补肺益肾方对TGF-β1/BMP-4诱导的肺血管平滑肌细胞TGF-β1/Smad信号通路的影响

目的:探讨补肺益肾方对转化生长因子-β1(TGF-β1)/骨形成蛋白-4(BMP-4)诱导的肺血管平滑肌细胞增殖及TGF-β1/Smad信号传导的影响,并探讨其相关的作用机制。方法:应用TGF-β1/BMP-4诱导人肺动脉平滑肌细胞增殖。细胞分为正常组(10%正常大鼠血清),诱导增殖组(含7.5μg·L-1TGF-β1与5.0μg·L-1BMP-4的10%正常大鼠血清),4%补肺益肾方含药血清(含7.5μg·L-1TGF-β1与5.0μg·L-1BMP-4,6%正常大鼠血清及4%补肺益肾大鼠血清),6%补肺益肾方含药血清(含7.5μg·L-1TGF-β1与5.0μg·L-1BMP-4,4%正常大鼠血清及6%补肺益肾大鼠血清)及8%补肺益肾方含药血清组(含7.5μg·L-1TGF-β1与5.0μg·L-1BMP-4,2%正常大鼠血清及8%补肺益肾大鼠血清)。24 h后,显微镜下观察细胞的密度,5-溴脱氧尿嘧啶核苷(5-bromo-2-deoxyuridine,Brd U)法检测细胞增殖,蛋白免疫印迹法(Western blot)检测Smad1,2,3和5以及p-Smad2/3蛋白表达,实时荧光定量聚合酶链式反应法(Real-time PCR)检测纤溶酶原激活物抑制物-1(PAI-1),结缔组织生长因子(CTGF),分化抑制因子-1(ID-1)和ID-2 mRNA的表达。结果:TGF-β1/BMP-4作用24 h后,细胞密度增加、细胞增殖率显著增加(P0.05),补肺益肾方抑制TGF-β1/BMP-4诱导的细胞增殖,显示出浓度依赖性,其中8%浓度显著抑制细胞增殖(P0.01)。TGF-β1/BMP-4及补肺益肾方均不影响Smad1,2,3和5蛋白的表达;但TGF-β1/BMP-4诱导p-Smad2/3的表达(P0.05),8%补肺益肾方显著抑制TGF-β1/BMP-4诱导的p-Smad2/3表达(P0.05)。TGF-β1/Smad2通路的下游效应基因的检测发现,TGF-β1/BMP-4及补肺益肾方均不影响PAI-1,ID-1和ID-2 mRNA的表达;但TGF-β1/BMP-4诱导后,CTGF mRNA表达水平的显著增加(P0.01),8%补肺益肾方抑制TGF-β1/BMP-4诱导的CTGF mRNA的表达(P0.05)。结论:补肺益肾方抑制TGF-β1与BMP-4合用诱导的肺动脉平滑肌细胞的增殖,抑制p-Smad2/3/CTGF通路的活化是可能的作用途径。     

柴胡疏肝散对肝纤维化大鼠TGF-β1/Smad信号通路的影响

目的:探讨柴胡疏肝散对肝纤维化(hepatic fibrosis,HF)的作用机制。方法:60只Wistar大鼠被随机均分为6组:正常组、模型组、柴胡疏肝散高、中、低剂量组、柴胡疏肝散预防组。除正常组外,其余各组均采用猪血清ip诱发HF,0.5 m L/只,2次/周,连续10周,5周后即可形成HF。预防组于造模同时给药(以柴胡疏肝散6.3 g·kg-1),柴胡疏肝散高、中、低剂量组[(12.6,6.3,3.15)g·kg-1]于造模第6周给药,连续10周。采用RT-PCR法检测各组肝组织转化生长因子-β1(TGF-β1),Smad2,Smad3,Smad4和Smad7的mRNA表达,免疫组化法分别检测肝组织TGF-β1,磷酸化Smad 2/3(p-Smad 2/3)和Smad7蛋白表达。结果:与正常组比较,模型组TGF-β1,Smad2,Smad3的mRNA和TGF-β1,p-Smad 2/3蛋白表达均显著增加(均P0.01),Smad7基因表达显著降低(均P0.01);与模型组比较,柴胡疏肝散中剂量组TGF-β1和Smad3 mRNA表达均显著降低,p-Smad 2/3和TGF-β1蛋白表达显著减弱(P0.05,P0.01),Smad7基因表达显著增加(P0.01)。结论:柴胡疏肝散有明显的抗HF作用,其机制可能与抑制TGF-β1/Smad信号通路有关。     

