鼻咽癌中EB病毒LMP1基因N端Xho I酶切位点的丢失

背景与目的：众所周知,EB病毒LMP1基因在鼻咽癌变过程起着一定的作用。本研究通过检测广东地区鼻咽癌组织EB病毒LMP1基因N-末端区Xho I酶切位点的丢失,探讨LMP1基因变异在鼻咽癌发生发展中的作用。方法：收集中山大学肿瘤防治中心鼻咽癌患者鼻咽新鲜活检标本63例。收集EB病毒健康携带者外周血单个核细胞(PBMCs)10例作为对照。采用QIAamp DNA Mini Kit和QIAamp DNA Blood Mini Kit分别抽取组织和外周血单个核细胞的DNA,应用巢式PCR扩增EB病毒LMP1基因的N-末端区,并用Xho I对扩增产物进行酶切。采用四色荧光末端终止法对扩增产物进行序列分析。结果：10例健康携带者外周血单个核细胞的EB病毒LMP1基因N-末端区均未见Xho I酶切位点的丢失。63例鼻咽癌组织中有50例(79．37％)出现Xho I酶切位点的丢失(Xho I—loss),还有4例(6．34％,)为Xho I酶切位点部分丢失,只有9例(14．29％)未见Xho I酶切位点的丢失(wt-Xho I)。除了Xho I酶切位点的丢失(nt：169423～169428;GAGCTC→GA□TCTC)外,还发现四个错义点突变。结论：本研究所检测的广东地区EB病毒健康携带者外周血单个核细胞所携带的：EB病毒LMP1基因为wt—Xho I,而在鼻咽癌组织中主要为Xho I-loss。因此,我们认为EB病毒LMP1基因N-末端区Xho I酶切位点的丢失和其他的错义点突变可能是在鼻咽癌的发生发展过程中产生的。     

EB病毒LMP1在鼻咽癌细胞系中通过TRAF2活化NF—kB

目的 为了探讨ＥＢ病毒（ＥＢＶ）中ＬＭＰ１的致瘤机制,对鼻咽癌ＬＭＰ１激活重要的核转录因子ＮＦ－ｋＢ的机制进行了研究。方法：①以ＬＭＰ１阴性的鼻咽癌细胞系ＨＮＥ２及表达载体（ｐＳＧ５）的鼻咽癌细胞系ＨＮＥ２－ｐＳＧ５为对照,采用免疫共沉淀－Ｗｅｓｔｅｒｎ－ｂｌｏｔｔｉｎｇ方法在稳定表达ＬＭＰ１的鼻咽癌细胞系ＨＮＥ２－ＬＭＰ１中证实ＬＭＰ１与ＴＲＡＦ２是否直接形成免疫共沉淀复合物;②在ＨＮＥ２－ＬＭ     

EB病毒LMP1对鼻咽癌中瘤细胞分化的影响

目的　探讨EB病毒LMP1对早期鼻咽癌中瘤细胞分化的影响。方法　收集 31例早期鼻咽非角化性癌活检组织。采用DAKO公司的PNA探针和PNA原位杂交试剂盒检测EB病毒早期RNAs (EBERs)。应用免疫组化法检测LMP1,α catenin ,β catenin ,γ catenin以及高、低分子量细胞角蛋白。结果　 31例癌组织中均有相当数量的瘤细胞呈EBERs阳性 ,其中19例表达LMP1( 6 1.2 9% )。LMP1阳性组γ catenin的表达百分率 ( 5 3 .2 5± 34.12 % )明显低于LMP1阴性组 ( 80 .42±15 .77% ,P <0 .0 1)。γ catenin的表达与低分子量细胞角蛋白的表达间呈正相关 (r=0 .44 0 ,P <0 .0 5 )。α catenin ,β catenin和γ catenin的表达相互间呈两两正相关。结论　鼻咽癌中瘤细胞的LMP1能下调γ catenin的表达 ,从而抑制瘤细胞的分化。     

