rhBMP2缓释微球对牙龈成纤维细胞的生物学作用

目的：观察甲基丙烯酸缩水甘油酯右旋糖酐(dex-GMA)载重组人骨形态发生蛋白-2(rhBMP2)缓释微球(MPs)对体外培养的人牙龈成纤维细胞(GFCs)的生物学作用。方法：采用体外细胞培养技术,将rhBMP2缓释微球和GFCs一起培养,采用M1Tr法检测其对GFCs的增殖状况的影响;碱性磷酸酶(ALP)检测试剂盒检测细胞ALP活性以反映rhBME2缓释微球对其分化状况的影响,并与单纯rhBMP2的作用进行比较。结果：rhBMP2缓释微球具有良好的生物学活性,能显著促进的GFCs增殖及分化,并维持10d以上,其效应高于单纯施加rhBMP2的效应。结论：所制备的rhBMP2微球比单纯rhBMP2对GFCs有更为明显的生物学效应,可以达到对生长因子的有效缓释。     

重组人骨形成蛋白-2聚氰基丙烯酸正丁酯纳米微球缓释系统对骨髓间充质干细胞增殖分化影响的实验研究

目的明确重组人骨形成蛋白(rhBMP)-2聚氰基丙烯酸正丁酯纳米微球缓释系统对骨髓间充质干细胞(BMSCs)增殖和分化的影响。方法在rhBMP-2纳米微球作用于BMSCs后,采用嗜银蛋白(AgNORs)染色法检测细胞的增殖状况;采用反转录PCR方法,观察细胞中骨钙素、碱性磷酸酶及Ⅰ型胶原mRNA水平表达的改变以反映对细胞分化的影响,并与单纯rhBMP-2作用细胞后的结果进行比较。结果该纳米微球缓释系统能显著促进BMSCs的增殖以及细胞中骨钙素、碱性磷酸酶及Ⅰ型胶原mRNA水平的表达,且均高于单纯rhBMP-2的作用。结论rhBMP-2纳米微球缓释系统促进BMSCs增殖以及向成骨细胞方向分化的作用强于单纯rhBMP-2的作用。     

rhBMP2纳米缓释系统的制备及其对骨髓间充质干细胞增殖和分化的影响

目的：制备甲基丙烯酸缩水甘油酯右旋糖酐（dex-GMA）载重组人骨形态发生蛋白2（rhBMP2）凝胶纳米微球（NPs）缓释系统,检测其理化及生物学特性.方法：采用改良乳化溶液聚合法,制备rhBMP2纳米微球（rhBMP2-dex-NPs）;观察其形态、粒径与稳定性,检测其载药、释药特征;采用体外细胞培养技术,将rhBMP2-dex-NPs和兔骨髓间充质干细胞一起培养,MTT法检测其对细胞增殖状况的影响,碱性磷酸酶（ALP）检测试剂盒检测细胞ALP活性,以反应rhBMp2-dex-NPs对其分化状况的影响,并与单纯rhBMP2的作用进行比较;实验按照培养液中所含成分不同分为4组：培养液中加入单纯rhBMP2（A组）、加入rhBMP2-dex-NPs（B组）、加入空白NPs（C组）和对照组（D组）,其中A、B 2组均分别按照rhBMP2的不同量设置100μg/L、200μg/L、400μg/L 3个浓度组,采用SPSS 10.0对结果进行统计学分析.结果：rhBMP2-dex-NPs大小均匀,粒径分析表明,80%的纳米球粒径在20nm左右,包封率高达83%,80%的rhBMP2在前12d释放;其具有良好的生物学活性,能显著促进骨髓间充质干细胞（BMSCs）的增殖和分化,效应高于单纯施加rhBMP2的效应（P＜0.01）.rhBMP2-dex-NPs与BMSCs共培养3d内,反应BMSCs增殖和分化的OD值与A组无显著差异（P＞0.05）,但显著高于C、D组（P＜0.01）;3d后,rhBMP2-dex-NPs对细胞增殖和分化的促进作用较单纯rhBMP2明显加快;5～7d后,A、B组差异具有显著性（P＜0.01）;12d左右,B组细胞仍然有较强的增殖与分化能力,与其他3组有非常显著差异（P＜0.001）,而此时A、C、D组间差异已无统计学意义（P＞0.05）.结论：所制备的rhBMP2-dex-NPs形态良好、包封率高,理化与生物学性能稳定,可以达到对生长因子的良好缓释,比单纯rhBMP2对BMSCs有更为明显的生物学效应,可以持续促进其增殖与分化达10d以上,在组织工程领域有着广阔的应用前景.     

