99.74％,临床特异性为95.59％;对385份鼻腔拭子标本应用荧光探针PCR检测SAU,检出率达18.18％;对其中40株SAU进行MRSA筛查,检出率达42.50％.结论 荧光探针PCR技术检测SAU及其MRSA的方法具有较高的优越性,适合在临床检测应用.     

应用荧光定量PCR法检测金黄色葡萄球菌

目的建立一种简单、快速、准确、特异性强的能定量检测金黄色葡萄球菌的方法。方法以金黄色葡萄球菌FemB基因为靶序列,设计并合成引物和Taqman探针,优化引物与探针比例,调整镁离子浓度,对金黄色葡萄球菌进行荧光定量检测。结果引物与Taqman探针比例为1：4,镁离子为2.5mmol/L时本底最低,荧光信号最强;该法的灵敏度为1.0×103拷贝,能特异区分金黄色葡萄球菌与其他葡萄球菌。结论使用Taqman探针技术的荧光定量聚合酶链反应能够对金黄色葡萄球菌准确快速及定量检测。     

PMA-实时荧光PCR快速检测蔬果中金黄色葡萄球菌活菌

目的 将叠氮溴化丙锭（PMA）与实时荧光定量PCR（real-time PCR）技术相结合,快速检测蔬果中金黄色葡萄球菌活菌。方法 通过对影响PMA作用的关键因素,包括PMA浓度、光照时间以及活、死菌比例混合等进行试验,确定PMA的作用条件。以金黄色葡萄球菌nuc基因为靶基因,建立PMA-实时荧光定量PCR方法,并构建金黄色葡萄球菌重组质粒标准品,用于检测蔬果中金黄色葡萄球菌活菌。结果 在PMA 30 μg/ml浓度下,曝光5 min,可实现PMA筛选金黄色葡萄球菌活菌的作用。由构建的质粒标准品模板建立标准曲线表现出良好线性关系,相关系数r = 0.9995,所建立的方法灵敏度可达到14 copies /μl,且特异性良好。经2 h增菌后用PMA进行筛选,再用荧光定量PCR检测,可实现快速对蔬果样品中活的金黄色葡萄球菌的检测。结论 用PMA-实时荧光定量PCR方法可快速检测蔬果中活的金黄色葡萄球菌,可为食品安全风险监测提供可靠数据。     

多重PCR技术在检测食源性金黄色葡萄球菌 肠毒素基因中的应用

摘要:目的　金黄色葡萄球菌A、B、C、D和E型肠毒素是引起食源性疾病的主要类型,采用多重PCR技术分析食源性金黄色葡萄球菌分离株肠毒素基因携带状况。方法　以19株食源性金黄色葡萄球菌分离株为研究对象,利用多重PCR技术对核酸酶基因以及肠毒素A、B、C、D和E型基因进行检测。结果　19株菌中均检出金黄色葡萄球菌特异性核酸酶基因,与传统菌落分离培养鉴定结果一致;9株菌含肠毒素SEA基因,1株同时含SEA和SEB基因,没有检测到肠毒素C、D和E基因。结论　在19株食源性金黄色葡萄球菌分离株中,10株携带肠毒素基因,以携带肠毒素A基因为主。     

食源性金黄色葡萄球菌9种肠毒素基因的多重PCR检测

目的 建立多重PCR方法检测食源性金黄色葡萄球菌9种肠毒素基因,了解其在食源性金黄色葡萄球菌中的分布状况.方法 建立多重PCR方法检测144株食源性金黄色葡萄球菌的9种肠毒素基因,对其分布状况进行研究.结果 建立的多重PCR方法特异、高效,9种肠毒素基因在144株食源性金黄色葡萄球菌中的检出率由高到低依次为SEU (25.69％)、SEG (22.22％)、SEM (20.83％)、SEK (20.14％)、SEQ (18.06％)、SEH (15.97％)、SEN (10.42％)、SEJ (8.33％)、SEL(5.56％);52.78％的菌株含有该9种肠毒素基因中的至少1种,34.03％的菌株含有9种肠毒素基因中的两种或两种以上.结论 该多重PCR方法特异性高,快速简便,可用于金黄色葡萄球菌肠毒素基因的分布研究;144株食源性金黄色葡萄球菌中9种肠毒素基因均有检出,其中以SEU、SEG、SEM、SEK检出率较高.     

