广藿香醇合成酶基因Pc-PTS_1的克隆和生物信息学分析

目的:从广藿香总RNA中克隆广藿香醇合成酶基因(Pc-PTS_1),并对其进行生物信息学分析。方法:利用逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)和c DNA末端快速扩增技术(RACE)获得广藿香倍半萜合成酶基因Pc-PTS_1的cDNA全长序列,并利用生物信息学软件对该序列进行相似性和同源性分析,预测其编码蛋白的结构和功能。结果:广藿香倍半萜合成酶基因Pc-PTS_1的开放阅读框(ORF)全长1 713 bp,编码570个氨基酸,含有DDXXD保守序列,并与其他倍半萜合成酶基因具有较高相似性。结论:Pc-PTS_1的克隆及其生物信息学分析为其他倍半萜类合成酶基因的发现和研究提供参考,从分子生物学角度阐释其生物学功能,也为进一步研究其生物合成调控机制奠定基础。     

白木香AsMAPK3基因的克隆及表达分析

目的:克隆白木香中分裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase,MAPK)基因,检测其组织表达及诱导表达特性。方法:在454高通量测序获得部分c DNA序列基础上,利用RACE方法获得全长cDNA。采用NCBI在线Blastp、DNAman和MEGA4软件,对序列进行生物信息学分析。随后,通过荧光定量PCR检测目的基因的组织表达及诱导表达特性。结果:扩增到了白木香中分裂原活化蛋白激酶基因AsMAPK3,并对其进行了生物信息学分析和表达特性分析。结论:通过As MAPK3的克隆及分析,为后续验证其生物学功能奠定了基础。     

铁皮石斛倍半萜合成酶基因的克隆与表达分析

目的克隆铁皮石斛Dendrobium officinale倍半萜合成酶(sesquiterpene synthase,SES)基因,分析其在铁皮石斛不同组织中的表达差异以及在信号分子茉莉酸甲酯(methyl jasmonate,MeJA)诱导下的表达模式。方法采用RACE技术克隆铁皮石斛SES(DoSES)cDNA全长,利用相关软件和在线网站对其进行生物信息学分析,并使用实时荧光定量PCR技术分析DoSES的表达模式。结果获得的DoSES cDNA序列(Gen Bank登录号为KX278311)全长1 890 bp,含有1个1 659 bp的完整开放阅读框(ORF),编码552个氨基酸的多肽链,与其他科属植物的同源性达到60%左右。DoSES基因在铁皮石斛茎中表达量最高,从高到低依次是叶、花、原球茎、根;且受到Me JA的诱导。结论克隆了铁皮石斛DoSES基因,为进一步研究调控铁皮石斛萜类代谢奠定了理论基础。     

高良姜查尔酮合成酶基因的生物信息学和表达分析

目的获取高良姜查尔酮合成酶（chalcone synthase,CHS）编码基因cDNA 序列,明确其序列和功能特征 以及在高良姜中的表达模式。方法在前期高良姜转录组测序数据中挖掘CHS 的cDNA 全长及其编码区,利 用生物信息学方法对该基因蛋白的特征和功能进行分析,运用ClustalX1.83 和MEGA4.0 软件进行同源性比对 和系统进化树构建,采用实时荧光定量PCR（qPCR）分析CHS 在高良姜不同组织中的表达差异。结果高良姜 CHS 编码区为1 173 bp,编码391 个氨基酸。其编码蛋白是分子量为94.5 kDa 的亲水性蛋白,不含有信号 肽、转运肽、靶肽和跨膜结构域,具有CHS 保守功能域并归属于CHS 超级家族。CHS 在高良姜不同组织中的 表达模式为：根茎> 茎> 叶。结论成功获得高良姜CHS 序列,并分析其特征和表达模式,可为高良姜黄酮 类有效成分的生物合成研究提供参考。     