rhBMP-2-PLA纳米微球的制备及生物学效应观察

目的:制备rhBMP-2-PLA纳米微球缓释系统,观察其对兔成骨细胞的生物学效应。方法:采用复乳-干燥法制备rhBMP-2纳米微球,观察其一般特性,并模拟体内条件研究BMP-PLA纳米微球的体外缓释特性。采用MTT法检测微球对成骨细胞增殖状况的影响,并与单纯rhBMP-2的作用进行比较。结果:纳米微球表面光滑圆整,球体大小均匀,平均粒径为45 nm,rhBMP-2-PLA纳米微球的包封率和载药量分别为(90.67±1.23)%和[(134.65±0.44)×10-3]%,微球体外释药符合Higuichi方程。该微球缓释系统有生物活性,能显著促进兔成骨细胞的增殖,其效应高于单纯施加rhBMP-2的效应。结论:rhBMP-2-PLA纳米微球缓释系统的作用明显优于单纯rhBMP-2,在骨创伤的治疗中有良好的前景。     

rhBMP-2及其纳米微球缓释系统对成骨细胞钙结节影响的实验研究

目的 :观察rhBMP 2聚氰基丙烯酸正丁酯纳米微球缓释系统对成骨细胞钙结节的影响。方法 :培养诱导成骨细胞形成钙结节 ,并对其行特异性染色 ;在rhBMP 2纳米微球对钙结节作用后 ,采用扫描电镜观察其表面形态的改变 ,采用能谱仪分析比较其组成成分的改变。结果 :rhBMP 2纳米微球能明显促进钙结节形成 ,且rhBMP 2纳米微球作用后钙结节中钙磷含量显著高于单纯rhBMP 2组。结论 :rhBMP 2纳米微球缓释系统促进成骨的作用优于单纯rhBMP 2。     

bFGF聚乳酸纳米微球对兔成骨细胞增殖的影响

目的：观察碱性成纤维生长因子聚乳酸纳米微球缓释系统（bFGF—PLA—Ns）对体外培养的兔成骨细胞的增殖影响。方法：体外培养兔成骨细胞并鉴定,将bFGF—PLA—Ns和成骨细胞一起培养,采用MTr法检测微球对成骨细胞增殖状况的影响,免疫组化检测增殖细胞核抗原（PCNA）在成骨细胞中表达,并与单纯bFGF的作用进行比较。结果：bFGF—PLA—Ns具有良好的生物活性,能显著促进兔成骨细胞的增殖,其效应高于单纯施加bFGF的效应。结论：制备的bFGF—PLA—Ns比单纯的bFGF有更为显著的生物学效应,在骨创伤的治疗中有良好的前景。     