qPCR快速检测金黄色葡萄球菌及MRSA方法的建立及评价

目的建立q PCR法快速检测金黄色葡萄球菌及其mec A基因,以期快速精准诊断金黄色葡萄球菌感染及初步判断耐药情况。方法从NCBI数据库下载金黄色葡萄球菌nuc、atl、ica B、fnb A、hla、srap基因序列用于鉴定标志筛选,mec A基因序列用于MRSA标志筛选;经DNA MAN比对后,选择各基因保守区分别设计1~2套引物、探针,建立单重及双重q PCR,用临床分离株及标准菌株筛选出检测性能最好的基因片段作为检测标志物,建立金黄色葡萄球菌鉴定和耐药双重q PCR检测方法,并进行性能评价。结果经筛选,金黄色葡萄球菌atl基因(CP009361.1:1010217~1010341)、mec A基因(KF058908.1:1715~1843)两片段检测性能最优,将其作为标志物建立双重q PCR法。该方法的检测下限均低至4 copies/反应;扩增线性范围均达2.0×102~8copies/m L。335份金黄色葡萄球菌(含94份MRSA)培养阳性的患者样本中,q PCR法分别检出SA 335份,MRSA 94份;95份金黄色葡萄球菌培养阴性的患者样本中,q PCR法分别检出SA 17份,MRSA 4份,经PCR产物测序,与标准菌株同源性均≥90%。双重q PCR法从样品处理到报告结果≤2.0 h。结论 q PCR法方法简便、快速、灵敏度高、特异性好,可望提高金黄色葡萄球菌感染的诊断能力并实现快速检测,为尽早精准治疗赢得时间。     

实时荧光PCR检测耐甲氧西林金黄色葡萄球菌的研究

目的建立一种快速、准确检测耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（MRSA）的实时荧光聚合酶链反应（PCR）方法。方法收集临床诊断或疑似为败血症患者的血标本，直接提取细菌基因组DNA，确定其敏感性；以金黄色葡萄球菌nuc基因和MRSA的mecA基因为靶序列，合成引物，采用实时荧光PCR技术对上述基因进行检测，并将其结果与细菌常规培养结果对比，分析该方法检测MRSA的特异性、灵敏度、阳性预测值和阴性预测值。结果直接从血标本中提取细菌基因组DNA的灵敏度为10’CFU／mL。MRSA阳性血标本实时荧光PCR灵敏度为46．15％，特异性为100．00％，阳性预测值为100．00％，阴性预测值为56．25％。结论使用该方法快速检测临床血标本中MRSA的灵敏度不高，欲应用于临床快速诊断尚有若干问题需解决。     

金黄色葡萄球菌耐药机制研究现状

金黄色葡萄球菌是引起化脓性感染和医院感染的常见病原菌。数十年来,由于细菌的进化和抗生素的滥用,该菌的耐药性逐渐增强,特别是甲氧西林耐药金黄色葡萄球菌。为了及时了解该菌的耐药情况,本文从分子水平阐明了其对几种常见抗菌药物耐药机制,对于医务人员从分子生物学角度对临床耐药性加以研究,治疗金黄色葡萄球菌引起的感染,指导i临床合理用药,减少耐药性的产生具有重要意义。     

化妆品中金黄色葡萄球菌的PCR快速检测

目的研究化妆品中金黄色葡萄球菌的快检方法。方法将金黄色葡萄球菌基因nuc作为靶基因并设计引物,使用PCR扩增技术对17株金黄色葡萄球菌及4株干扰菌进行特异性扩增。同时采用传统细菌分离培养法及PCR扩增法对9份不同性状加标化妆品进行金黄色葡萄球菌实际样品检测。结果琼脂糖凝胶电泳检测显示,17株金黄色葡萄球菌全部扩增出280 bp的目的条带,准确率为100%。同时,当9种化妆品样品内金黄色葡萄球菌添加浓度为1 CFU/g(或ml)以上时样品增菌液均能扩增出清晰的目的条带。结论菌落PCR检测技术快捷简便,其灵敏性与准确性均能满足化妆品中金黄色葡萄球菌检测需求。     

鼠疫耶尔森氏菌三色荧光定量PCR检测方法的建立

目的建立一种三色荧光定量PCR检测鼠疫耶尔森氏菌的方法。方法根据鼠疫耶尔森氏菌pPCP1质粒上的pla基因、编码F1抗原在pMT1质粒上的ca f1基因以及菌体染色体上的3a基因序列,设计特异性的引物和不同荧光标记的Taqman荧光探针,优化反应体系和扩增条件,考察该方法检测的敏感度、特异性、重复性和稳定性,最终建立三色荧光定量PCR检测方法。结果本研究所建立的方法对鼠疫耶尔森氏菌DNA的扩增效率高,最低检出限为1×102copies/ml,特异性高,重复性的变异系数在合理范围内,稳定性好。结论建立了一种同时检测鼠疫耶尔森氏菌pla、ca f1和3a基因的三色荧光定量PCR方法,该方法敏感度和特异性高,能够实现快速检测的目的。