p16基因转染对膀胱癌细胞系BIU-87体外生长的抑制作用

为探讨ｐ16基因在膀胱癌发生、发展过程中的作用及其在膀胱癌基因治疗中的应用前景 ,我们将野生型ｐ16基因导入缺失 ｐ16基因的ＢＩＵ 87细胞中 ,观察 ｐ16基因的肿瘤抑制功能。一、材料与方法1.ｐ16基因重组表达载体的构建与鉴定 :质粒 ｐＧＲＥ5 1含全长 0 .96ｋｂ的人 ｐ16ｃＤＮＡ基因片段 ,用ＥｃｏＲＩ和ＸｈｏＩ双酶切 ｐＧＲＥ5 1分离出ｐ16ｃＤＮＡ基因片段 ,将其插入真核表达载体ｐｃＤＮＡ3( 5 .4ｋｂ)的ＥｃｏＲＩ/ＸｈｏＩ酶切位点间 ,构建成重组质粒 ,命名为 ｐｃＤＮＡ3 ｐ16,酶切、电泳鉴定。2 .ｐ16基因转染ＢＩＵ 87细…     

外源性p16基因对食管癌患者癌细胞系的生长抑制作用

目的 观察外源性p16基因质粒导入食管癌患者食管鳞癌细胞系Ec109后的表达及其对Ec109细胞增殖生长状况的影响。方法 根据转染质粒的不同或是否行p16 cDNA质粒转染分为三组,每组分别为5个样本。PcDNA3-P16转染组（P16转染组）：采用脂质体（Lipofectamine）为载体,将PcDNA3-P16表达质粒寻入Ec109细胞;空载体转染组：用PcDNA－3－neo空载体以上述相同方法转染,作空白对照;未转染组：未用PcDNA3－P16质粒转染,作阴性对照。应用Northern斑点杂交、免疫组织化学、免疫荧光检测转化细胞的P16蛋白变化;流式细胞仪分析细胞周期变化,DNA片段化电泳检测细胞凋亡。结果 P16转染组外源性p16基因在Ec109细胞中表达后,细胞生长速度减慢,克隆形成能力下降,瞬时表达时有细胞凋亡发生,稳定表达后细胞存在G1期阻滞;空载体转染组和未转染组均未观察到以上结果。结论 脂质体介导的外源性p16基因转染对Ec109细胞有生长抑制作用,p16基因瞬时表达可诱导细胞凋亡。     

p14ARF基因转染治疗胰腺癌的研究

目的 探讨p14ARF抑癌基因转染对胰腺癌（PC－3细胞）生长抑制的影响。方法 用脂质介导方法将p14ARF基因转导到人胰腺癌细胞株PC－3,应用逆转录酶链反应（RT－PCR）检测p14ARFmRNA 表达;应用免疫印迹方法分析p14ARF转基因蛋白表达,并观察p14ARF基因转染的胰腺癌细胞生长情况。结果 p14ARFmRNA基因转染的PC－3细胞能够表达p14ARF,并通过免疫组化和免疫印迹证实外源性p14ARF基因已转入细胞并结合于细胞基因组中。结论 p14ARF基因转染后的PC－3细胞明显受到抑制,提示p14ARF基因转染治疗胰腺癌具有潜在的临床应用价值。     

反义增殖细胞核抗原联合p16基因转染抑制膀胱癌细胞生长的研究

目的 探讨膀胱癌联合基因治疗的新策略。方法 反义增殖细胞核抗原(PCNA)联合p16转染膀胱癌细胞，观测共转染1—7d后癌细胞增殖活性、DNA合成速率、细胞周期时相、克隆形成能力、细胞凋亡和PCNA、p16基因表达情况。结果 联合转染后癌细胞PCNA表达减弱，p16表达显著增强，增殖活性抑制15．45％—68．47％(P＜0．01)，DNA合成速率减慢65．77％(P＜0．01)，细胞周期阻滞于G0／G1期，克隆形成率抑制64．49％(P＜0．01)，凋亡率为22．00％(P＜0．01)。结论 反义PCNA与p16共转染具有抑制增殖、诱导凋亡的双重作用，有望成为膀胱癌联合基因治疗的新途径。     

