BimS慢病毒RNA干扰载体的构建及其感染效率和干扰效果的实验研究

目的:应用RNA干扰技术构建BimS慢病毒RNA干扰载体,探讨其感染效率和干扰效果.方法:针对人BimS设计3个干扰靶点,将单链引物退火成双链oligo序列,连接入Age Ⅰ和EcoR Ⅰ双酶切线性化载体中.将重组质粒进行病毒包装、并且通过感染ACC-2细胞观察其感染效率,定量PCR检测其对BimS mRNA干扰效果.结果:PCR产物经扩增电泳后阳性克隆得到337bp条带,插入序列片段与DNA测序结果完全相符.重组慢病毒载体在293T细胞中包装获得滴度为2×10s TU/ml的病毒颗粒,MOI=20,转染效率为85％.转染pFU-GV-BmS-1组、pFU-GV-BmS-2组及对照组BmS mRNA相对表达水平分别为:0.743±0.025、0.466±0.023、1.266±0.042(组间两两比较,P＜0.05).结论:BimS慢病毒RNA干扰载体构建成功,并能高效感染ACC-2细胞及下调BmS mRNA表达.     

靶向人CD106基因RNAi慢病毒载体的构建与鉴定

目的：：构建人CD106基因RNAi慢病毒载体。方法：设计4条靶向CD106的RNA干扰靶点序列(Target 1、2、3、4),合成短发卡结构shRNA并退火成双链DNA,与慢病毒载体重组形成siRNA表达载体,利用PCR和测序鉴定验证获得连接正确的克隆。经由293T细胞包装siRNA慢病毒颗粒,随后将其感染人口腔鳞癌HN12细胞,分别采用Real-time PCR和Western blot方法检测靶基因在mRNA和蛋白质水平的沉默效率。结果：构建的慢病毒载体的PCR鉴定和测序正确,包装病毒后滴度至少达到1×109 TU/ ml。siRNA慢病毒感染人HN12细胞,经Real-time PCR和Western blot检测目的基因CD106的mRNA和蛋白表达较阴性对照载体慢病毒感染组明显下降。结论：成功构建了人靶向CD106RNAi慢病毒载体,并能够在细胞水平上有效沉默靶基因。     

E2F-1基因RNAi慢病毒载体的构建与鉴定

目的：构建和鉴定靶向E2F-1基因的RNA干扰慢病毒载体。方法：体外合成两对互补并编码靶向E2F-1基因的特异性短发夹RNA（short hairpin RNA,shRNA）序列和一个阴性对照组的寡核苷酸,克隆到pLKO.1-PURO-U6（Age I/EcoR I）质粒载体中,经酶切和测序鉴定所构建的重组载体是否正确,将以上质粒分别和包装质粒混合物共转染293T细胞,包装产生病毒颗粒。各组病毒载体转染Tca8113细胞后,运用Real-Time PCR和Western检测三组E2F-1 mRNA和蛋白的表达水平。结果：经酶切和测序证明,pLKO.1-PURO-U6-E2F-1shRNA序列正确;转染后,各组慢病毒载体中,第一组质粒感染后的Tca8113细胞中E2F-1基因的核酸电泳条带明显减弱,Western检测出E2F-1蛋白的表达降低。结论：靶向E2F-1基因的shRNA慢病毒载体构建成功,并可特异性沉默E2F-1基因的表达,为研究E2F-1在口腔鳞癌的发生发展中的作用提供了初步的实验基础。     

E2F-1基因RNAi慢病毒载体的构建与鉴定

目的:构建和鉴定靶向E2F-1基因的RNA干扰慢病毒载体.方法:体外合成两对互补并编码靶向E2F-1基因的特异性短发夹RNA(short hairpin RNA,shRNA)序列和一个阴性对照组的寡核苷酸,克隆到pLKO.1-PURO-U6(Age I/EcoR I)质粒载体中,经酶切和测序鉴定所构建的重组载体是否正确...     