嵌入BMP-2蛋白微球双重缓释纳米纤维支架对MC3T3-E1细胞增殖、分化的影响

目的: 利用静电纺丝技术构建骨形态发生蛋白2(bone morphogenetic protein,BMP-2)缓释纳米微球(nanospheres,NPs）的聚己内酯（polycaprolactone,PCL）复合纳米纤维支架材料,评价其对MC3T3-E1细胞增殖、分化的影响。方法: 采用去溶剂法和静电自组装技术制备载BMP-2的壳聚糖纳米微球,检测其形貌、粒径及成分,BMP-2蛋白包封率及体外缓释情况。利用静电纺丝技术制备含BMP-2纳米微球的PCL复合支架材料,检测其形貌、亲水性能及BMP-2蛋白的缓释情况。进行体外细胞学实验,观察细胞在材料中的生长情况,检测材料促细胞成骨分化过程中碱性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)、相关基因和矿化结节的形成情况。采用SPSS 21.0软件包进行统计学分析。结果: 成功制备出结构稳定的纳米微球结构,微球载药率高并可实现BMP-2的持续释放。PCL/BNPs支架材料组有着良好的亲水性能并有利于细胞增殖、分化。体外细胞实验结果显示,细胞在支架上铺展良好,黏附数量增加。ALP和相关成骨基因COL1、OPN和RUNX2均表达增高,钙结节大小和数量明显增加。结论: BMP-2缓释纳米微球的聚己内酯复合纤维支架材料可为骨组织工程的发展提供新的材料选择。     

TGFβ和rhBMP2对人牙周膜成纤维细胞的作用

目的 研究转化生长因子β（TGFβ）和重组人骨形成蛋白2（rhBMP2)对人牙周膜成纤维细胞（HPDLFs)增殖和分化的作用。方法 观察TGFβ和rhBMP2单独、同时和相继应用对培养的HPDLFs增殖、碱性磷酸酶（ALP）活性，骨钙素（OC）合成及矿化结节形成的作用。结果 TGFβ刺激HPDLFs增殖，对ALP活性，OC合成和矿化结节形成无明显影响；rhBMP2对HPDLFs增殖无明显作用。却显著提高其ALP活性，刺激OC合成和矿化结节形成；两者同时应用时对细胞增殖和分化的作用居于单独作用之间；先应用TGFβ对随后rhBMP2的促分化作用无明显影响；先应用rhBMP2再应用TGFβ对HPDLFs的分化具有显著的刺激作用。结论 RhBMP2能刺激HPDLFs表达成骨细胞表型，TGFβ对BMP2诱导的细胞分化具有明显的刺激作用。两者可能在促进HPDLFs向成骨细胞表型分化的不同阶段发挥作用。     

海藻酸钠-去铁胺/壳聚糖微球对大鼠骨髓间充质干细胞成骨分化的影响

目的 ：探讨海藻酸钠（sodium alginate,SA）-去铁胺（deferoxamine,DFO）/壳聚糖（chitosan,CS）微球对大鼠骨髓间充质干细胞（bone mesenchymal stem cells,BMSCs）增殖及成骨分化的影响。方法：将化学接枝DFO的SA与CS多孔微球通过静电吸附作用制备SA-g-DFO/CS微球，检测其形貌、孔隙率、孔径及DFO体外释放情况。体外分离、培养大鼠BMSCs，与SA-g-DFO/CS微球共培养、成骨诱导分化，以MTT法检测细胞增殖状态，钙黄绿素（calcein acetoxymethyl ester,Calcein-AM）/碘化丙啶（propidium,PI）细胞双染观察细胞活性，检测微球促细胞分化过程中碱性磷酸酶（alkaline phosphatase, ALP）、成血管及成骨相关基因的表达。采用SPSS 22.0软件包对数据进行统计学分析。结果：成功制备SA-g-DFO/CS多孔微球，可实现DFO缓释。与SA/CS微球相比，SA-g-DFO/CS多孔微球有利于细胞增殖、分化。ALP和成血管相关基因缺氧诱导因子1α(hyp...     