胰腺癌p16基因mRNA异常表达的研究

我们应用逆转录 聚合酶链式反应(ＲＴ ＰＣＲ)检测胰腺癌中 ｐ16基因ｍＲ ＮＡ的表达情况 ,同时应用聚合酶链式反应 单链构象多态性分析 (ＰＣＲ ＳＳＣＰ)对其异常表达的原因进行分析 ,现将结果报道如下。一、材料和方法1.对象 :新鲜胰腺癌组织 10例取自中国医科大学第一临床学院普通外科手术切除的肿瘤标本 ,其中胰头癌 9例为胰头十二指肠手术切除 ,胰体尾癌 1例为胰体尾切除术切除。正常胰腺组织 7例为对照 ,取自十二指肠乳头癌和胆管末端癌行胰头十二指肠切除的正常胰腺。2 .ＤＮＡ和ＲＮＡ的提取 :酚 氯法提取上述样品ＤＮＡ ,紫外分…     

p16基因对大鼠肝癌生长抑制作用的研究

1 .材料与方法 :大鼠肝癌细胞系CBRH 7919来自中科院上海细胞生物研究所。Wistar大鼠 30只 ,体重 (15 0± 2 0 )g ,雌雄不限 ,购自天津市医学实验动物中心。pcDNA3 0 /p16真核表达质粒转染CBRH 7919细胞后MTT法检测细胞增殖 ;流式细胞仪检测细胞周期 ;双层软琼脂培养观察细胞克隆形成能力 ;大鼠原位肝癌基因治疗观察其体内成瘤能力。结果用统计软件SPSS行t检验。2 .结果 :(1)重组质粒转染CBRH 7919细胞P16蛋白免疫组化显示有P16蛋白表达。 (2 )流式细胞仪分析pcDNA3 0 /p16质粒转染 7919细胞细胞周期结果 (表 1)。 (3)双层软琼…     

腺病毒介导p16基因转染对胃癌细胞作用的研究

目的　观察以腺病毒为载体介导 p16基因转染对胃癌细胞 (MGC80 3)生长的影响。方法　重组腺病毒Ad p16感染胃癌细胞 ,观察胃癌细胞生长情况 ;用Ad p16感染胃癌细胞接种于大鼠体内 ,Ad lacZ为对照组 ,每组大鼠 10只 ,观察大鼠接种的阳性率 ;用重组腺病毒Ad p16作用于胃癌大鼠模型 ,Ad lacZ为对照组 ,每组大鼠 10只 ,观察大鼠肿瘤的生长情况。结果　p16可以抑制胃癌细胞生长 ,促进胃癌细胞的凋亡 ,经Ad p16感染的胃癌细胞肿瘤发生率明显下降 (由 90 %降至 2 0 % )。腺病毒介导 p16基因作用胃癌大鼠模型 2周后肿瘤的重量 ( 2 .2 1± 0 .2 6 )g明显低于对照组 ( 5 .6 4± 0 .5 3)g ,差异有显著性 (P <0 .0 0 1)。应用免疫组织化学检查可见肿块有明显的淋巴细胞侵润。结论　腺病毒介导 p16基因对胃癌细胞有明显的抑制作用。     

