Obestatin抑制3T3-L1前脂肪细胞的增殖与分化

目的:观察obestatin对3T3-L1前脂肪细胞增殖分化的影响.方法:应用不同浓度的obestatin (10-8 、10-9 、10-10、10-11、10-12 mmol/L)和10-10 mmol/L ghrelin干预体外培养的3T3-L1前脂肪细胞,MTT法观察其对细胞增殖的影响,并与空白对照组比较;分别应用10-10 mmol/L obestatin和ghrelin全程干预3T3-L1前脂肪细胞分化成熟过程(分化第1～10日),采用油红O染色法鉴定脂肪细胞分化并测定分化成熟脂肪细胞的脂肪含量,RT-PCR法检测分化过程中及成熟脂肪细胞过氧化物酶体增殖物激活受体γ2(PPARγ2) mRNA的表达水平,并与对照组(加常规诱导剂)比较.结果:与空白对照组相比,不同浓度obestatin组细胞数量均明显降低(P＜0.05);10-10mmol/L obestatin连续作用10 d的3T3-L1前脂肪细胞与对照组相比,脂肪产量明显减少(P＜0.05);脂肪细胞分化过程中PPARγ2基因表达逐渐增多;在成熟脂肪细胞中,与对照组相比,obestatin组PPARγ2基因表达显著降低(P＜0.05).Ghrelin的作用与之完全相反.结论:Obestatin抑制3T3-L1前脂肪细胞的增殖和分化.     

3T3-L1前体脂肪细胞诱导分化方法优化的初步探讨

目的 观察不同诱导剂对3T3-L1前体脂肪细胞诱导分化的作用。方法 在经典鸡尾酒诱导剂成分基础上,根据不同诱导剂成分,将3T3-L1前体脂肪细胞分为4组：（1）对照组;（2）罗格列酮干预组;（3）吲哚美辛干预组;（4）罗格列酮和吲哚美辛联合干预组。在诱导前体脂肪细胞分化过程中,通过显微镜观察细胞形态学变化、油红O染色以及检测胞内和胞外三酰甘油含量,评价各组成脂效率。结果 罗格列酮和吲哚美辛单独干预组及联合干预组前体脂肪细胞诱导过程中更早出现脂滴,且形成的脂滴也较对照组多,而油红O染色进一步证实以上结果。采用Image Pro Plus 6.0软件统计经油红O染色后的脂滴,单个脂滴的平均直径、平均面积以及最大直径,罗格列酮干预组和联合干预组均大于对照组,而吲哚美辛干预组与对照组比较,差异无统计学意义（P>0.05）。三酰甘油含量检测,胞外三酰甘油含量4组比较,差异无统计学意义,但胞内三酰甘油含量联合干预组高于对照组[（0.77±0.07）mmol/g vs（0.19±0.02）mmol/g,P<0.05]。结论 优化经典鸡尾酒诱导方法,在原成分基础上加用过氧化物酶体增生因子活化γ型受体（peroxisome proliferator-activated receptor,PPAR-γ）激动剂罗格列酮,可显著提高3T3-L1前体脂肪细胞的诱导效率。     

维拉帕米对前体脂肪细胞3T3-L1分化及脂质积聚的影响

目的:观察钙离子通道阻滞剂盐酸维拉帕米对3T3鄄L1前体脂肪细胞分化及脂质积聚的影响。方法:体外培养3T3鄄L1前体脂肪细胞,在常规诱导分化方案基础上加用维拉帕米(终浓度30μmol/L),采用油红O染色各分化时段脂肪细胞,计数含脂滴脂肪细胞数。结果:维拉帕米干预后,脂肪细胞分化速度低于正常对照,虽未影响脂滴出现的时间(第4天),但含脂滴脂肪细胞数均显著低于同期正常对照(P<0.001)。结论:维拉帕米具有抑制脂肪细胞分化及脂质积聚的作用。     