柴竭抑肝纤对大鼠肝星状细胞增殖和TGF-β1/Smad信号通路的影响

目的:研究保肝护肝中药复方柴竭抑肝纤(CJYGX)通过肝星状细胞治疗肝纤维化的作用机制。方法:培养肝星状细胞T6(hepatic stellate cell T6,HSC-T6),设空白组、秋水仙碱1.0 mg·L~(-1)组和200,100,50,25,12.5,6.25 mg·L~(-1)质量CJYGX组,作用24 h后通过细胞计数试剂(cell counting kit-8,CCK-8)检测HSC-T6细胞的增殖情况,筛选合适的CJYGX药物浓度;实时荧光定量聚合酶链式反应(Real-time PCR)检测CJYGX(200,100,50 mg·L~(-1))作用HSC-T6细胞24 h后转化生长因子-β1(TGF-β1),信号转导蛋白Smad2,Smad3,Smad4,Smad7 mRNA表达变化;蛋白免疫印迹法(Western blot)检测CJYGX(200,100,50 mg·L~(-1))作用HSC-T6细胞24 h后TGF-β1,α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)表达变化。结果:(1)与空白组比较,200,100,50 mg·L~(-1)CJYGX对HSC-T6细胞具有显著的抑制增殖作用(P0.05)。(2)200,100,50 mg·L~(-1)CJYGX显著下调TGF-β1,Smad2,Smad3 mRNA的表达(P0.05);200,100 mg·L~(-1)CJYGX显著下调Smad4 mRNA表达,并显著上调Smad7 mRNA表达(P0.05)。(3)200,100 mg·L~(-1)CJYGX显著下调HSC-T6细胞TGF-β1和α-SMA蛋白表达(P0.05)。结论:CJYGX能抑制HSC-T6细胞的增殖,其作用机制与TGF-β1/Smad通路有关。     

白花丹醌对TGF-β1 刺激人肝星状细胞α-SMA表达的影响

目的:研究白花丹醌(plumbagin)对转化生长因子-β1(TGF-β1)刺激的体外培养人肝星状细胞HSC-LX2α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)mRNA和蛋白表达的影响。方法:体外培养HSC-LX2,随机设立空白组,TGF-β1刺激的模型组,TGF-β1+白花丹醌2.0μmol·L-1高剂量组,TGF-β1+白花丹醌1.5μmol·L-1中剂量组和TGF-β1+白花丹醌1.0μmol·L-1低剂量组,各药物与细胞孵育72 h后,采用RT-PCR检测各组HSC-LX2α-SMA mRNA的表达,采用免疫细胞化学方法(ICC)检测HSCLX2中α-SMA蛋白的表达。结果:与正常组比较,模型组α-SMA mRNA及蛋白表达明显升高(P0.01);与模型组比较,白花丹醌作用72 h后,高、中剂量组HSC-LX2细胞中α-SMA mRNA的表达明显降低(P0.01);免疫细胞化学结果显示白花丹醌高、中剂量组对HSC-LX2细胞α-SMA蛋白的表达有显著地抑制作用(P0.05),尤以高剂量组更明显(P0.01)。结论:白花丹醌能抑制HSC-LX2的活化和增殖,其机制之一可能是从mRNA水平和蛋白水平抑制α-SMA的表达,从而发挥其抗肝纤维化作用。     

肝乐颗粒对肝纤维化大鼠TGF-β1/Smad信号通路的调控作用

目的:明确肝乐颗粒对转化生长因子(TGF)-β_1/Smad信号通路的干预作用,探讨其防治肝纤维化的分子学机制。方法:SD大鼠随机分为正常组,模型组,肝乐颗粒(1.5,3.0,6.0 g·kg~(-1))和秋水仙碱(1.0×10~(-4)g·kg~(-1))。采用50%四氯化碳每周2次,连续12周皮下注射的方法,诱导肝纤维化大鼠模型。造模第7周起,给药组分别灌胃给予相应剂量的肝乐颗粒和秋水仙碱,每天1次,连续6周。末次给药8 h后,处置大鼠,取固定部位肝脏组织,苏木素-伊红(HE)和马松(Masson)染色观察肝脏病理组织学损伤程度,免疫组化和蛋白质免疫印迹(Western blot)检测肝组织中Ⅰ型胶原(CollagenⅠ),Smad2,TGF-β_1或TGF-βI型受体(TβRⅠ)蛋白的表达,实时定量荧光PCR(Real-time PCR)检测肝组织中CollagenⅠ,Smad2,TGF-β_1mRNA的表达。结果:与正常组比较,模型组大鼠肝纤维化损伤程度,肝组织中CollagenⅠ,TGF-β_1,Smad2,TβRⅠ蛋白及mRNA的表达明显增加(P0.01);与模型组比较,肝乐颗粒中、高剂量组不仅可减轻肝组织病理损伤程度,减少胶原沉积,还可显著降低CollagenⅠ,TGF-β_1,Smad2,TβRⅠ蛋白及mRNA的表达(P0.05,P0.01)。结论:肝乐颗粒对肝纤维化大鼠具有一定的保护作用,其机制可能与调控TGF-β_1/Smad信号通路,从而抑制HSC活化,减少细胞外基质过度沉积有关。     