EB病毒LMP1对人鼻咽癌细胞转移能力的影响

背景与目的:EB病毒编码的潜伏膜蛋白1(latent membrane protein 1,LMP1)在鼻咽癌的浸润和转移过程中起重要的作用。本实验目的在于研究EB病毒LMP1对人鼻咽癌细胞转移能力的影响和探讨其中的相关机制。方法:应用免疫细胞化学RT-PCR法和Western blot检测LMP1、E-cadherin和intercellular adhesion molecule-1 (ICAM-1)在人高分化鼻咽癌细胞系CNE1和转染了LMP1基因的CNE1-GL细胞中的表达。应用细胞-细胞粘附实验、细胞-基质粘附实验、划痕实验和细胞运动实验观察LMP1对鼻咽癌细胞粘附和运动能力的影响。结果:免疫细胞化学结果显示:LMP1在CNE1和CNE1-GL细胞中的阳性率分别为0和(96.60±3.03)%(P<0.01);E-cadherin蛋白的阳性率分别为(37.47±1.50)%和(19.53±1.92)%(P<0.01);ICAM-1蛋白的阳性率分别为(5.27±1.45)%和(93.33±4.23)%(P<0.01)。RT-PCR和Westernblot结果表明,与CNE1细胞相比较,CNE1-GL细胞中E-cadherin的mRNA和蛋白表达明显降低(P<0.01),而ICAM-1的mRNA和蛋白表达则明显升高(P<0.01)。肿瘤细胞同质粘附实验显示,CNE1-GL细胞的同质粘附能力较CNE1细胞弱(P<0.05)。肿瘤细胞-基质粘附实验得出CNE1-GL细胞的异质粘附能力(A值=0.60±0.03)较CNE1细胞(A值=0.46±0.01)强(P<0.01)。肿瘤细胞运动实验显示,穿过PVPF膜的CNE1-GL细胞数多于CNE1细胞(119.3±6.0 vs 46.3±7.0,P<0.05)。结论:LMP1通过抑制E-cadherin表达、促进ICAM-1表达从而抑制肿瘤细胞的同质粘附能力、增强其异质粘附能力和运动能力来参与鼻咽癌的侵袭和转移。     

EB病毒LMP1在鼻咽癌细胞系中通过NF-κB、AP-1促进MMP9表达

目的 探讨EB病毒（Epstein-Barr Virus,EBV)LMP1是否通过NF－κB和AP－1促进MMP9表达,为全面阐明LMP1的分子致瘤机制提供实验依据。方法 将MMP9－CAT表达质粒导入HNE2－pSG5、HNE2－LMP1、HNE2－LMP1（1－185）、HNE2-LMP1(1-231)、HNE2－LMP1 Δ187-351鼻咽癌（nasopharyngeal carcinoma,NPC) 细胞系,比较各组细胞系的氯霉素乙酰转移酶（CAT）活性,以确定LMP1或其不同的结构域是否上调MMP9转录;采用明胶Zymography法检测上述细胞产生MMP9的活性,以确定LMP1或其不同的结构域是否促进MMP9蛋白表达;借助报道基因分析法确定在NPC中野生型LMP1能否激活NF－κB和AP－1的活性,进一步将突变了NF－κB或AP－1结合位点的MMP9－CAT表达质粒导入上述细胞系;比较相应的CAT活性,以确定LMP1或其不同的结构域是否通过NF－κB或AP－1上调MMP9表达。结果 与导入载体pCDNA3比较,HNE2－LMP1、HNE2－LMP1（1－185）、HNE2－LMP1（1－231）和HNE2－LMP1 Δ187－351 NPC细胞系CAT活性分别提高7.2,1.3,3.3和4．0倍。明胶Zymography法检测显示,在HNE2－LMP1、HNE2－LMP1（1－231）和HNE2－LMP1 Δ187－351细胞系中,均可检测到92000 MMP9活性,而HNE2－pSG5、HNE2－LMP1（1－231）几乎均为阴性。较之母细胞,野生型LMP1活化NF－κB及AP－1分别为13．8和8．4倍。导入NF－κB mut MMP9的HNE2－LMP1、HNE2－（1－231）和HNE2－LMP1 Δ187－351细胞系CAT活性,与导入MMP9－CAT相应的细胞系比较,分别下降至原有水平的18．1％、35．0％和29．1％;而导入AP－1 mut MMP9,则分别下降至原有水平的16．3％、33．3％5和26．1％,HNE2－pSG5、HNE2（1－185）影响不大。结论 LMP1 CTAR1与CTAR2可能通过NF－κB或AP－1促进MMP9表达,从而有助于NPC侵袭与转移。     