rhBMP-2微球温敏型凝胶剂的药剂学特征及对人PDLCs增殖的影响

目的：观察rhBMP-2微球温敏型凝胶的药剂学特征及对人牙周膜细胞（PDLCs）增殖的影响。方法：采用W／O／W型乳化溶剂挥发法以聚乳酸-乙醇酸共聚物（PLGA）为材料制备空白微球,通过吸附法制备rhBMP-2载药微球。以单甲基聚乙二醇-羟基乙酸共聚物（MPEG—PLGA）为材料制备凝胶,采用夹心酶联免疫吸附法测定释药速度。采用四唑盐比色法（MTT）及酶动力学法测定细胞增殖和碱性磷酸酶活性。结果：rhBMP-2微球呈规则球形,表面多孔,粒径为（19．6±2.3）μm,微球凝胶剂相转变温度为36℃左右,微球凝胶剂体外释药曲线符合Higachi方程,28d的累积释放度为80％。rhBMP-2微球凝胶剂能明显促进牙周膜细胞的增殖和提高ALP活性,随时间推移在第10d时rhBMP微球凝胶促PDLCs生长的作用明显强于rhBMP溶液。结论：rhBMP-2微球温敏型凝胶剂具有明显的缓释特征,与溶液剂相比促进PDLCs增殖作用更持久。     

rhBMP-2及rhbFGF对兔骨髓间充质干细胞碱性磷酸酶表达的影响

目的:检测rhBMP-2和rhbFGF单独、联合及序贯作用对兔骨髓间充质干细胞碱性磷酸酶作用的长期效应。方法:在细胞培养技术下,采用碱性磷酸酶检测试剂盒检测单独、联合及序贯施加rhBMP-2和rhbFGF后,兔骨髓间充质干细胞在第2、5、7及10天时碱性磷酸酶的活性水平,以反映对细胞分化作用的影响,并进行统计学分析。结果:rhBMP-2能长期显著地促进细胞的碱性磷酸酶活性,而rhbFGF则起到抑制作用,且均呈剂量依赖性。rhBMP-2单独作用与2种生长因子联合作用的效应相近,且均高于rhbFGF单独作用或2种因子序贯作用的效应。结论:不同生长因子的不同应用方式.对骨髓间充质干细胞分化作用的长期效应不同。     

rhBMP-2及rhbFGF对骨髓间充质干细胞增殖的长期效应的实验研究

目的：检测rhBMP-2和rhbFGE、单独、联合及序贯作用对兔骨髓间充质干细胞增殖的长期效应。方法：在细胞培养技术下，采用MTT法检测单独、联合及序贯施加rhBMP-2和rhbFGF后，兔骨髓间充质干细胞在第1，3，5，7及10天增殖的状况，并进行统计学分析。结果：rhBMP-2和rhbFGF均能长期显著地促进兔骨髓间充质干细胞的增殖，并呈剂量依赖性。两种生长因子联合作用的效应高于单独或序贯作用的效应。结论：不同生长因子的不同应用方式对骨髓间充质干细胞增殖的长期效应不同。     

Bony engineering using time-release porous scaffolds to provide sustained growth factor delivery

Microporous scaffolds designed to improve bony repair have had limited success; therefore, we sought to evaluate whether time-released porous scaffolds with or without recombinant bone morphogenetic protein 2 (rhBMP-2) could enhance stem cell osteoinduction. Custom-made 15/85 hydroxyapatite/β-tricalcium phosphate scaffolds were left empty (E) or filled with rhBMP-2 (E+), calcium sulfate (CS), or CS and rhBMP-2 (CS+). All scaffolds were placed in media and weighed daily. Conditioned supernatant was analyzed for rhBMP-2 and then used to feed human adipose-derived mesenchymal stem cells (ASCs). Adipose-derived mesenchymal stem cell ALP activity, OSTERIX expression, and bone nodule formation were determined. E scaffolds retained 97% (SD, 2%) of the initial weight, whereas CS scaffolds had a near-linear 30% (SD, 3%) decrease over 60 days. E+ scaffolds released 155 (SD, 5) ng of rhBMP-2 (77%) by day 2. In contrast, CS+ scaffolds released only 30 (SD, 2) ng (10%) by day 2, and the remaining rhBMP-2 was released over 20 days. Conditioned media from E+ scaffolds stimulated the highest ALP activity and OSTERIX expression in ACSs on day 2. However, after day 6, media from CS+ scaffolds stimulated the highest ALP activity and OSTERIX expression in ASCs. Adipose-derived mesenchymal stem cells exposed to day 8 CS+-conditioned media produced significantly more bone nodules (10.1 [SD, 1.7] nodules per high-power field) than all other scaffolds. Interestingly, day 8 conditioned media from CS scaffolds simulated significantly more bone nodules than either E or E+ scaffold (P < 0.05 for both). Time-released hydroxyapatite/β-tricalcium phosphate porosity provides sustained growth factor release, enhances ASC osteoinduction, and may result in better in vivo bone formation.     