ER-β基因RNA干扰重组表达载体的构建及鉴定

目的：构建针对人雌激素受体-β（estrogen receptor-β,ER-β）基因的小干扰RNA（small interfering RNA,siRNA）真核表达载体质粒.方法：根据GeneBank数据库提供的ER-β基因核苷酸序列,选择设计能转录小发卡结构RNA的DNA序列,将此双链DNA 片段克隆至载体pS ilencer3.1-H1-neo中构建重组表达载体,转化DH5α菌株,提取质粒进行序列测定.结果：经测序证明与设计的相同,获得人ER-β基因的siRNA 表达载体质粒.结论：成功构建了针对ER-β基因的RNA干扰重组表达载体,为下一步ER-β基因的RNA 干扰奠定了基础.     

靶向细胞分裂周期蛋白6 RNAi慢病毒载体的构建

目的 探讨细胞分裂周期蛋白6(Cdc6)RNAi慢病毒载体的构建.方法 设计5个靶向Cdc6的RNA干扰靶点序列(Target 1、2、3、4、5),构建靶向Cdc6的RNA干扰载体和Cdc6过表达载体,共转染293T细胞进行外源筛靶,采用Western blot检测Cdc6蛋白表达情况,判断不同靶点的干扰效果,选择两条最佳RNAi有效靶点序列,制备靶向Cdc6的慢病毒载体,并将其转染Tca8113细胞,通过Real-time RT-PCR和Western blot检测Cdc6 mRNA和蛋白表达水平,以MTT法测定Tca8113细胞生长水平.结果 成功构建Cdc6 siRNA表达质粒及Cdc6过表达载体质粒,经外源筛靶实验显示,相对阴性对照组(NC),Target 3和Target 4靶点对Cdc6蛋白表达的敲减作用最显著,敲减率分别为69.15%和84.85%.在Tca8113细胞中,与NC组比较,靶向Cdc6慢病毒载体KD1和KD2组Cdc6 mRNA表达的敲减率分别为50%和65%:Cdc6蛋白表达水平分别下降65.87%和79.38%;Tca8113细胞生长抑制率分别为25.84%和30.34%.结论 成功构建两条靶向Cdc6 RNAi慢病毒载体:Target 3和Target 4.     

Naa10基因RNA干扰慢病毒载体的构建及其对口腔鳞癌细胞生长的影响

目的:构建人N-α-乙酰基转移酶10(N-α-acetyltransferase 10, Naa10)基因有效的慢病毒RNAi载体并转染人口腔鳞癌细胞SCC-15,研究其对口腔鳞癌细胞生长的影响。方法:根据人Naa10基因mRNA序列设计合成3个siRNA片段,转染人口腔鳞癌SCC-15细胞株并进行验证,将最有效的干扰序列克隆至pLV-shRNA载体上,测序正确后进行包装,测定病毒颗粒滴度后,将慢病毒感染SCC-15细胞以测定Naa10的表达情况,并通过生长曲线研究干扰Naa10对SCC-15细胞生长的影响。结果:3个靶点的siNaa10 均能有效抑制Naa10基因的表达,其中2号靶点最为有效(P<0.005);重组RNAi质粒pLV-shNaa10经测序证实构建成功, pLV-shNaa10可在293T细胞中成功包装;测定病毒颗粒LV-shNaa10、LV-NC滴度分别为1.2×10⁹ TU/mL和1.0×10⁹ TU/mL;SCC-15细胞感染LV-shNaa10后,Naa10蛋白表达明显降低(P<0.005);干扰Naa10可促进人口腔鳞癌细胞SCC-15的生长。结论:成功构建了Naa10 shRNA慢病毒表达载体,感染人口腔鳞癌细胞SCC-15后,有效抑制了内源性Naa10基因的表达,干扰Naa10可促进SCC-15细胞的生长。     