腺病毒介导p53基因对胰腺癌细胞抑制作用的体外实验研究

目的 探讨腺病毒介导p53基因(adenovirus-mediated p53 gene,Ad-p53)对人胰腺癌细胞株PANC-1的生长抑制作用.方法 以Western Blot方法 检测加入Ad-p53后PANC-1细胞在48h 、72h p53表达情况以及未处理组细胞48h 、72h p53的表达.采用四甲基偶氮唑盐(MTT)比色实验检测不同MOI值的Ad-p53感染后,PANC-1细胞的生长情况并绘制生长曲线,用PI、annexin V-FITC双重染色并用流式细胞技术检测受感染细胞的凋亡比例.结果 Western Blot结果 显示,处理组细胞内48h 、72h p53蛋白表达明显高于相同时间点对照组细胞;MTT结果 显示不同MOI值细胞生长抑制情况不同,MOI值越高,对细胞生长的抑制程度也越高;流式检测细胞在MOI值为150时,0h、48h、72h凋亡比例分别为(7.5±0.8)%、(22.5±2.3)%和(34.4±2.7)%,对照组细胞为(5.8±0.4)%、(8.3±1.7)%和(9.7±2.1)%.结论 Ad-p53能有效感染胰腺癌细胞,导致胰腺癌细胞凋亡.     

p16基因转染肾癌细胞体外生物学特性的研究

将抑癌基因 ｐ1 6通过腺病毒载体导入小鼠肾癌Ｒｅｎｃａ细胞株中 ,观察 ｐ1 6基因导入后肿瘤细胞的生物学行为 ,并采用ＥＬＩＳＡ法检测Ｒｅｎｃａ细胞中 ｐ1 6蛋白的动态分泌水平 ,为抑癌基因疗法提供实验依据。材料和方法　小鼠 ｐ1 6及ＬａｃＺ重组腺病毒载体ＡｄＰ1 6和ＡｄＬａｃＺ由日本癌症研究会分子生物学治疗研究室Ｈａｍａｄａ博士惠赠。小鼠Ｒｅｎｃａ肾癌细胞株由美国国立癌症研究室Ｗｉｌｔｒｏｕｔ博士惠赠。人胚肾细胞株 2 93细胞为缺陷型腺病毒载体包装细胞 ,重组腺病毒的滴度测定采用微量细胞病变法[1 ] 。转染方法 :将…     

腺病毒介导的p16基因转染对膀胱癌细胞生长影响的研究

目的　探讨复制缺陷型腺病毒介导的 p16基因转染对人膀胱癌细胞生长的影响。 　方法　将 p16重组腺病毒 (Ad p16 )感染p16蛋白表达阴性的人膀胱移行细胞癌T2 4细胞株 ,Ad LacZ、X gal染色法检测重组腺病毒的转染效率 ;Westernblot法检测 p16蛋白的表达 ;MTT法及流式细胞术评估Ad p16对T2 4细胞增殖的影响。　结果　在感染复数 (MOI)为 5 0时 ,重组腺病毒对T2 4细胞的转染率达 97% ;此Ad p16在T2 4细胞中可获高效表达 ;与转染Ad LacZ组及未转染组相比 ,转染Ad p16组T2 4细胞生长受到明显抑制 (P <0 .0 5 ) ,细胞周期分析表明生长抑制主要发生在G1 S节点。　结论　腺病毒载体可有效地将外源 p16基因导入T2 4细胞 ;p16基因重组腺病毒载体转染能抑制T2 4细胞的生长。     

白细胞介素12基因转染抑制人胰腺癌细胞血管生成及肿瘤的生长

目的　探讨白细胞介素 (IL) 12基因转染人胰腺癌细胞对肿瘤的抑制作用及机制。方法　用逆转录病毒MFG作为载体 ,通过逆转录PCR和磷酸钙沉淀法将鼠IL 12基因转染导入人胰腺癌细胞PK 1,得到PK1/IL 12细胞。单纯用MFG感染PK1所得细胞命名为PK1/MFG。用ELISA方法检测IL 12产生量 ,用NK细胞抗体阻断NK细胞作用 ,比较活体及离体条件下两种细胞的增长曲线。活体显微镜下观察肿瘤细胞的血管生成及IL 12的抑制效应。结果　PK1/IL 12细胞株的IL 12产生量为 1 12 μg·ml-1·48h-1。离体条件下两种细胞的生长曲线相似 ,但在活体条件下PK1/IL 12细胞的生长被显著抑制 (P <0 0 1) ,其血管生成被完全阻断 ,正常毛细血管亦被破坏。结论　IL 12基因转染可以抑制人胰腺癌细胞的生长。在免疫缺陷条件下 ,IL 12的抗血管生成作用足以抑制肿瘤细胞的血管生成及肿瘤的生长。IL 12的血管生成抑制效应缺乏特异性。     