EB病毒LMP1在鼻咽癌细胞系中上调EGFR表达

目的 阐明LMP1在鼻咽癌（nasopharyngeal carcinoma,NPC)中对表皮生长因子受体（epidermal growth factor receptor,EGFR)的上调作用。方法 以稳定表达LMP1及其3种突变体的NPC细胞系为材料,以瞬间转染方法将肿瘤坏死因子受体相关因子（tumor necrosis factor receptor-associated factor,TRAF)1,2,3及其显性负性突变体导入稳定表达LMP1的NPC细胞系,用Western blottingy方法检查EGFR表达特征,以确定LMP1是否通过TRAF调控EGFR表达。在补加EGF无血清培养中,绘制HNE2－LMP1和HNE2－pSG5生长曲线,以了解LMP1诱导EGFR的功能效应。结果 在NPC细胞系中,LMP1通过TRAF1,2,3上调EGFR,其中LMP1 CTAR1（carboxy terminal activating regionl)介导该效应,与HNE2－pSG5细胞相比,在补加EGF无血清培养条件下,HNE2－LMP1细胞增殖较快。结论 LMP1CTAR1通过TRAF1,2,3上调EGFR,可能在NPC发生中起着重要作用。     

EB病毒LMP1在鼻咽癌细胞系中通过TRAF2活化NF-kB

目的：为了探讨ＥＢ病毒（ＥＢＶ）中ＬＭＰ１的致瘤机制,对鼻咽癌ＬＭＰ１激活重要的核转录因子ＮＦ－_ＫＢ的机制进行了研究。方法：①以ＬＭＰ１阴性的鼻咽癌细胞系ＨＮＥ２及表达载体（ｐＳＧ５）的鼻咽癌细胞系ＨＮＥ２－ｐＳＧＳ为对照,采用免疫共沉淀－Ｗｅｓｔｅｒｎ－ｂｌｏｔｔｉｎｇ方法在稳定表达ＬＭＰ１的鼻咽癌细胞系ＨＮＥ２－ＬＭＰ１中证实ＬＭＰ１与ＴＲＡＦ２是否直接结合形成免疫共沉淀复合物;②在ＨＮＥ２－ＬＭＰ１细胞系导入ＴＲＡＦ２表达质粒或不同剂量ＴＲＡＦ２显性负性突变体（ＴＲＡＦ２Ａ６－ ８６）表达质粒,以 ＮＦ－ｋＢ报道基因方法确定 ＬＭＰ1是否通过 ＴＲＡＦ2活化 ＮＦ－ｋＢ ;③将ＬＭＰ１（１－２３１）（ＣＴＡＲ２缺失区）或ＬＭＰ１△１８７－３５１（ＣＴＡＲＩ缺失区）及不同剂量ＴＲＡＦ２Ａ６－８６瞬时导入ＨＮＥ２中以证实ＬＭＰ１ ＣＴＡＲ１或ＣＴＡＲ２是否介导了这种效应;④以转染或未转染ＴＲＡＦ２６－８６的ＨＮＥ２－ＬＭＰ１细胞系为材料,应用免疫共沉淀－Ｗｅｓｔｅｒｎ－ｂｌｏｔｔｉｎｇ方法,确定ＴＲＡＦ２△６－８６是否竞争性抑制ＴＲＡＦ２与ＬＭＰ１结合。结果：①在ＨＮＥ２－ＬＭＰ１中ＬＭＰ１与ＴＲＡＦ２形成复合物     

EB病毒潜伏膜蛋白1（LMP1）的研究进展

EB病毒与鼻咽癌、Burkitt's淋巴瘤、传染性单核细胞增多症、霍奇金病和某些因机体免疫力下降而产生的淋巴增生性疾病密切相关,其中EB病毒与鼻咽癌的关系尤为受到重视.EB病毒潜伏膜蛋白1(LMP1)在细胞的恶性转化中起着相当重要的作用,又与鼻咽癌病人的治疗和预后有着密切的关系,本文就EB病毒潜伏膜蛋白1的研究近况与鼻咽癌治疗与预后判断进行综述.     