夏枯草硫酸多糖对CCl4致大鼠肝纤维化及TGF-β1诱导的大鼠肝星状细胞活化的影响

目的:观察夏枯草硫酸多糖(PSSP)对四氯化碳(CCl4)所致的大鼠肝纤维化及转化生长因子-β1(TGF-β1)诱导活化大鼠肝星状细胞-T6(HSC-T6)的影响,从而初步探讨PSSP抗纤维化的机制。方法:采用CCl4-橄榄油溶液腹腔注射诱导大鼠肝纤维化造模,随机分为5组,分别为正常组,模型组,秋水仙碱组(0.25 mg·kg-1),PSSP高剂量组(300 mg·kg-1)和PSSP低剂量组(100 mg·kg-1)。分别测定各组大鼠血清丙氨酸氨基转移酶(ALT),天门冬氨酸氨基转移酶(AST),层粘连蛋白(LN),透明质酸(HA),Ⅲ型前胶原(PCⅢ)和Ⅳ胶原(C-Ⅳ)的含量;采用苏木素-伊红(HE)及天狼猩红染色观察大鼠肝组织病理学改变;体外培养HSC-T6细胞;采用细胞增殖与活性法(CCK-8)测定PSSP对TGF-β1诱导的HSC-T6细胞增殖的影响;采用实时荧光定量聚合酶链式反应(Real-time PCR)和蛋白免疫印迹法(Western blot)检测HSC-T6细胞中Ⅰ型胶原(Col-I),α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)mRNA和蛋白的表达。结果:与模型组比较,PSSP可明显降低大鼠ALT,AST,HA,LN,PC-Ⅲ和C-Ⅳ的含量,并减轻大鼠肝纤维化程度(P0.01);PSSP可抑制TGF-β1诱导的HSC-T6细胞的增殖,减少HSC-T6细胞Col-I,α-SMA mRNA和蛋白的相对表达量(P0.01)。结论:PSSP具有很好的抗纤维化作用,其机制可能与抑制肝星状细胞活化及抑制胶原合成与沉积,减少细胞外基质(ECM)的生成并促进其降解有关。     

五味子藤茎提取物抗大鼠肝纤维化作用及机制探讨

目的:观察五味子藤茎提取物抗四氯化碳(CCl4)及乙醇所致肝纤维化的作用及机制。方法:50只Wistar大鼠随机分为正常组、模型组、五味子藤茎提取物高、中、低剂量组,采用ip CCl4,并饮用乙醇、饲用高脂饲料等复合因素制造肝纤维化模型,造模后,给药组分别ig高、中、低不同剂量(5.0,2.5,1.25 g·kg-1)五味子藤茎提取物,正常组和模型组灌服等量的生理盐水。末次给药后,检测血清丙氨酸转氨酶(ALT),天冬氨酸转氨酶(AST)活性,层粘蛋白(LN),透明质酸(HA),Ⅲ型前胶原(PCⅢ)水平,同时取大鼠肝组织,分别用于苏木素-伊红(HE)染色观察病理变化,蛋白质免疫印迹(Western blot)法检测转化生长因子-β_1(TGF-β_1),α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)蛋白表达水平。结果:与正常组比较,模型组大鼠血清AST,ALT活性及HA,LN,PCⅢ水平均显著升高,肝组织TGF-β_1,α-SMA蛋白表达水平显著增高(P0.01);与模型组比较,五味子藤茎提取物能显著降低肝纤维化大鼠血清ALT,AST活性及HA,LN,PCⅢ水平,病理组织学检查结果显示,五味子藤茎提取物各剂量组大鼠肝组织结构明显改善,肝纤维化程度减轻,五味子藤茎提取物各剂量组均可显著降低肝组织TGF-β_1,α-SMA蛋白表达水平(P0.01)。结论:五味子藤茎提取物对CCl4及乙醇所致肝损伤有明显保护作用,其机制可能与降低肝组织TGF-β_1,α-SMA蛋白表达、抑制肝星状细胞活化有关。     

加味茵陈四逆汤含药血清对TGF-β1干预的大鼠肝星状细胞TGF-β1/Smads通道及胶原蛋白的影响

目的:探讨加味茵陈四逆汤含药血清对转化生长因子-β1(TGF-β1)干预的大鼠肝星状细胞TGF-β1/Smad通道相关蛋白及胶原蛋白3(Collagen3)生成量的影响。方法:以大鼠肝星状细胞HSC-T6为研究对象,将细胞分为空白组,模型组,阳性药物组(甲强龙,10%含药血清),加味茵陈四逆汤高、中、低剂量组(10%含药血清),共6组。除空白组外,其余均给予TGF-β1(10 g·L-1)并采用相应10%的含药血清培养,并采用蛋白质免疫印迹(Western blot)的方法检测各研究组含药血清对大鼠肝星状细胞HSC-T6 Smad3,Smad7,Collagen3蛋白表达的影响。结果:与空白组比较,模型组HSC-T6细胞Smad3,Smad7,Collagen3蛋白表达升高,Collagen3蛋白表达升高较为明显(P0.05);与模型组比较,加味茵陈四逆汤低剂量明显降低Smad3蛋白表达(P0.05),加味茵陈四逆汤中剂量明显降低Collagen3蛋白表达(P0.05)。结论:加味茵陈四逆汤含药血清使Smad3,Collagen3蛋白表达下调,Smad7未见明显变化,提示本药在离体条件下可以延缓肝纤维化的进程。     