Resistin基因在3T3-L1前体脂肪细胞诱导分化过程中表达水平的变化

目的：观察Resistin基因在3T3-L1脂肪细胞诱导分化过程中不同时段表达水平的变化。探讨Resistin基因与脂肪细胞分化、脂质积聚之间的关系。方法：体外培养3T3-L1前体脂肪细胞，在诱导其向成熟脂肪细胞分化的不同时段（第0～10天）．采用RT-PCR技术检测脂肪细胞中Resistin基因mRNA的表达水平。结果：①Resistin基因在3T3-L1前体脂肪细胞诱导分化初期（第0～2天）不表达，分化第3天开始表达，分化第4～6天Resistin基因的表达显著上调，分化第6～10天Resistin基因的表达保持在较高水平并趋于稳定；②Resistin基因的表达水平除在诱导分化第3～4天、第6～10天内差异无显著性（P〉0．05）外，其余各时段间表达水平差异均有显著性（P〈0.01）。结论：Resistin基因可能参与了脂肪细胞分化的中晚期过程，在3T3-LI脂肪细胞分化过程中表达逐渐上调，其表达变化与脂肪细胞分化、脂质积聚过程相一致。     

维生素E抑制3T3-L1前脂肪细胞的分化

目的:研究维生素E对3T3-L1前脂肪细胞增殖和分化的影响。方法:利用MTT研究维生素E对3T3-L1前脂肪细胞增殖的影响,利用油红O染色法测定维生素E对3T3-L1前脂肪细胞分化的影响。结果:维生素E对3T3-L1前脂肪细胞增殖无影响,10～100μmol/L维生素E能抑制3T3-L1前脂肪细胞的分化。结论:维生素E对前脂肪细胞分化具有抑制作用。     

棕榈酸诱导3T3-L1脂肪细胞肥大模型的建立

目的:探讨棕榈酸对3T3-L1脂肪细胞内甘油三酯蓄积的影响,建立肥大脂肪细胞模型.方法:分别用0.0、0.1、0.2和0.4mmol/L棕榈酸诱导成熟3T3-L1 48b,用油红O染色法鉴定脂肪细胞,用甘油三酯酶法测定胞内甘油三酯浓度,采用细胞总蛋白浓度对胞内甘油三酯浓度进行校正.结果:0.0、0.1、0.2和0.4 mmol/L棕榈酸组甘油三酯水平分别为(5.0±0.6)、(6.9±1.4)、(5.7±0.5)和(5.6±0.7)μmol/mg,0.1 mmol/L棕榈酸组可引起造模组甘油三酯的浓度增加(P＜0.05).结论:0.1 mmol/L棕榈酸能诱导成熟3T3-L1内甘油三酯蓄积.     

辛伐他汀对3T3-L1脂肪细胞Apelin mRNA表达的影响

目的:观察辛伐他汀对3T3-L1脂肪细胞中Apelin mRNA表达影响,为探讨Apelin在心力衰竭发病中的作用以及他汀类药物抗炎作用提供依据.方法:用辛伐他汀溶液刺激诱导分化成熟的3T3-L1脂肪细胞,辛伐他汀浓度分别为0、1、10 μ mol/L,作用时间设为24h和48h.提取脂肪细胞总RNA,运用实时荧光定量聚合酶链反应技术测定Apelin mRNA表达量的变化.结果:经辛伐他汀干预后3T3-L1脂肪细胞Apelin mRNA表达降低,高浓度的辛伐他汀对Apelin mRNA的表达有显著的抑制作用(P<0.05).在相同药物浓度下,不同作用时间各组之间差异无显著性(P>0.05). 结论:辛伐他汀可使3T3-L1脂肪细胞中Apelin mRNA表达减少,并具有药物浓度依赖性.这可能部分解释了辛伐他汀的抗炎作用.     

反义Smad3抑制3T3细胞增殖和TGF-β1基因表达

目的研究反义Smad3对转化生长因子-β1(TGF-β1)基因表达的调控和对3T3细胞增殖的影响.方法构建反义Smad3质粒,以脂质体介导转染NIH3T3细胞,进行细胞计数,并用RT-PCR方法观察TGF-β1 mRNA的表达.结果反义Smad3能下调TGF-β1 mRNA的表达,并抑制3T3细胞增殖.结论可以通过阻断TGF-β1细胞内信号传导调控TGF-β1基因的表达并抑制细胞增殖.     