PERK干扰慢病毒载体的构建及其在人牙髓细胞中的表达

目的:构建人PERK基因的shRNA慢病毒载体,检测其对人牙髓细胞(dental pulp cells,DPCs)PERK基因表达的抑制作用.方法:针对人PERK基因的cDNA序列,设计并合成针对人PERK基因的shRNA表达序列,将其连接到载体hU6-MCS-CMV-EGFP中.测序正确后,将构建的目的载体和包装质粒共转染293T细胞,72 h后收获并浓缩得到重组慢病毒颗粒.筛选最佳感染复数(multiplicity of infection,MOI),将病毒感染人牙髓细胞,通过实时荧光定量PCR(quantitative real-time PCR,RT-PCR)和蛋白质免疫印迹(Western blot)技术检测PERK基因mRNA和蛋白的表达水平,验证干扰效果.采用SPSS24.0软件包对数据进行统计学分析.结果:成功构建LV-PERK-RNAi慢病毒载体,病毒滴度为3×108 TU/mL,最适MOI=30;RT-PCR和Western印迹法检测显示,与空白对照组相比,PERK基因的mRNA和蛋白质表达水平显著下降,在mRNA水平的表达抑制率约为63％.结论:成功构建PERK干扰慢病毒表达载体,为后续的研究创造了条件.     

慢病毒表达载体pLentiTrident1-hBMP2-Neo-hNGF的构建及鉴定

目的:构建并鉴定含有人骨形成蛋白2(hBMP2)及神经生长因子(hNGF)目的基因的慢病毒载体.方法:使用限制性内切酶,将新霉素抗性基因(Neo)从载体pLentiTrident1-EGFP-Neo切下,插入pLentiTrident1空载体的相应多克隆位点上.构建出含新霉素抗性的表达载体.采用PCR扩增得到hBMP2与hNGF的目的片段,通过多克隆位点将2个目的基因插入表达载体.对该重组载体进行酶切鉴定、PCR鉴定以及DNA序列测序分析.结果:通过酶切鉴定及测序分析,慢病毒表达载体(plentiTrident1-hBMP2-Neo-hNGF)构建成功.结论:成功构建了hBMP2与hNGF的共表达慢病毒载体.为研究神经因素在骨组织再生中的作用奠定了基础.     

cbfa1、satb2双基因共表达载体的构建及鉴定

目的:构建携带cbfa1和satb2双基因的慢病毒真核表达载体。方法:采用PCR技术,从质粒中扩增基因cbfa1和satb2,经TA克隆、酶切筛选后,对阳性重组子进行商业测序鉴定。将测序正确的cbfa1和satb2分别插入pIRES上、下游的相应酶切位点中,构建pIRES-cbfa1-satb2。然后通过双酶切,得到cbfa1-Ires-satb2片段,将其插到含有neo/kana基因的慢病毒载体pLentinTrident1-CMV的相应酶切位点上,构建慢病毒真核表达载体pLentinTrident1-CMV-cbfa1-Ires-satb2。结果:通过PCR技术成功扩增了cbfa1和satb2基因,借助中间载体pIRES中的内部核糖体进入位点,将cbfa1和satb2同时连到了慢病毒载体pLentinTrident1-CMV上,经PCR、酶切及测序验证,质粒构建成功。结论:本实验成功构建了携带cbfa1和satb2双基因的慢病毒真核表达载体,为进一步研究2种基因的功能奠定了基础。     

mcpr1基因的真核表达载体的构建与鉴定

目的 :构建腭裂相关基因mcpr1与pcDNA3 .1/V5 HisB融合的高效真核表达载体 ,为研究mcpr1基因的功能奠定基础。方法 :根据mcpr1基因的核苷酸序列 ,设计并合成引物 ,通过PCR方法 ,从包含有mcpr1基因全长的克隆载体T easy/mcpr1中 ,扩增出该基因外显子片段 ,将扩增产物连接到真核表达载体pcDNA3 .1/V5 HisB中。对该重组体进行PCR和酶切鉴定 ,以及测序验证。结果 :以重组体为模板扩增出40 0bp左右的特异性基因片段 ,与mcpr1基因片段大小一致 ,酶切鉴定也显示有 40 0bp左右的基因片断。测序结果显示与已知基因序列一致。结论 :成功构建mcpr1基因的真核表达载体 ,为下一步研究mcpr1基因的功能奠定了基础。     