补骨脂酚对TGF-β诱导人肝星状细胞损伤的保护作用

目的:探讨补骨脂酚对转化生长因子-β(TGF-β)诱导人肝星状细胞损伤的保护作用及其机制。方法:通过噻唑蓝(MTT)比色法检测各组人肝星状细胞活性,筛选出补骨脂酚安全有效浓度;本实验分为空白组、模型组、补骨脂酚组(1×10-5mol·L-1)及雌二醇组(1×10-6mol·L-1),同样检测各组细胞的活性,除空白组外,其余各组均加入10μg·L-1TGF-β诱导人肝星状细胞损伤;分别采用酶联免疫吸附测定法(ELISA)检测各组细胞中超氧化物歧化酶(SOD),谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px),丙二醛(MDA)的水平;实时荧光定量聚合酶链式反应(Real-time PCR)检测细胞中基质金属蛋白酶-1(MMP-1),胶原蛋白-Ⅰ(Col-Ⅰ)mRNA表达水平;蛋白免疫印迹法(Western blot)检测细胞中MMP-1,Col-Ⅰ蛋白的表达水平。结果:与模型组比较,1×10-5mol·L-1补骨脂酚显著提高TGF-β诱导人肝星状细胞及细胞中SOD,GSH-Px活性,显著降低细胞中MDA含量及Col-Ⅰ,MMP-1 mRNA和蛋白的表达(P0.01)。结论:补骨脂酚对TGF-α诱导人肝星状细胞损伤的保护作用,主要是通过提高细胞中抗氧化酶的活性、降低细胞中MMP-1,Col-ⅠmRNA和蛋白的含量。     

化浊解毒含药血清对大鼠肝星状细胞增殖及细胞因子的影响

目的:观察化浊解毒含药血清对体外培养活化的大鼠肝星状细胞增殖及活性的影响,探讨化浊解毒方治疗肝纤维化的作用机制.方法:不同剂量(分别含有生药30,60,120 g·L-1)的化浊解毒方,按0.01 mL·g-1体重SD大鼠灌胃给药,以制备含药血清;常规培养活化的肝星状细胞( HSC-T6),用不同浓度的含药血清进行干预,用MTT,ELISA,RT-PCR法分别检测肝星状细胞增殖、细胞上清液中Ⅰ型胶原的含量以及细胞中转化生长因子-β1(TGF-β1)mRNA基因的表达.结果:与正常血清组比较,化浊解毒方含药血清各浓度组均呈现出抑制HSC增殖的作用(P＜0.05),且呈剂量和时间依赖性.与正常血清组比较,化浊解毒方含药血清各个浓度组在作用48 h后,细胞上清液中的Ⅰ型胶原的含量均降低(P＜0.05),均能下调细胞中TGF-β1 mRNA的表达(P＜0.05).结论:化浊解毒方之所以能有效的治疗肝纤维化可能与化浊解毒方抑制肝星状细胞的增殖和活性有关.     

不同引经药配伍大黄-丹参药对抗大鼠肝纤维化的比较

目的:观察不同引经药配伍大黄-丹参药对抗大鼠肝纤维化的效应差异,探讨引经药的增效作用。方法:健康雄性SD大鼠60只,随机分为正常组,模型组,丹参-大黄药对组(5.0 g·kg~(-1)),药对加桔梗组(5.0 g·kg~(-1)+1.5 g·kg~(-1)),药对加柴胡组(5.0 g·kg~(-1)+1.5 g·kg~(-1))和药对加细辛组(5.0 g·kg~(-1)+0.3 g·kg~(-1)),除正常组外,其余各组均腹腔注射四氯化碳(CCl4)复制肝纤维化模型。从第3周开始,除注射造模外,各实验组分别给予相应药物灌胃,正常组、模型组灌胃双蒸水,连续6周。末次给药后,取血和肝脏,检测血清中丙氨酸氨基转移酶(ALT),天门冬氨酸氨基转移酶(AST),碱性磷酸酶(ALP)的活性;酶联免疫吸附法(ELISA)测定血清中层黏连蛋白(LN),透明质酸(HA)和Ⅲ型前胶原(PCⅢ)的含量;酸水解法检测肝匀浆中羟脯胺酸(HYP)的含量;观察肝脏的组织形态改变;免疫组化法检测肝组织中转化生长因子-β1(TGF-β1)的表达。结果:与模型组比较,各给药组大鼠血清中ALT,AST,ALP活性和LN,HA,PCⅢ的含量显著降低,肝匀浆中HYP含量降低,肝组织TGF-β1表达减少(P0.05,P0.01),肝组织结构明显改善;与药对组相比,药对加柴胡组大鼠ALT,AST,ALP活性和LN,HA,PCⅢ的含量降低,肝组织TGF-β1表达减少(P0.05,P0.01)。结论:大黄-丹参药对能有效减轻肝纤维化的程度,引经药柴胡可增强大黄-丹参药对的抗肝纤维化作用。     