骨形成蛋白-2和碱性成纤维细胞生长因子对人骨髓基质细胞的生物学作用

目的：探讨重组人骨形成蛋白-2(rhBMP-2)和碱性成纤维细胞生长因子(b—FGF)单独或联合作用对人骨髓基质细胞(HBMSC)增殖和分化的影响。方法：利用四唑盐比色法(MTT)、碱性磷酸酶(ALP)测定法观察不同浓度的rhBMP-2和b—FGF单独或联合作用时HBMSC的增殖和分化情况。结果：rhBMP-2对HBMSC的增殖和ALP表达均有促进作用；b—FGF促进HBMSC增殖，但抑制ALP表达；rhBMP-2和b—FGF联合作用时HBMSC的增殖和ALP活性较单独作用有显著提高。结论：rhBMP-2和b—FGF联合应用时对HBMSC的增殖和向成骨细胞分化具有协同作用。     

联合应用胰岛素样生长因子-I和骨形成蛋白-2促小鼠成骨样细胞及成纤维细胞增殖和分化的效应

目的探讨重组人胰岛素样生长因子-I(rhIGF-I)和重 组人骨形成蛋白-2(rhBMP-2)单独及联合应用对MC3T3-E1和NIH3T3细胞增殖和分化的影响。方法单独或联合应用不同浓度rhIGF-I 和rhBMP-2作用于MC3T3-E1和NIH3T3细胞后,采用四甲基偶氮唑蓝(MTT)检测细胞增殖情况,碱性磷酸酶(ALP)试剂盒检测细胞分化 情况,放射免疫法检测细胞分泌的骨钙素(OC)水平。结果1～75ng/mlrhIGF-I与10～100ng/mlrhBMP-2作用于MC3T3- E1和NIH3T3细胞后,均能显示明显的促细胞增殖(P<0.01)及使ALP活性增高(P<0.05)的作用。各浓度rhIGF-I或 rhBMP-2对MC3T3-E1及NIH3T3细胞作用8、24和48h的MTT检测结果相似。rhIGF-I和rhBMP-2联合作用后,对两种细胞 的促增殖、增强ALP活性的作用均较各自单独作用更为明显(P<0.05)。单独或联合应用不同浓度rhIGF-I和rhBMP-2对细胞分泌的 OC水平均无显著影响(P>0.05)。结论rhIGF-I和rhBMP-2具有明显的促细胞增殖及早期分化的协同作用,但对成骨末期细胞分化影响 不大,其活性主要与使用剂量有关。     