p16基因对前列腺癌细胞的体外作用研究

目的：研究可控性表达的p16基因对前列腺癌细胞的生长抑制作用。方法：通过可诱导的真核表达载体pMDNA-3-p16将外源野生型p16基因转染至该基因表达功能丧失的人前列腺癌细胞PC3中,使用ZnSO4作为诱导物,观察p16基因的可控性表达及其对前列腺癌细胞生物学特性的影响。 结果：转染了野生型p16基因的人膀胱癌细胞PC3-pMDNA3-p16经ZnSO4诱导后,开放了p16基因的转录和翻译,p16蛋白得到高水平表达,细胞生长速度及集落形成率均有了部分抑制,细胞周期分析可见G1期增加,S期下降。结论：P16基因与前列腺癌的发生、发展有关,为用p16基因进行前列腺癌的基因治疗提供了实验依据。     

导入PTEN基因抑制胰腺癌细胞体外生长的研究

目的　研究PTEN基因转染对胰腺癌细胞体外生长的生物学效应。方法　以 pBP、pBP PTEN HA、pBP PTENG 12 9R HA质粒分别转染体外培养胰腺癌细胞株JF 30 5 ,并以未转染组为对照 ,Westernblot分析目的基因的表达 ,噻唑蓝比色法 (MTT)检测细胞活力 ,流式细胞术检测细胞凋亡。结果　westernblot示pBP PTEN HA和 pBP PTENG 12 9R HA转染组有HA的表达 ,并分别有PTEN的过表达和PTENG 12 9R的表达 ;MTT示pBP PTEN HA转染组活细胞数较其他各组均低 (pBP PTEN HA组 0 .6 787± 0 .0 785 ;pBP PTENG 12 9R HA组 0 .9847± 0 .10 0 2 ;pBP组1.0 987± 0 .14 80 ;对照组 1.2 0 40± 0 .15 31,P <0 .0 5 ) ,流式细胞术则显示其凋亡率较其他各组明显增高 ( pBP PTEN HA组 11.6 8% ;pBP PTENG 12 9R HA组 4.45 % ;pBP组 3 .5 1% ;对照组 2 .2 7%。P <0 .0 5或P <0 .0 1)。结论　PTEN基因转染可抑制胰腺癌细胞体外生长 ,而这种抑制作用有赖其磷酸酯酶活性并与其促发肿瘤细胞凋亡有关。     

生长激素对胰腺癌细胞株增殖活性的调控

目的探讨生长激素对胰腺癌细胞株Bxpc-3增殖活性的影响。方法MTT法检测生长激素对胰腺癌细胞株Bxpc-3增殖活性,Tunel法标记凋亡阳性细胞、免疫组化法标记增殖细胞,激光共聚焦显微镜计数免疫荧光双标Tunel阳性细胞和增殖细胞。结果10-7mol/L、10-8mol/L、10-9mol/L浓度的生长激素在第2天明显的抑制胰腺癌细胞生长,伴随作用时间的延长这种抑制作用逐渐减轻,且出现了加速胰腺癌细胞生长的作用,第4天、第5天胰腺癌细胞的生长同正常对照组相比有显著差异(P<0.01)。结论本实验研究从细胞学的角度证实生长激素在开始阶段具有抑制胰腺癌细胞生长的作用,但是这种作用伴随时间的延长逐渐消失,且出现加速了肿瘤细胞的生长的现象,为临床肿瘤病人应用生长激素提供了一定的理论依据。     