蝙蝠葛酚性碱对大鼠肝纤维化的影响及其机制探讨

目的:观察蝙蝠葛酚性碱(PAMD)对四氯化碳(CCl4)诱导大鼠肝纤维化的影响,并探讨其作用机制。方法:SD大鼠随机分成正常组,模型组,秋水仙碱组(1 mg·kg-1),PAMD高、中、低剂量组(25,12.5,6.25 mg·kg-1)。采用40%CCl4(1m L·kg-1)ip诱导肝纤维化模型大鼠。所有大鼠给予等体积药物或生理盐水ig,持续30 d。放射免疫法检测血清透明质酸(HA),层粘连蛋白(LN),Ⅲ型前胶原(PCⅢ)和Ⅳ型胶原(CⅣ)水平。生化分析法检测血清丙氨酸氨基转移酶(ALT),天门冬氨酸氨基转移酶(AST),总蛋白(TP)和白蛋白(ALB)水平。酶联免疫吸附测定(ELISA)法检测肝脏中转化生长因子-β1(TGF-β1)和肿瘤坏死因子-α(TNF-α)水平。电子显微镜观察大鼠肝组织镜下形态结构,计算肝和脾脏脏器指数。结果:与正常组比较,模型组大鼠血清HA,LN,PCⅢ,CIV,ALT和AST明显增加(P0.05),TP和ALB明显降低(P0.05),肝组织TGF-β1和TNF-α水平明显升高(P0.05),肝脏病理纤维化大鼠明显加重,肝脏和脾脏脏器指数明显升高(P0.05);与模型组比较,PAMD高、中剂量组大鼠血清HA,LN,PCⅢ,CIV,ALT和AST明显降低(P0.05),TP和ALB明显升高(P0.05),肝组织TGF-β1和TNF-α水平明显降低(P0.05),肝脏病理纤维化大鼠明显减轻,肝脏和脾脏脏器指数明显降低(P0.05)。结论:PAMD能有效减轻CCl4诱导肝纤维化大鼠的肝脏损伤,降低肝纤维化程度,其机制与抑制肝脏TGF-β1和TNF-α蛋白表达有关。     

山豆根醇提取物干预TGF-β1/Smad通路抑制兔耳增生性瘢痕的机制

目的:研究山豆根醇提取物对兔耳部增生性瘢痕组织中转化生长因子-β1(TGF-β1)和Smad3表达的影响,探讨山豆根醇提取物改善增生性瘢痕的作用与机制。方法:通过损伤新西兰大耳白兔耳内侧皮肤建立兔耳增生性瘢痕模型。49只大耳白兔随机分为空白组、模型组,山豆根醇提取物高、中、低剂量组(2.0,1.0,0.4 g·kg-1),积雪苷软膏组(5 mg·kg-1)以及复方肝素钠尿囊素凝胶组(20 mg·kg-1),7只/组。除空白组外,其余各组在模型建立后分别采用相应的药物涂抹于兔耳增生性瘢痕处,1次/日,连续给药42 d。实验结束后取耳部瘢痕组织,采用苏木素-伊红(HE)染色观察兔耳瘢痕组织病理改变并测定瘢痕增生指数;分别采用免疫组化,蛋白免疫印迹法(Western blot)以及逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)检测瘢痕组织中TGF-β1和Smad3蛋白及mRNA的表达。结果:与空白组比较,模型组动物耳瘢痕组织病理显示增生明显,增生指数显著增加(P0.01);同时瘢痕组织中TGF-β1和Smad3表达也显著升高(P0.01);与模型组比较,山豆根醇提取物中、高剂量组耳部瘢痕组织病理结构明显改善,瘢痕组织TGF-β1和Smad3表达及增生指数明显下降(P0.05,P0.01),山豆根醇提取物各剂量组TGF-β1和Smad3蛋白与mRNA表达明显下降(P0.05,P0.01)。结论:山豆根醇提取物可能通过降低瘢痕组织中TGF-β1和Smad3表达,抑制TGF-β1/Smads信号转导通路发挥抑制增生性瘢痕的疗效,这为山豆根治疗增生性瘢痕的临床应用提供了实验基础。     