内质网应激可介导3T3-L1脂肪细胞胰岛素抵抗

目的观察内质网应激(ERs)抑制剂牛磺熊脱氧胆酸(TUDCA)对ERs诱导剂衣霉素(TM)介导的3T3-L1脂肪细胞胰岛素抵抗(IR)的干预效果,探讨脂肪细胞IR与ERs的关系。方法体外培养3T3-L1前脂肪细胞,并将其诱导分化为成熟的脂肪细胞。以MTT比色法检测不同干预条件下脂肪细胞存活情况、以葡萄糖氧化酶法(GOD)法检测不同干预条件下脂肪细胞葡萄糖消耗情况,利用Western blot检测不同干预条件下ERs关键信号蛋白(P-IRE、IRE)的表达差异。结果 (1)5μg/mL TM作用5h后可使胰岛素刺激的3T3-L1脂肪细胞葡萄糖消耗量降低19.7%(P<0.05),而1mmol/L TUDCA预处理24h后均可缓解TM的抑制作用。(2)Westernblot显示,5μg/mL TM作用5h明显增加P-IRE的表达,而经1mmol/L TUDCA预处理24h后可减少P-IRE的表达。不同处理因素对总IRE的表达无明显影响。结论 ERs可诱导3T3-L1脂肪细胞发生IR,缓解ERs可减轻IR。     

反义Smad3抑制3T3细胞增殖和TGF-β1基因表达

目的 研究反义Smad3对转化生长因子-β1(TGF-β1)基因表达的调控和对3T3细胞增殖的影响。方法 构建反义Smad3质粒,以脂质体介导转染NIH3T3细胞,进行细胞计数,并用RT-PCR方法观察TGF-β1 mRNA的表达。 结果 反义Smad3能下调TGF-β1 mRNA的表达,并抑制3T3细胞增殖。 结论 可以通过阻断TGF-β1细胞内信号传导调控TGF-β1基因的表达并抑制细胞增殖。     

缺氧对3T3-L1脂肪细胞脂代谢的影响

目的 研究缺氧状态下,脂肪细胞脂代谢的变化.方法 缺氧[1％氧(O2)、94％氮(N2)、5％二氧化碳(CO2)]处理分化成熟的3T3-L1脂肪细胞,Western-blotting观察不同时间点激素敏感型脂肪酶(HSL)、磷酸化HSL、磷酸化AMPK、脂肪酸合成酶(FASN)蛋白表达水平变化;收集培养液上清酶法测定甘油,分光光度法测定三酰甘油、游离脂肪酸、ATP脂肪细胞代谢产物.结果缺氧降低分化成熟的3T3-L1脂肪细胞ATP的产生;增加甘油及游离脂肪酸含量;激活AMPK,抑制FASN的蛋白表达,但缺氧对HSL蛋白表达无明显影响.结论 缺氧使脂肪细胞脂解增加,FFA水平升高.提示缺氧可能在肥胖炎症发生过程中起着重要作用.     

内脂素基因在3T3-L1前脂肪细胞诱导分化过程中表达水平的变化

目的观察3T3-L1前脂肪细胞诱导分化过程的不同时段内脂素基因表达水平的变化,探讨内脂素基因与脂肪细胞分化、脂质积聚之间的关系。方法体外培养3T3-L1前脂肪细胞,在该细胞生长至完全汇合（con-fluent）后2d,采用经典的鸡尾酒方法诱导其分化,并于诱导分化过程中用油红O染色鉴定脂肪细胞分化情况,采用RT-PCR和Western blot技术检测内脂素基因表达的变化规律。结果油红O染色显示,细胞内脂滴逐渐增大、增多,至分化末期占视野90%以上。内脂素基因在诱导分化初期不表达,分化第2天开始表达,分化第4~8天表达显著上调,分化至第10~12天,内脂素基因表达保持在较高水平并趋于稳定。其中,诱导分化后第6~12天较分化第0天显著升高（P〈0.05）,诱导分化第10~12天较第2~6天显著升高,诱导分化第12天较第6~8天显著升高（P〈0.05）。Western blot方法检测结果显示,随细胞分化成熟内脂素蛋白表达水平逐渐升高。结论内脂素基因与脂肪细胞分化和脂质积聚有密切的关系。     