外源野生型p53基因对人胆囊癌GBC-SD细胞生长的作用

目的观察外源野生型p53(wtp53)基因对人胆囊癌GBC-SD细胞生长的抑制作用。方法用脂质体介导的转染技术,将含有wtp53的真核表达质粒pCMV-p53导入GBC—SD细胞。用聚合酶链反应(PCR)和逆转录-聚合酶链反应(RT—PCR)证实外源p53基因的整合与表达;用细胞计数和克隆形成实验反映细胞增殖状况;用流式细胞仪检测细胞周期的改变。结果转化细胞系中存在外源p53基因的整合与表达。稳定转染wtp53基因的GBC-SD-wtp53细胞,体外生长速率明显减慢;克隆形成率仅为3．2％,显著低于对照组GBC-SD-mutp53(28％)和亲本GBC-SD细胞 (29％,P<0．01);G0／G1期、S期、G2／M期比例(％)分别为(66．12±4．2、32．87±2．15、1．01± 0．37),与对照组(46．20±5．1、30．78±2．92、23．02±1．87)及亲本细胞(41．25±3．2、40．03±2．09、 18．72±1．05)相比,G0／G1期细胞比例明显增加,G2／M期细胞比例显著减少(P<0．01)。结论外源野生型p53基因的表达能有效抑制人胆囊癌GBC-SD细胞的体外生长。     

稳定表达PTEN抑癌基因的炎性乳腺癌细胞系MDA-MB-468的建立和鉴定

目的建立稳定表达外源性PTEN(phosphataseandtensinhomologdeletedfromchromosometen)基因的人炎性乳腺癌MDA MB 468细胞系。方法用脂质体lipofectamine2000转染法,将野生型PTEN基因导入高转移性炎性乳腺癌细胞系MDA MB 468,经G418筛选抗性克隆,扩大培养后,应用RT PCR、免疫组化方法及Westernblot分析目的基因及其蛋白表达。结果野生型PTEN基因成功地导入炎性乳腺癌细胞系MDA MB 468,转染细胞稳定表达PTEN蛋白,PTEN蛋白分布于细胞质。结论MDA MB 468炎性乳腺癌细胞株能稳定表达外源性PTEN基因。     

±托泊苷联合紫杉醇对前列腺癌细胞株生长的协同抑制作用

目的 研究单独或联合使用±托泊苷(ETOP)和紫杉醇(TAXOL)对前列腺癌细胞株生长和细胞凋亡的影响.方法 前列腺癌细胞株经过不同浓度的ETOP 和TAXOL 单独或联合用药处理后,用MTT 法检测细胞抑制率,荧光显微镜观察细胞染色质形态的改变,DNA 梯度定性检测细胞凋亡的变化.结果 单独利用ETOP 或TAXOL 和联合用药,均能抑制前列腺癌细胞生长,并呈浓度和时间±赖关系,其中联合用药组抑制率明显高于单独用药组(P<0.05).ETOP 、TAXOL 及联合用药组细胞核出现典型的凋亡形态学的改变,细胞数目明显少于对照组,联合用药组细胞数目最少.ETOP、TAXOL 及联合用药组处理后的前列腺癌细胞的DNA,经琼脂糖凝胶电泳均出现典型"梯形"DNA 条带,联合用药组改变最明显.结论 ETOP 和TAXOL 均能够抑制前列腺癌细胞生长,联合用药能产生协同抑制作用.     

转基因法建立膀胱癌耐药细胞株

目的　用转基因法建立膀胱癌耐药细胞株 ,研究细胞耐药机制。　方法　利用脂质体(DOTAP)介导的基因转移方法 ,在浸润性膀胱癌细胞株T2 4中转入mdr1全长cDNA ,经阿霉素筛选 ,获得耐药的T2 4细胞株TADM ;免疫组化、MTT、流式细胞仪、基因组PCR、RT PCR等方法鉴定TADM的耐药表型。　结果　TADM细胞的相对耐药指数为 4 1.6 ,基因组中有mdr1cDNA插入 ,P 糖蛋白及mdr1mRNA表达增加。　结论　TADM细胞具有良好的耐药表型 ,其耐药性的产生是由mdr1全长cDNA稳定整合在T2 4细胞基因组中 ,大量表达P 糖蛋白引起。转基因法建立膀胱癌耐药细胞株具有耗时短、耐药强度高而稳定等特点。