三七皂苷对TGF-β1诱导的大鼠肾小管上皮细胞EMT的影响

目的:研究三七皂苷(PNS)对转化生长因子-β_1(TGF-β_1)诱导的大鼠肾小管细胞上皮-间充质转化(EMT)的干预作用,并从沉默信息调节因子2相关酶1(SIRT1)/TGF-β_1/Smad通路分析其可能机制。方法:在DMEM培养基中,用10%胎牛血清培养大鼠肾小管上皮细胞(NRK-52E),分为正常组,TGF-β_1组(5μg·L~(-1)),白藜芦醇组(50 mg·L~(-1)),SIRT1阻断剂EX527组(10μmol·L~(-1)),PNS组(100 mg·L~(-1)),EX527+PNS组(EX527 10μmol·L~(-1),PNS 100 mg·L~(-1)),48 h后收集细胞;采用实时荧光定量聚合酶链式反应(Real-time PCR)检测SIRT1,α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA),E-钙黏附蛋白(E-cadherin),TGF-β_1,Smad3,Smad4 mRNA表达;蛋白免疫印迹法(Western blot)检测SIRT1,α-SMA,E-cadherin,TGF-β_1蛋白表达。结果:与正常组比较,TGF-β_1组α-SMA mRNA及蛋白表达明显增多(P 0. 05),E-cadherin表达显著减少(P 0. 01);与TGF-β_1组比较,PNS,白藜芦醇组,E-cadherin mRNA及蛋白表达均显著增加(P 0. 01),α-SMA表达显著减少(P 0. 01),EMT发生被抑制,同时,SIRT1表达显著增加(P 0. 01),TGF-β_1,Smad3,Smad4表达显著降低(P 0. 01)。在SIRT1阻断剂EX527的干预下,PNS则不能发挥明显抑制作用。结论:PNS可以阻止TGF-β_1诱导的肾小管上皮细胞EMT的发生,其机制可能是通过激活SIRT1进而抑制TGF-β_1/Smad通路实现的。     

柴竭抑肝纤对硫代乙酰胺诱导的大鼠肝纤维化的影响

目的:研究中药复方柴竭抑肝纤(Chaijie Yiganxian,CJYGX)对抗大鼠肝纤维化的作用及其机制。方法:60只SD大鼠随机分为正常组,模型组,阳性组(鳖甲煎丸),CJYGX高、中、低剂量组。除正常组外,其余5组通过腹腔注射硫代乙酰胺(thioacetamide,TAA)诱导建立肝纤维化模型。自造模第4周开始,阳性组给予鳖甲煎丸1 g·kg~(-1)·d-1灌胃,CJYGX高、中、低剂量组分别给予CJYGX 7.96,3.98,1.99 g·kg~(-1)·d-1灌胃,模型组灌服生理盐水,每日灌胃1次,共5周。于末次灌胃24 h后,水合氯醛轻度麻醉大鼠,留取血清及肝组织,称肝脏湿重并计算肝脏指数;全自动分析法检测大鼠肝功能指标丙氨酸氨基转移酶(alanine transaminase,ALT),天门冬氨酸氨基转移酶(aspartate aminotransferase,AST),碱性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP);酶联免疫吸附测定(ELISA)检测肝纤维化血清学标志物层粘连蛋白(laminin,LN),透明质酸酶(hyaluronidase,HA),Ⅳ型胶原(Ⅳcollagen,CⅣ),Ⅲ型前胶原(procollagenⅢ,PCⅢ);马松(Masson)染色观察肝脏纤维化程度;实时荧光定量聚合酶链式反应(Real-time PCR)检测肝脏组织转化生长因子-β1(transforming growth factor-β1,TGF-β1),Smad2,Smad3,Smad4,Smad7 mRNA表达;免疫组化检测肝脏组织血小板源性生长因子(platelet derived growth factor,PDGF)和TGF-β1蛋白表达水平;蛋白免疫印迹法(Western blot)检测肝脏TGF-β1和α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)蛋白表达。结果:与正常组比较,模型组肝脏指数显著升高;肝功能指标ALP,AST,ALT的含量显著升高;肝纤维化指标LN,HA,Ⅳ-C,PCⅢ和HYP显著升高; Masson染色观察到肝纤维化程度显著增加; TGF-β1,Smad2,Smad3,Smad4 mRNA表达显著升高,Smad7 mRNA表达显著降低; TGF-β1,PDGF和α-SMA蛋白表达显著升高(P0.01)。与模型组比较,各剂量的CJYGX能不同程度的降低肝功能指标ALP,AST,ALT的水平;肝纤维化指标LN,HA,Ⅳ-C,PCⅢ和HYP都明显的降低; Masson组织观察到肝纤维化程度显著减轻; TGF-β1,Smad2,Smad3,Smad4 mRNA表达明显下调,Smad7 mRNA表达明显上调; TGF-β1,PDGF和α-SMA蛋白表达显著下调(P0.05,P0.01)。结论:中药复方"柴竭抑肝纤"可能通过干预TGF-β1/Smad信号通路,保护TAA诱导的大鼠肝纤维化损伤。     