3T3-L1前脂肪细胞分化过程中miRNAs表达谱的变化

目的探讨3T3-L1前脂肪细胞分化过程中微小RNA(miRNAs)表达谱的变化。方法3T3-Ll前脂肪细胞培养和诱导分化,通过形态学观察和RT-PCR方法,判断3T3-Ll前脂肪细胞是否分化成脂肪细胞。运用miRNAs芯片技术检测3T3-Ll前脂肪细胞和脂肪细胞中差异表达miRNAs。结果3T3-L1前脂肪细胞呈现成纤维状,诱导分化的第9天,细胞变成球形,内含许多脂滴;过氧化物酶体增殖物激活受体r2(PPARr2)和脂肪性脂肪酸结合蛋白(aP2)的表达显著增加。3T3-L1前脂肪细胞分化成脂肪细胞上调的miRNAs有26个,下调的miRNAs有2个。结论3T3-L1前脂肪细胞分化过程中存在miRNAs表达谱的变化。     

地塞米松对3T3-L1脂肪细胞的影响及二甲双胍的干预作用

目的观察地塞米松对3T3-L1脂肪细胞糖代谢的影响及二甲双胍的干预作用。方法体外培养3T3-L1前脂肪细胞,并诱导其分化成熟,研究地塞米松对脂肪细胞葡萄糖消耗量及二甲戏胍的干预作用。结果地塞米松刺激组葡萄糖消耗量明显降低,二甲双胍干预组葡萄糖消耗量显著增加,且呈剂量依赖性。结论地塞米松通过降低3T3-L1脂肪细胞葡萄糖消耗量产生胰岛素抵抗,二甲双胍通过增加葡萄糖消耗量改善抵抗状态下的3T3-L1脂肪细胞的代谢紊乱。     

CDK5介导的AMPK磷酸化对3T3-L1前脂肪细胞增殖及分化的影响

【立论依据】 AMPK是细胞及整体能量稳态的调控器。代谢综合征状态下,机体组织广泛存在AMPK活性下降,但AMPK如何失活仍存许多疑问。因此,弄清楚AMPK的失活机制对阐明代谢综合征的发病机制具有重要意义。 【设计思路】 有研究表明CDK5在肥胖小鼠脂肪组织中异常激活,AMPKα2的活性显著降低。同时,AMPKα2 345和529位丝氨酸满足Cdk5的底物一般都具有特定S/TPXK/R序列的条件。据此推测:活化的CDK5能够磷酸化AMPKα2 345和529位丝氨酸,进而抑制AMPKα2的活性,参与代谢综合征的发病。本课题拟在3T3-L1前脂肪细胞上研究Cdk5介导的AMPKα2蛋白磷酸化的作用,为代谢综合征和糖尿病的治疗提供新的思路。 【实验内容】 应用lipofectamine2000转染技术构建Cdk5 siRNA基因的脂肪细胞系3T3-L1-Cdk5 siRNA实验组及其阴性对照组细胞系3T-L1- Mock siRNA(Mock siRNA 为空siRNA转染),实验分为3T3-L1-Cdk5 siRNA组,3T-L1- Mock siRNA 组和3T-L1组,以AIMV无血清培养基培养3T3-L1细胞,使其自然增殖,于增殖第3天起用TNF-α作用于增殖中的3T3-L1细胞,之后每24小时以MTT法观察细胞增殖情况;采用含胰岛素、地塞米松与IBMX的分化培养基诱导分化3T3-L1细胞,于诱导分化第8天起用TNF-α作用于分化中的3T3-L1细胞,此后每3天以油红O染色并染料提取的半定量方法及细胞内甘油三酯测定的方法了解细胞内脂质含量;采用细胞Cdk5/P35和AMPKα2激酶活性定量检测试剂盒检测3T3-L1细胞中Cdk5和AMPKα2的活性,蛋白质印迹的方法检测3T3-L1细胞AMPKα2 ^S345 、AMPKα2 ^S529及AMPKα2^S345、⁵²⁹磷酸化水平。从而观察CDK5介导的AMPK磷酸化对3T3-L1前脂肪细胞增殖及分化的影响。 【材料】 3T3-L1前脂肪细胞,AIM-V medium,DMEM/F12 培养基,Cdk5 siRNA, AMPKα2激酶活性定量检测试剂盒,油红O, CO2细胞恒温培养箱。 【可行性】 Cdk5是脯氨酸引导的丝/苏氨酸蛋白酶,特异性磷酸化其底物蛋白的丝氨酸和苏氨酸位点。其磷酸化底物一般都有特定的S/TPXK/R序列。而人、大鼠和小鼠AMPKα2蛋白序列的自动抑制区345位丝氨酸和亚单元结合区域529位丝氨酸有共同的序列YLASSPPSGS 和TGSTLSSVSP,满足Cdk5的底物一般都具有特定的S/TPXK/R序列的条件,实验假设理论上具有可行性。 【创新性】 本课题以Cdk5介导AMPKα2磷酸化进而抑制其活性为切入点,探讨对3T3-L1前脂肪细胞增殖及分化的影响,具有一定的创新性。     