不同浓度重组人骨形成蛋白2对人胎盘间充质干细胞增殖和碱性磷酸酶表达的影响

目的初步探讨重组人骨形成蛋白2(rhBMP-2)作用于人胎盘间充质干细胞(HPDMSCs)的适宜浓度范围。方法取健康产妇自愿捐赠的胎盘,采用胶原酶消化法分离HPDMSCs,体外培养扩增并鉴定。取第3代HPDMSCs,根据培养液中加入rhBMP-2浓度的不同分为对照组(rhBMP-2浓度为0)和实验A、B、C、D组(rhBMP-2浓度分别为50、100、150、200ng/ml)。在加药后4、8、12、16d采用CCK-8法检测各组细胞增殖的吸光度值A450,碱性磷酸酶(ALP)定量检测法检测酶表达的吸光度值A520。结果获得的HPDMSCs呈长梭形。CD29、CD44、CD105表达阳性,CD34、CD45、CD106、HLA-DR表达阴性。经鉴定,分离培养的细胞具有成骨和成脂的多向分化能力。CCK-8实验结果显示:A、B、C组A450与对照组相比,在所有时间点下差异均无统计学意义(P>0.05);D组A450低于其它组,差异在大部分时间点有统计学意义(P<0.05)。ALP检测结果显示:A、B、C、D组A520在所有时间点均高于对照组(P<0.01);B、C组在8、12、16d高于其它组(P<0.05);B、C组在所有时间点差异无统计学意义(P>0.05)。结论 rhBMP-2浓度在100～150ng/ml范围可有效诱导HPDMSCs成骨向分化,且对HPDMSCs增殖不产生明显影响。     

大鼠骨髓间充质干细胞与脂肪间充质干细胞生物学特性的比较

目的:本研究旨在比较同一个体来源的脂肪间充质干细胞(Adipose tissue-derived mesenchymal stem cells,ADSCs)和骨髓间充质干细胞(Bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs)的生长特点和诱导分化能力。方法:取7～10 d SD大鼠的脂肪和骨髓,体外分离、纯化脂肪和骨髓来源间充质干细胞,分别从细胞形态、生长动力学、表面标志、分化潜能等方面进行鉴定和比较。结果:脂肪间充质干细胞的增殖速度明显大于骨髓间充质干细胞(P<0.05),两种细胞所表达的表面蛋白标志物基本相似,但脂肪间充质干细胞表面蛋白标志CD106呈阴性,而骨髓间充质干细胞CD106呈阳性。在成软骨分化中脂肪间充质干细胞弱表达Ⅱ型胶原,而骨髓间充质干细胞不表达。第5、10、15、20代ADSCs及BMSCs经成骨诱导后茜素红染色均呈阳性且有"矿化"结节形成,碱性磷酸酶活性以第5代最强,随着细胞代次的递增,碱性磷酸酶活性呈递减趋势。结论:ADSCs较BMSCs更易于分离培养及体外扩增,诱导条件下成骨、成脂、成软骨能力较强,适合作为再生医学的种子细胞。     

Human periodontal ligament cell responses to recombinant human bone morphogenetic protein-2 with and without bone allografts

BACKGROUND: Recombinant human bone morphogenetic protein-2 (rhBMP-2) has been found to promote the osteoblastic differentiation of human periodontal ligament cells. Its effect depends on the delivery system used. In this study we examined the effect of rhBMP-2 on the proliferation and osteoblastic differentiation of human periodontal ligament cells cultured alone or with 3 different bone allografts. METHODS: The rhBMP-2 effect on cell proliferation and osteoblastic differentiation was examined by measuring [3H] thymidine incorporation and ALPase activity, respectively, on human periodontal ligament (hPDL) cells. Two human demineralized freeze-dried allografts of cortical (DFDBAco) and cancellous (DFBDAca) bone origin and 1 non-demineralized freeze-dried allograft (FDBA) of cancellous bone origin, derived from different tissue banks, were used to evaluate the rhBMP-2 effect on cell osteoblastic differentiation. The measurements were taken on various days. RESULTS: rhBMP-2 decreased hPDL cell proliferation. rhBMP-2 acted on the third day of the process of cell differentiation, had a specific time of action, achieved its peak effect on the fourth and fifth days, and then did not provoke any further effects. The 3 bone allografts were efficiently combined with rhBMP-2. The combination of rhBMP-2 and DFDBAco showed the effect with the longest duration. rhBMP-2, on day 4, made the inactive bone allograft more active while, on the other days, its effect was dependent on the allograft alone. CONCLUSIONS: rhBMP-2 promotes the osteoblastic differentiation of human periodontal ligament cells and decreases cell proliferation. In this study rhBMP-2 in the presence of the bone allografts tested resulted in hPDL cell differentiation.