藏药波棱瓜子总木脂素对四氯化碳致大鼠肝纤维化的保护作用及机制探讨

该实验探讨藏药波棱瓜子总木脂素对四氯化碳(CCl_4)致大鼠肝纤维化的保护作用及其作用机制。将SD大鼠48只随机分为空白对照组、模型组、总木脂素低、中、高剂量(100,200,400 mg·kg~(-1))组、阳性药甘利欣(25 mg·kg~(-1))组,每组8只。空白组正常饲养,模型组、总木脂素低、中、高剂量组以及甘利欣组大鼠均隔2~3 d皮下注射3 m L·kg~(-1)含40%CCl_4的橄榄油溶液连续造模8周。期间空白组、模型组灌胃等量生理盐水2 m L,总木脂素低、中、高剂量组、甘利欣组灌胃给药相应剂量。8周后最后一次造模6 d后处死大鼠。生化分析法测定各组大鼠血清谷丙转氨酶(ALT)、谷草转氨酶(AST)、碱性磷酸酶(ALP)含量。ELISA法检测血清肝纤维化指标转化生长因子-β_1(TGF-β_1)、透明质酸(HA)、羟脯氨酸(HYP)、超氧化物歧化酶(SOD)的水平,肝组织进行HE和Masson胶原染色,进行病理分析并评分。结果显示与模型组大鼠比较,总木脂素组大鼠血清中ALT,AST,ALP,TGF-β_1,HA和HYP水平显著降低(P0.05,P0.01),肝脏组织匀浆液中SOD浓度水平明显升高(P0.05,P0.01),肝脏病理损伤明显减轻(P0.05,P0.01),肝纤维化评分明显降低(P0.05,P0.01)。通过以上实验说明波棱瓜子总木脂素能有效减轻CCl_4致大鼠肝纤维化的肝脏损伤,降低肝纤维化程度,其机制可能与其保肝降酶抑制TGF-β_1表达有关。     

艳山姜挥发油对TGF-β1诱导人脐静脉内皮细胞间质转分化的保护作用

目的:研究艳山姜挥发油(EOFAZ)对转化生长因子-β_1(TGF-β_1)诱导人脐静脉内皮细胞(HUVECs)间质转分化的干预保护作用。方法:采用TGF-β_1(10μg·L~(-1),孵育48 h)诱导建立内皮-间质转化(End MT)细胞模型。实验分组为正常组,模型组(10μg·L~(-1)TGF-β_1),EOFAZ高剂量组(10μg·L~(-1)TGF-β_1+4μg·L~(-1)EOFAZ)及EOFAZ低剂量组(10μg·L~(-1)TGF-β_1+2μg·L~(-1)EOFAZ)。EOFAZ于造模前干预给药2 h,加入TGF-β_1共孵育复制End MT细胞模型。倒置显微镜下观察细胞形态,划痕实验分析细胞迁移能力,蛋白免疫印迹法(Western blot)检测EOFAZ对内皮细胞特异性标志物血管内皮细胞钙粘素(VE-cadherin),间充质细胞特异性标志物α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA),锌指转录因子(Snail)及核转录因子-κB(NF-κB)p-p65蛋白表达的影响。结果:TGF-β_1诱导孵育后,细胞形态多呈长梭形,并可见明显的细胞丝状伪足,细胞间的紧密连接减少;划痕实验结果表明模型组细胞迁移能力增强(P0.01);VE-cadherin蛋白表达显著减少(P0.01),α-SMA,Snail,NF-κB p-p65蛋白表达量明显增多(P0.01)。EOFAZ高、低剂量组干预给药后,能够明显抑制TGF-β_1诱导的细胞迁移能力(P0.01),同时能增加VE-cadherin的表达,降低α-SMA,Snail及NF-κB p-p65蛋白的表达。结论:艳山姜挥发油对TGF-β_1诱导的HUVECs间质转分化具有干预保护作用,其机制与抑制NF-κB p65的磷酸化激活有关。     

“调肝肾,祛痰瘀”复方血压峰值前给药对自发性高血压大鼠肾脏TGF-β1,CTGF和FN的影响

目的:探讨"调肝肾,祛痰瘀"复方血压峰值前给药对自发性高血压大鼠肾脏转化生长因子-β1(TGF-β1),结缔组织生长因子(CTGF)和糖蛋白纤维连接蛋白(FN)的影响。方法:将30只SHR(12周龄),随机分为复方组(4 g·kg-1),氯沙坦组(30 mg·kg-1)和模型组,设SD大鼠10只为正常组,治疗12周后,采用RT-PCR和Western blot法分别检测肾组织中TGF-β1,CTGF和FN的m RNA和蛋白表达。结果:与正常组比较,模型组TGF-β1,CTGF和FN m RNA表达均明显上调(P0.01),CTGF,FN蛋白表达均明显上调(P0.01);与模型组比较,复方组TGF-β1,CTGF,FN的m RNA的表达均明显下调(P0.01,P0.05),TGF-β1,CTGF,FN蛋白表达均明显下调(P0.01);氯沙坦组TGF-β1,FN m RNA表达均明显下调(P0.01),TGF-β1和FN蛋白表达均明显下调(P0.01,P0.05)。与氯沙坦组比较,复方组TGF-β1的m RNA表达较明显下调(P0.05),CTGF和FN的蛋白表达亦下调(P0.05)。结论:"调肝肾,祛痰瘀"复方血压峰值前给药能够明显减少ECM聚积而改善SHR肾损害。其作用机制应是在中医阴阳升降机制协同下,通过降低肾组织TGF-β1,CTGF,FN的表达而达致。     