鼻咽癌组织中EB病毒LMP1的表达与癌细胞增殖和凋亡的关系

目的：探讨ＥＢ病毒编码的ＬＭＰ１在体内鼻咽癌细胞中,是否可能通过影响鼻咽癌细胞增殖和凋亡的生物学过程,而在鼻咽癌的发展演进过程中起作用。方法：采用ＴＵＮＥＬ法原位检测癌细胞的凋亡程度,用免疫组化ＬＳＡＢ法检测ＬＭＰ１、ＰＣＮＡ、Ｐ５３和ｂｌｃ－２蛋白表达;分析ＬＭＰ１的表达与癌细胞增殖、凋亡以及与ｐ５３、ｂｃｌ－２表达的相关性。结果：ＬＭＰ１的表达与否,与鼻咽癌细胞增殖活性的差异无显著意义,而与癌     

EB病毒LMP1促鼻咽癌细胞生长与CD23、bcl-2表达和凋亡的关系

目的：探讨ＥＢ病毒ＬＭＰＩ表达促鼻咽细胞系生长作用与ＣＤ２３、ｂｃｌ－２表达和细胞凋亡的关系。方法：用免疫组化ＬＳＡＢ法检测ＬＭＰＩ、ＣＤ２３和ｂｃｌ－２蛋白的表达;用ＭＴＴ法测定鼻咽癌细胞系的生长能力;用ＤＮＡＪ电泳法、流式细胞法和ＴＵＮＥＬ法检测癌细胞凋亡;用ＣＤ２３单抗阻断和ＭＴＴ法观察ＣＤ２３单抗对鼻咽产纱生长的影响。结果：表达ＬＭＰＩ的鼻咽癌细胞系（Ｌ－ＣＮＥＩ）的生长能力明显增强,并有     

EB病毒LMP1羧基端胞浆区介导端粒酶活化

目的 探讨EB病毒LMP1羧基端胞浆区与端粒酶活化的关系。方法 利用四环素衍生物强力霉素(Dox)调控LMP1表达的鼻咽癌细胞p^Tet-on-LMP1 HNE2，检测Dox诱导时细胞表达的端粒酶活性；将野生型LMP1表达质粒及其羧基端胞浆区、CTAR1功能域和CTAR2功能域分别缺失的表达质粒分别转染LMP1阴性的鼻咽癌细胞HNE2，观察端粒酶活性的变化情况。结果 在Dox诱导下，细胞表达的端粒酶活性较强；若HNE2细胞转染LMP1基因后，端粒酶活性明显升高。将LMP1羧基端胞浆区完全缺失后，端粒酶活性明显下降；若分别缺失CTAR1功能域和CRAR2功能域，端粒酶活性分别下降了4．43倍和2．88倍。结论 EB病毒LMP1可活化端粒酶活性，这一功能与LMP1羧基端胞浆区，特别是其功能域CTAR1和CTAR2密切相关。     

EB病毒与鼻咽癌相关的前瞻性观察

1986—1990年我们对广东省鼻咽癌高、中、低发区的四会、中山、广州、湛江、汕头共123087名健康人群进行了包括EB病毒血清学、鼻咽脱落细胞学、间接鼻咽镜及鼻咽光纤镜、鼻咽活检在内的前瞻性观察。在这队列中共发现鼻咽癌126例。通过本研究我们发现:(一)、EB病毒IgA/VCA阳性人群中鼻咽癌检出率是阴性人群的40.7倍;但阴性不能完全排除鼻咽癌可能性(二),IgA/VCA抗体的出现可先于鼻咽癌确诊4—46个月。(三)、有下列指标之一者应被视为鼻咽癌的高危人群;①IgA/VCA≥1:80。②IgA/VCA、IgA/EA、DNase三项中任何两项阳性。③上述三项中任何一项滴度持续上升。对列入高然对象者应争取作鼻咽光导纤维镜检查,并在好发部位取活检以发现更多临床T_0或T_1患者。     