马蓝BcASB基因的克隆、生物信息学及表达分析

目的克隆马蓝邻氨基苯甲酸合成酶(anthranilate synthase,AS)BcASB基因(GenBank登录号QCF61930.1),并对其进行生物信息学分析、时空表达分析以及检测马蓝有效成分靛蓝、靛玉红积累量随时间的变化。方法通过RT-PCR和RACE技术,克隆BcASB基因全长,应用生物信息学的方法对该基因编码的蛋白进行各种理化性质测定,二级结构和三级结构预测分析以及对核苷酸和氨基酸序列进行比对;利用qRT-PCR技术检测BcASB基因在马蓝不同器官(根、茎、叶)中的表达模式以及在外源诱导子茉莉酸甲酯(methyl-jasmonate,MeJA)、脱落酸(abscisic acid,ABA)、水杨酸(salicylic acid,SA)和乙烯利(ethylene,ETH)诱导下的表达情况;同时运用HPLC测定吲哚类生物碱靛蓝、靛玉红含量的变化情况。结果克隆获得BcASB基因,开放阅读框(open reading frame,ORF)长度为765 bp,编码256个氨基酸,生物信息学表明,该蛋白不含信号肽且无跨膜区,亚细胞结构定位于叶绿体;qRT-PCR检测结果表明,BcASB基因在马蓝叶和茎中的表达量较高,在根中表达较低;BcASB基因可响应不同外源诱导处理,而影响其转录;HPLC检测结果显示靛蓝、靛玉红含量有着明显的变化。结论成功克隆马蓝邻氨基苯甲酸合成酶BcASB基因,为进一步阐释该基因在马蓝吲哚类生物碱合成途径的作用及表达调控研究奠定基础。     

红花查尔酮合成酶基因的克隆、生物信息学分析及表达

目的克隆红花查尔酮合成酶基因(chalcone synthase,CHS),运用生物信息学分析CHS,比较花期中每天CHS的表达,为红花有效成分合成及调控机制研究提供基础。方法从新鲜红花花冠中提取RNA,反转录为cDNA,设计特异性引物,克隆获得CHS。通过生物信息学对该基因蛋白的特征进行分析,使用MEGA5.1构建CHS与相关物种CHS的系统进化树,利用real-time PCR分析花期中每天红花CHS的表达量,并进行分析和比较。结果克隆获得的红花CHS,序列全长为1 149 bp,具有1 041 bp的完整开放阅读框,编码346个氨基酸。将该蛋白通过NCBI上的Blastp比对发现,该蛋白属于CHS家族,比对结果显示红花CHS与100余种NCBI上登录的植物有相似性,其中与水飞蓟、翠菊、菊花、红凤菜的相似性分别达95%、95%、94%、94%。将相似性在90%以上的物种用MEGA5.1构建进化树,结果显示红花CHS与水飞蓟CHS亲缘关系最近。通过ProtParam预测红花CHS蛋白分子式为C1678H2693N451O493S20,相对分子质量为37 700,等电点为6.10,负电荷的氨基酸残基数(Asp+Glu)为42,正电荷的氨基酸残基数(Arg+Lys)为38。基因表达分析结果表明红花CHS在花期第3天的相对表达量最高,远远高于花期其余时间。结论成功克隆、分析并表达了红花CHS,为红花有效成分合成及调控机制研究提供基础。     

卷叶贝母环阿屯醇合成酶基因的克隆及表达分析

目的对卷叶贝母Fritillaria cirrhosa中参与生物碱合成的关键酶环阿屯醇合成酶(cycloartenol synthase,CAS)基因进行克隆,并对其进行生物信息学和表达分析。方法基于转录组测序结果,通过PCR技术克隆卷叶贝母CAS基因(FcCAS)开放阅读框(open reading frame,ORF)序列,并基于在线工具对cDNA序列进行生物信息学分析。通过荧光定量(q RT-PCR)手段检测FcCAS在野生鳞茎与愈伤组织(通过激素组合刺激获得的组织培养物)中的表达情况并测定总生物碱的含量。结果 FcCAS编码区ORF长为2 271 bp,编码756个氨基酸,并与NCBI上公布的天门冬、芭蕉、油棕等植物CAS蛋白的相似性达80%以上;qRT-PCR与总生物碱含量测定实验表明FcCAS的表达水平与总生物碱含量的变化趋势一致,都是愈伤组织高于野生鳞茎。结论 FcCAS在不同组织状态下表达量差异较大,FcCAS是一个有生物学功能的蛋白质,受激素组合诱导表达,为进一步研究CAS对卷叶贝母生物碱含量的影响和表达调控奠定基础。     