IL-6干预对3T3-L1脂肪细胞SAA表达的影响

目的观察IL-6干预对3T3-L1脂肪细胞血清淀粉样蛋白A（SAA）表达的影响。方法用不同浓度IL-6（0.1ng/ml,1ng/ml,10ng/ml）处理3T3-L1脂肪细胞24h、10ng/mlIL-6处理不同时间（6h、12h、24h）,用ELISA技术检测各组SAA的表达。结果TNF-a能显著促进3T3-L1脂肪细胞SAA的表达,并呈剂量和时间依赖方式。结论IL-6可以通过促进3T3-L1脂肪细胞SAA的表达和分泌,参与胰岛素抵抗及血管并发症的形成。     

氯化钴诱导低氧对3T3-L1脂肪细胞脂连蛋白表达的影响

目的研究体外模拟低氧对小鼠3T3-L1脂肪细胞脂连蛋白（ADPN）表达的影响。方法体外培养小鼠3T3-L1前脂肪细胞,将其诱导分化成为成熟的脂肪细胞,油红O染色鉴定脂肪细胞分化程度和脂质积聚情况。氯化钴（CoCl2）化学模拟脂肪细胞低氧环境,采用实时PCR（Real-TimePCR）检测低氧诱导因子-1α（HIF-1α）和ADPNmRNA的表达,蛋白质印迹法（Westernblotting）检测低氧诱导因子-1α（HIF-1α）的蛋白表达;酶联免疫吸附测定（ELISA）分析细胞培养上清液中ADPN蛋白的分泌水平。结果在CoCl,诱导3T3-L1脂肪细胞低氧的条件下,细胞内HIF-1αmRNA和蛋白的表达水平均显著上调;细胞内ADPNmRNA表达和细胞培养上清液中ADPN蛋白的分泌水平均显著下降;HIF-1αmRNA与ADPNmRNA的表达水平呈显著负相关（r=-0．854,P〈0．001）。结论CoCl2诱导低氧能够下调3T3-L1脂肪细胞ADPN的表达,该作用可能与脂肪细胞代谢功能障碍和胰岛素抵抗有关。     

咖啡酸苯乙酯对大肠癌细胞β-catenin蛋白表达的影响

目的探讨咖啡酸苯乙酯(caffeic acid phenethyl ester,CAPE)对体外培养的人大肠癌HCT116和SW480细胞β-catenin蛋白表达的影响.方法以大肠癌细胞株HCT116和SW480为研究对象,应用间接免疫荧光、Western blotting检测2.5、5.0、10 mg/L CAPE处理24、48 h后细胞β-catenin表达变化.结果Western blotting检测结果显示2.5、5.0、10mg/L CAPE处理HCT116和SW480细胞24、48 h后β-catenin总蛋白表达降低,呈剂量和时间依赖性,间接免疫荧光检测结果显示细胞β-catenin蛋白胞核及胞浆表达下调,细胞连接处胞膜表达上调.结论CAPE能明显下调β-catenin蛋白表达并阻止其核转位,这可能是其抗癌作用的重要分子机制.