EB病毒LMP1在鼻咽癌细胞系中通过TRAF2活化NF-κB

目的:为了探讨EB病毒(EBV)中LMP1的致瘤机制,对鼻咽癌LMP1激活重要的核转录因子NF-κB的机制进行了研究.方法:①以LMP1阴性的鼻咽癌细胞系HNE2及表达载体(pSG5)的鼻咽癌细胞系HNE2-pSG5为对照,采用免疫共沉淀-Western-blotting方法在稳定表达LMP1的鼻咽癌细胞系HNE2-LMP1中证实LMP1与TRAF2是否直接结合形成免疫共沉淀复合物;②在HNE2-LMP1细胞系导入TRAF2表达质粒或不同剂量TRAF2显性负性突变体(TRAF2Δ6～86)表达质粒,以NF-κB报道基因方法确定LMP1是否通过TRAF2活化NF-κB;③将LMP1(1～231)(CTAR2缺失区)或LMP1Δ187～351(CTAR1缺失区)及不同剂量TRAF2Δ6～86瞬时导入HNE2中以证实LMP1CTAR1或CTAR2是否介导了这种效应;④以转染或未转染TRAF2Δ6～86的HNE2-LMP1细胞系为材料,应用免疫共沉淀-Western-blotting方法,确定TRAF2Δ6～86是否竞争性抑制TRAF2与LMP1结合.结果:①在HNE2-LMP1中LMP1与TRAF2形成复合物沉淀,而HNE2-pSG5和HNE2为阴性.②在HNE2-LMP1细胞系导入TRAF2表达质粒,NF-κB活性增高20倍,而导入不同剂量TRAF2Δ6～86表达质粒时,随着剂量增大,NF-κB活性递减.③TRAF2强烈抑制LMP1(1～231)活化NF-κB,而仅部分抑制LMP1Δ187～351活化NF-κB.④TRAF2Δ6～86竞争性抑制TRAF2与LMP1结合.结论:在鼻咽癌中LMP1通过TRAF2而激活NF-κB,其中LMP1的CTAR1区主要介导了这种效应.这为我们进一步从信号传导通路来探讨LMP1的致癌机制提供了新的线索.     

鼻咽癌组织中EB病毒的不同原位检测方法比较

目的：探讨在鼻咽癌组织石蜡切片标本中原位检测ＥＢ病毒的更快速、更灵敏的方法。方法：用地高辛标记的寡核苷酸ＥＢＥＲ－１和ＥＢＶ ＤＮＡ的ＢａｍＨＩ－Ｗ片段为探针，分别用原位杂交、原位ＰＣＲ检测鼻咽癌组织切片中ＥＢＶ的分布情况。结果：用寡核苷酸ＥＢＥＲ－１作探针原位杂交检测ＥＢ病毒的方法比用ＢａｍＨＩ－Ｗ片段作探鱼原位杂交及原位ＰＣＲ的方法更灵敏、更简单。结论：用ＥＢＥＲ－１作探鱼原位杂交检测鼻咽癌组     

鼻咽癌细胞系SUNE中EBV—LMP1基因对永生化人胚肾上皮细胞生长 …

研究鼻咽癌细胞系ＳＵＮＥ中ＥＢ病毒潜伏膜蛋白１基因对上皮细胞生长特性的影响、探索ＬＭＰ１在鼻咽癌发生中所起的作用。方法 用ＬＭＰ１基因真核表达质粒转染人胚肾上皮细胞,检测ＬＭＰ１的表达,观察细胞的生长状态,生长速率,在软琼脂中的集落形成能力及对裸鼠的致瘤能力。     