白木香转录因子AsNAC2的克隆及表达分析

目的 对珍稀南药沉香基原植物白木香Aquilaria sinensis As NAC2转录因子进行分子克隆,并对其进行生物信息学和表达模式分析。方法 以白木香茎的总RNA反转录的c DNA为模板,采用PCR技术获取基因编码序列（coding sequence,CDS）全长;利用生物信息学软件预测蛋白的理化性质、结构域和亚细胞定位等特性;运用DNAMAN8.0和MEGA6.0等软件分别进行多序列比对和进化关系分析;利用qRT-PCR技术检测AsNAC2基因在不同组织和伤害胁迫下的表达特性。结果克隆获得AsNAC2基因（GenBank注册号MT130201）,开放阅读框（openreadingframe,ORF）全长864bp,编码1条由287个氨基酸组成的弱酸性的稳定的亲水性蛋白,该蛋白定位在细胞核中,不存在跨膜结构域。序列比对和系统进化树分析显示,As NAC2蛋白N端具有典型的NAM结构域,与锦葵目中的可可、哥伦比亚锦葵和榴莲NAC 2-like蛋白亲缘关系近,属于NAC转录因子家族中的ATAF亚组。qRT-PCR结果显示,AsNAC2基因主要在健康白木香的根和茎中表达,全断干伤害可...     

白木香法呢基焦磷合酶基因AsFPS1的克隆及表达分析

法呢基焦磷酸合酶(FPS) 是倍半萜代谢途径中的关键限速酶之一.本研究在454高通量测序已获得的cDNA序列基础上,PCR扩增其开放阅读框并测序验证;提取三年生白木香根、茎、叶的总RNA及健康和伤害处理的愈伤组织的总RNA,以反转录成的单链cDNA为模板进行荧光定量PCR,检测AsFPS1基因的组织表达特异性及对伤害处理的反应.结果表明,扩增到的AsFPS1基因全长1 342 bp,开放阅读框1 029 bp,编码342个氨基酸.组织表达分析的结果显示,AsFPS1基因主要在根和茎中表达,叶中的表达量较低;该基因同时受物理伤害和结香液处理的诱导,分别在6,12 h达到最高表达水平.通过AsFPS1基因全长cDNA的克隆和表达分析,为后续研究其生物功能及沉香倍半萜合成机制奠定了基础.     

3种瞬时表达体系研究1个白木香倍半萜合酶的亚细胞定位

目的 研究1个白木香倍半萜合酶（ASS）的亚细胞定位,确定其功能区域,并比较3种瞬时表达体系在亚细胞定位研究中的优劣。方法 从白木香愈伤组织中提取总RNA,采用特异引物RT-PCR方法克隆倍半萜合酶ASS基因,并连接于pEZS-NL载体和pFGC5941GFP改造载体上,分别构建pFGC5941-GFP-ASS、pEZS-NL-ASS-GFP 2种植物表达载体,分别利用根癌农杆菌侵染烟草叶片、基因枪轰击洋葱表皮细胞、PEG转化白木香原生质体3种技术进行瞬时转化表达,激光共聚焦显微镜下观察表达出的绿色荧光蛋白（GFP）融合蛋白的亚细胞定位。结果 在烟草叶片表皮细胞、洋葱表皮细胞及白木香原生质体中,融合蛋白绿色荧光均能被观察到。ASS基因与GFP的融合蛋白产物在烟草叶片中定位于胞质,在洋葱表皮中定位于胞质和细胞核,白木香原生质体中定位于胞质和质体。结论 ASS基因在白木香原生质体胞质及质体定位;对3种体系的结果比较表明,应用不同体系研究蛋白的亚细胞定位可能出现不同的结果,这可能与同源或异源表达的植物细胞的特性有关。     