左归降糖益肾方对糖尿病肾病MKR鼠肾组织TGF-β1及CTGFmRNA表达的影响

目的:探讨左归降糖益肾方对糖尿病肾病骨骼肌特异性胰岛素样生长因子-1受体缺失转基因鼠(MKR鼠)转化生长因子-β1(TGF-β1)及结缔组织生长因子(CTGF)基因mRNA表达的影响。方法:MKR鼠60只,按性别、空腹血糖、体重随机分为4组,即空白组,模型组,左归降糖益肾方组(28.8 g·kg-1),阳性药物组(格列喹酮0.003 9 g·kg-1与盐酸贝那普利0.001 3 g·kg-1),每组15只,同龄C57鼠10只作为正常组,除正常组与空白组外,其余各组高脂喂养联合单侧肾切除造成糖尿病肾病(DN)小鼠模型,造模后8周ig给予相应药物8周,留取尿标本,心脏采血处死各组小鼠。电化学法检测空腹血糖(FBG),常规生化法检测血清肌酐(SCr),尿素氮(BUN)含量,ELISA检测尿微量白蛋白含量;并取新鲜肾组织,RT-PCR检测肾组织TGF-β1及CTGF mRNA的表达水平;其余组织4%多聚甲醛固定24 h,HE及Masson染色观察肾组织病理变化。结果:与空白组比较,模型组小鼠FBG,SCr,BUN及尿微量白蛋白含量明显升高(P0.01);与模型比较,左归降糖益肾方能明显降低DN小鼠FBG,降低SCr,BUN及尿微量白蛋白含量(P0.01);下调TGF-β1mRNA及CTGF mRNA的表达水平(P0.05,P0.01),疗效等同于阳性药物组;与空白组比较,模型组肾组织肾小球体积缩小,肾小球萎缩,球囊腔增宽,球囊腔壁层细胞增多且异形化,左归降糖益肾方能明显改善肾组织病理损伤。结论:左归降糖益肾方可以通过下调TGF-β1mRNA及CTGF mRNA的表达水平,从而抑制肾组织纤维化的发生发展。     

二陈汤加味对COPD大鼠转化生长因子-β1，组蛋白去乙酰化酶2基因表达的影响

目的:观察二陈汤加味对慢性阻塞性肺疾病(COPD)大鼠肺组织中转化生长因子-β_1(TGF-β_1)及其受体(TGF-βRII)基因表达,外周血单个核细胞(PBMCs)中组蛋白去乙酰化酶2(HDAC2)基因表达及活性的影响。方法:采用烟熏加脂多糖方法制备COPD大鼠模型。随机分为正常组、模型组、二陈汤加味高、中、低剂量组(20,10,5 g·kg~(-1))。正常组、模型组灌胃生理盐水(10 g·kg~(-1)),二陈汤加味高、中、低剂量组分别灌胃,连续14 d。荧光酶联免疫法测定PBMCs中HDAC2活性,酶联免疫吸附测定(ELISA)法测定肺组织匀浆中TGF-β_1及PBMCs中HDAC2含量;实时荧光定量PCR(Real-time PCR)检测肺组织匀浆中TGF-β_1mRNA及PBMCs中HDAC2 mRNA表达;免疫组化检测TGF-β_1与TGF-βRⅡ蛋白在肺组织的原位表达,光镜观察组织结构。结果:与正常组比较,模型组大鼠肺组织匀浆中TGF-β_1含量升高(P0.05);肺组织中TGF-β_1mRNA,TGF-β_1与TGF-βRⅡ蛋白表达均显著增强(P0.01);模型组大鼠PBMCs中HDAC2 mRNA表达、含量及其活性均明显减低(P0.05,P0.01),差异均有统计学意义。与模型组比较,二陈汤加味高、中剂量组肺组织匀浆中TGF-β_1mRNA表达(P0.01)和TGF-β_1蛋白含量均显著降低(P0.05,P0.01),免疫组化检测肺组织中TGF-β_1与TGF-βRⅡ蛋白表达均显著弱于模型组(P0.01),PBMCs中HDAC2 mRNA表达、含量及其活性均升高(P0.05,P0.01),肺组织结构明显改善。结论:二陈汤加味对COPD有抗炎作用。其机制可能与增强PBMCs中HDAC2基因表达,提高HDAC2活性,抑制TGF-β_1及其受体基因的表达有关。