人鼻咽癌细胞裸鼠体内演进中bcl—2、p53及c—erbB—2表达与EB病毒LMP1的关系

目的研究EB病毒LMP1在人高分化鼻咽癌细胞裸鼠体内演进中的作用及与bcl-2、p53及c-erbB-2蛋白表达的关系.方法将表达EB病毒LMP1的人高分化鼻咽癌细胞及对照阴性细胞移植于裸鼠体内,然后将移植瘤细胞再移入裸鼠建立第二代移植瘤,如此传至第三代,分别观察移植瘤的成瘤和生长的变化,以免疫组化和图像分析技术检测移植瘤细胞bcl-2、p53及c-erbB-2蛋白表达.结果表达LMP1的鼻咽癌细胞原代移植成瘤率达75.0%,比对照组显著增高(P＜0.01).平均潜伏期及体内倍增时间分别为29.6±7.7天和2.81±0.13天,比对照组明显缩短(P＜0.01).表达LMP1的鼻咽癌细胞(C1L)各代移植瘤的bcl-2蛋白表达阳性率显著低于对照组对应的各代细胞的表达(P＜0.01);bcl-2蛋白表达阳性率有显著下降趋势,对照组细胞bcl-2蛋白表达则呈峰值变化;各细胞系体内移植瘤细胞的p53及c-erbB-2蛋白表达的变化趋势较为相似,即各细胞系不同代间p53表达的阳性率有显著下降趋势,c-erbB-2蛋白表达阳性率有显著上升趋势.表达LMP1的鼻咽癌各代移植瘤细胞的p53及c-erbB-2蛋白表达阳性率显著高于对照组对应的各代(P＜0.01).结论LMP1使鼻咽癌细胞的生长能力增强,在癌细胞的演进中使其向去分化方向发展,这种作用可能通过bcl-2表达的替代通路,并使p53的积聚、活性受抑制和c-erbB-2蛋白表达增高来实现促进细胞增殖,在鼻咽癌细胞演进过程中可能起重要协同作用.     

EB病毒相关鼻咽癌PD-L1表达与预后相关性研究

摘 要：［目的］ 探讨鼻咽癌中EB病毒及细胞程序性死亡配体-1（programmed cell death ligand 1,PD-L1）表达及对预后的预测价值。［方法］ 87例接受根治性放化疗的初治非转移性鼻咽癌患者的病理切片,分别采用原位杂交法(in situ hybridization,ISH)和免疫组化法（immunohistochemistry,IHC)行EB病毒编码小RNA(EBV-encoded RNAs,EBER)和PD-L1表达的检测,并将EB病毒状态和PD-L1表达水平与患者近期疗效及长期预后行相关性分析,主要研究终点包括缓解率(response rates,RR)和总生存率(overall survival,OS)。［结果］ 87例鼻咽癌原发病灶病理组织切片中,8例(9.2%)EBER表达阴性,79例(90.8%)阳性;1例（1.1%）PD-L1表达阴性,50例(57.5%)低表达,36例(41.4%)高表达。EBER阳性患者中,PD-L1高表达者较多,但差异无统计学意义(P=0.062)。PD-L1高表达与患者较好的预后呈正相关。亚组分析显示在EBER阳性组中,PD-L1高表达与阴性/低表达者的5年无复发生存率(91.8% vs 78.5%,P=0.039,HR=0.382,95%CI：0.142~1.027) 和5年无进展生存率(82.5% vs 68.0%,P=0.036,HR=0.363,95%CI：0.135~0.974)差异显著,而在EBER阴性组中,PD-L1表达与预后无明显相关性。［结论］ PD-L1高表达与EBV相关鼻咽癌的局部复发和疾病进展相关,深入探讨鼻咽癌的免疫微环境将有助于筛选出免疫治疗的潜在获益人群。     

EB病毒潜伏膜蛋白1在鼻咽癌形成中的作用

EB病毒潜伏感染在鼻咽癌的形成中起着重要的作用.现综述近年来研究EB病毒潜伏膜蛋白1在鼻咽癌形成作用中的进展情况,并着重介绍其对细胞信号传导通路、血管生成及转移等的影响.     

EB病毒编码小RNA多态性与鼻咽癌的关系

目的 探讨EB病毒编码小RNA（EBERs)多态性与鼻咽癌发病趋势的联系。方法 巢式PCR扩增EBER－1和EBER－2序列，直接测序，比较鼻咽癌高发区广东地区鼻咽癌组织、正常人鼻咽黏膜组织和鼻咽癌低发区哈尔滨地区正常人漱口液感染的EB病毒EBERs序列差异。结果 广东地区鼻咽癌组织感染的EBERs具备1型病毒的特征。与原型株B95．8相比，广东地区鼻咽癌组织来源的EBER－2基因存在8处碱基替换和2处碱基缺失。但是，广东正常人鼻咽黏膜组织和哈尔滨地区正常人漱口液来源的EBERs也有相同的碱基替换和缺失。结论 鼻咽癌高发区和低发区流行的EB病毒EBERs序列呈现高度一致性。