白木香2个小分子热激蛋白基因的克隆及表达分析

目的从白木香Aquilaria sinensis中克隆sHSP1和sHSP2基因,并对它们的生物信息学及表达模式进行分析。方法根据本课题组白木香转录组数据库进行分析获得2条具有小分子热激蛋白(sHSPs)保守结构域的sHSPs基因序列,利用RT-PCR技术克隆sHSP1和sHSP2基因的全长c DNA序列,并对其进行生物信息学分析;利用实时荧光定量PCR检测sHSP1和sHSP2基因在不同组织和高盐及外源ABA、SA、MJ处理下不同时间的表达差异。结果克隆得到的白木香sHSP1和sHSP2基因开放阅读框都为474 bp,编码157个氨基酸。组织表达分析的结果显示,sHSP1和sHSP2基因主要在根中表达,在茎和叶中的表达量较少;白木香愈伤组织在高盐处理下,sHSP1和sHSP2基因分别在36 h和24 h达到最高表达水平,而愈伤组织在外源ABA、MJ处理下,sHSP1和sHSP2基因都在12 h达到最高表达水平,在SA处理下,sHSP1和sHSP2基因分别在12、24 h达到最高表达水平。结论获得了sHSP1和sHSP2 2基因全长c DNA序列,且2个基因在不同组织根、茎、叶中的表达存在差异性,在受到高盐和外源ABA、SA、MJ处理时,在不同时间的愈伤组织中的表达及积累情况也不同,该研究为后续深入研究白木香防御反应奠定了基础。     

白木香AsMAPK3基因的原核表达及其在洋葱表皮瞬时表达体系中的定位研究

目的构建国产沉香基原植物白木香AsMAPK3基因的原核表达载体,诱导重组蛋白正确表达,并研究AsMAPK3的亚细胞定位情况,为抗体制备准备材料,为筛选其互作蛋白及进一步研究其功能奠定基础。方法通过PCR方法克隆AsMAPK3基因的部分编码序列,构建重组原核表达载体pET-28a-AsMAPK3,并诱导蛋白表达。克隆AsMAPK3基因全长编码区,构建绿色荧光蛋白(GFP)瞬时表达载体pAN580-AsMAPK3,通过基因枪法转化洋葱表皮,荧光显微镜观察GFP的发光情况。结果含有重组表达载体的大肠杆菌BL21(DE3)在37℃经0.5 mmol/L异丙基硫代β-D-半乳糖苷(IPTG)诱导4 h后,可获得相对分子质量约为39 000的融合蛋白,该融合蛋白在上清和包涵体中均有表达。瞬时转化洋葱表皮的GFP荧光观察发现,AsMAPK3主要在细胞核和质膜表达。结论成功实现了AsMAPK3的体外表达和纯化,明确了AsMAPK3的亚细胞定位,为后续开展其功能研究奠定了基础。     

白木香AsNINJA1基因全长cDNA克隆及其在愈伤组织中的茉莉酸甲酯诱导表达

目的 克隆国产沉香基原植物白木香Aquilaria sinensis互作蛋白(jasmonate Zim-domain,JAZ)基因(NINJA),为深入研究其在沉香倍半萜合成途径中的功能奠定基础。方法 以白木香总RNA为模板,采用RACE法和RT-PCR方法,克隆白木香NINJA基因cDNA全长,并进行生物信息学的分析;采用实时荧光定量(qRT-PCR)方法分析经茉莉酸甲酯(MeJA)处理的白木香愈伤组织中AsNINJA1基因的表达模式。结果 获得白木香NINJA基因全长cDNA,命名为AsNINJA1。序列分析表明,该基因的序列全长为1 982 bp,包含一个1 221 bp的开放阅读框,编码406个氨基酸,蛋白质相对分子质量为43 697,等电点为6.02。qRT-PCR结果显示,经MeJA处理4 h后AsNINJA1基因相对表达量最高,是对照(未经MeJA处理的白木香愈伤组织)的近100倍,随后显著下降。结论 获得AsNINJA1基因全长cDNA序列,该基因对MeJA诱导极为敏感,且能在伤害早期响应。     