人nm23-H1基因重组腺病毒载体的构建与鉴定

目的:构建表达入nm23-H1基因的重组腺病毒载体,并在人胚肾293细胞中进行鉴定.方法:以重组质粒pcDNA3.1-nm23-H1中提取的nm23-H1基因为模板,采用PCR法扩增基因片段.将扩增的基因片段插入穿梭质粒pShuttle-CMV,并转化大肠肝菌DH5α.筛选重组质粒pShuttle-C MV-nm23-H1,电转化已转化了pAdEasy-1的BJ5183细胞.筛选重组腺病毒质粒pAdEasy-nm23-H1,用Lipofectamine转染293细胞,制备携带人全长nm23-H1基因的重组复制缺陷型腺病毒Ad-nm23-H1.大量扩增Ad-nm23-H1病毒颗粒,并测定病毒滴度.采用RT-PCR法检测nm23-H1基因在293细胞中的转录.结果:经PCR、酶切鉴定及DNA测序结果证实pShuttleCMV-nm23-H1及pAdEasy-nm23-H1质粒正确构建,纯化后的Ad-nm23-H1病毒颗粒感染性滴度为109.5(3.4×109)CCIDs/ml,经RT-PCR扩增出的基因片段,与目的片段大小一致.结论:已成功构建了表达nm23-H1重组腺病毒载体,为肿瘤的基因治疗提供了依据.     

人釉原蛋白基因重组慢病毒载体的构建及在293T细胞中的表达

目的:构建含人釉原蛋白(human Amelogenin,hAm)成熟肽编码区基因的慢病毒载体FuAmw,并观察在重组慢病毒感染的293T细胞中釉原蛋白的表达.方法:以构建好的重组质粒PQE30-Am为模板,采用PCR技术体外扩增hAm成熟肽编码区.将扩增产物与慢病毒载体转移质粒FUGW分别用BamH Ⅰ和EcoR Ⅰ双酶切后连接,构建重组慢病毒载体,转移质粒FUAmW,并进行酶切及测序鉴定.通过聚乙烯亚胺(polytheylenimine,PEI)法将三质粒共转染293T细胞,包装得到重组慢病毒FUGW和FUAmW,然后分别离体感染293T细胞,培养 72h后,经荧光显微镜下观察和流式细胞计数检测感染效率,采用RT-RCR及Western印迹法检测釉原蛋白基因的表达.结果:重组质粒经测序证实.插入片段与人釉原蛋白成熟肽基因序列完全一致.流式细胞仪测得重组病毒感染293T细胞绿色荧光蛋白(green fluoresence protein,GFP)的阳性率为67.38%.RT-RCR和Western印迹均证实,重组慢病毒FUAmW感染的293T细胞能够表达人釉原蛋白.结论:成功构建携带人釉原蛋白成熟肽基因的重组慢病毒载体质粒,以293T细胞包装得到的重组人釉原蛋白病毒能感染真核细胞并获得表达.     

DNMT1干扰对唾液腺腺样囊性癌细胞系ACC-M E-cadherin表达的影响

目的：建立DNA甲基转移酶1（DNMT1）表达稳定抑制的唾液腺腺样囊性癌细胞系ACC-M,探讨DNMT1表达抑制对ACC-M细胞E-cadherin表达的影响。方法：设计靶向干扰DNMT1的shRNA序列,构建携带该序列的慢病毒载体并转导ACC-M细胞,对筛选出的抗性克隆采用RT-PCR、荧光定量PCR、免疫印迹方法分别检测DNMT1mRNA、蛋白质水平,筛选获得DNMT1表达稳定抑制的ACC-M细胞,并通过甲基化特异性PCR检测E-cadherin基因启动子的甲基化状态,荧光定量PCR检测E-cadherin的表达情况。采用SPSS11.0软件包对数据进行t检验。结果：筛选获得DNMT1稳定表达抑制的ACC-M细胞,其mRNA、蛋白相对表达水平（0.156±0.008,0.163±0.013）显著低于空白对照组和空载对照组。进一步检测发现,E-cadherin基因启动子甲基化水平明显降低,E-cadherinmRNA表达水平显著增高,P〈0.05。结论：shRNA慢病毒载体介导的RNA干扰能够有效、稳定地抑制ACC-M细胞DNMT1的表达,并降低ACC-M细胞E-cadherin基因启动子的甲基化水平,从而使E-cadherin基因表达增强。