白木香转录因子AsWRKY62的分子克隆、原核表达及特性分析

目的对白木香AquilariasinensisAsWRKY62转录因子进行分子克隆、原核表达,并对其进行生物信息学分析和表达特性分析,为深入研究AsWRKY62在白木香生长发育、沉香形成等方面的功能奠定基础。方法以白木香愈伤组织总RNA反转录的cDNA为模板,采用RT-PCR及PCR技术克隆基因编码序列(CDS)全长;构建pET-21a-AsWRKY62原核表达载体,转化大肠杆菌BL21 (DE3)感受态进行原核诱导表达;并通过生物信息学软件预测蛋白的理化性质、结构域和亚细胞定位等特性;用软件DNAMAN和MEGA5分别进行氨基酸多序列比对和进化关系分析,通过组织特异性表达分析不同组织中的基因表达模式。结果 AsWRKY62(GenBank注册号MH925301)基因CDS全长为1 581bp,编码一条由526个氨基酸组成的多肽,结构域分析表明其属于WRKY group I类蛋白;密码子优化后的pET-21a-AsWRKY62在大肠杆菌BL21(DE3)中成功诱导的较适条件为0.5mmol/LIPTG37℃连续培养4h;As WRKY62基因具有组织特异性,其在根、茎中表达量最高,其次是沉香层和花中。结论本研究首次在白木香中克隆AsWRKY62,并进行原核表达和生物特性分析,表明其可能与沉香的形成有关,也为进一步研究其生物学功能提供了理论依据。     

白木香种质资源ISSR标记的遗传多样性分析

目的 白木香Aquilaria sinensis是中国特有的、具有极高经济价值的珍稀濒危药用植物,由于人类对其自然资源的长期过度开发和生态破坏,白木香现仅有零星散生的野生资源,为更好地保护和利用白木香,现对其进行遗传多样性分析。方法 采集了中国14个地区的232份白木香样本,并利用ISSR标记对其进行遗传多样性评价。结果 ISSR标记具有较高的多态性（100%）,表明ISSR是检测白木香遗传多样性的有效方法。对所有样本进行遗传分析,在相似系数为0.71时,可将其聚为4个类群。期望杂合度（He）、Shannon’s信息指数（I）在XL群体中最高,而61.84%的遗传变异发生在群体之间。种群结构分析表明,14个种群能够按照区域和来源进行严格划分,说明种群间的基因交换很少。结论 白木香种源有较好的遗传多样性,但野生资源大幅减少,需加强白木香资源的保护、繁育和利用。     

白木香转录因子AsMYB1和AsMYB2克隆及表达分析

MYB类转录因子是数量最多、功能最多样化的转录因子家族之一。该研究根据白木香转录组高通量测序结果设计引物扩增白木香中MYB基因,利用RT-PCR技术从白木香中首次克隆得到2个MYB基因c DNA全长,分别命名为AsMYB1,AsMYB2,并对MYB蛋白质进行跨膜结构分析和聚类分析,预测其生物学信息;利用实时荧光定量PCR技术检测AsMYB基因在不同组织,及在NaCl、低温(4℃)、重金属(CdCl_2)、干旱(甘露醇)4种非生物胁迫和脱落酸、水杨酸、赤霉素、茉莉酸甲酯4种外源激素处理下的表达差异。该研究中克隆获得的AsMYB1基因全长1 063 bp,编码353个氨基酸;AsMYB2基因全长1 081bp,编码359个氨基酸。2个基因具有组织表达特异性;AsMYB1,AsMYB2基因的转录水平受到不同生物胁迫和外源激素的影响,说明MYB基因对白木香防御反应和激素信号传导具有重要的作用。     

白木香AsJAZ1基因原核载体的构建与表达

克隆国产沉香基原植物白木香Aquilaria sinensis jasmonate-zim-domain protein(As JAZ1)基因的编码区,构建原核表达载体及诱导重组蛋白的表达,为筛选互作蛋白因子和研究基因功能奠定基础。该实验以白木香叶片中分离的总RNA为模板,通过RT-PCR方法克隆到茉莉酸信号转导抑制蛋白基因JAZ(As JAZ1)的编码区全长序列,克隆到原核表达载体p ET-28a上,构建重组原核表达载体p ET-28a-As JAZ1,经酶切鉴定和测序验证后将其转入大肠杆菌BL21(DE3),在37℃经0.5 mmol·L-1异丙基硫代β-D-半乳糖苷(IPTG)诱导表达4 h后,可获得相对分子质量约为39 k Da的融合重组蛋白的高效表达。该重组蛋白在大肠杆菌的上清和沉淀中均有表达,但以包涵体表达为主。