几种线粒体DNA提取方法的比较

目的将提取线粒体DNA的碱变性法、Triton法、改进高盐沉淀法加以比较,以得到最方便快速提取线粒体DNA的方法.方法采用健康成年雄性Wistar大鼠,取回肠上皮细胞样本18份,每份含3×10?6细胞,每6份分别用碱变性法、Triton法、改进高盐沉淀法提取线粒体DNA,紫外分光光度法定量.再用琼脂糖凝胶电泳和线粒体ATPase6亚基基因PCR扩增产物鉴定所提取的线粒体DNA.结果3种方法提取线粒体DNA量差别明显改进高盐沉淀法量最多,为(1.26±0.23)μg;碱变性法次之,为(0.52±0.18)μg;Triton法为(0.31±0.16)μg.A260/A280均大于1.7.说明改进高盐沉淀法提取线粒体DNA具有操作简单,产量多的优点.将改进高盐沉淀法提取线粒体DNA用于PCR扩增,测定出了线粒体DNAATPase8亚基基因序列,说明该法所提取mtDNA可用于mtDNA测序.讨论和结论线粒体在细胞凋亡,衰老及程序化死亡中发挥重要作用.已在多种疾病中发现mtDNA突变.对线粒体疾病的分子遗传机理的研究可以进一步阐明这些疾病的病因,并为治疗提供理论指导.胡义德、Tamura和Palva等用碱变性法提取了人血白细胞、心肌等组织中mtDNA;戴纪刚等建立的Triton法先除去细胞核,再分离提取胞浆中mtDNA.而高盐沉淀法通过SDS(十二烷基硫酸钠)破坏细胞膜、核膜,使蛋白质变性,从而游离出核酸,EDTA抑制细胞中DNA酶的活性,蛋白酶K进一步将蛋白质降解成小肽,加入饱和乙酸钠后,绝大部分线性大分子量DNA和蛋白质在SDS作用下变性形成沉淀,环状mtDNA仍为自然状态,通过高速离心,即可得到mtDNA.3种方法各有优缺点碱变性法操作时间较短,要求条件比较严格,不易重复;Triton法通过核质分离提取mtDNA操作时间短,但产量低,易降解.而高盐沉淀法操作简单,易重复,产量多,可依需用量扩大反应体系,使mtDNA质量得以容易控制.     

石蜡包埋组织DNA提取方法的比较及巢式PCR技术的应用

确定从福尔马林固定、石蜡包埋(FFPE)组织中提取DNA的最佳方法,增强长片段PCR产物的成功扩增率,便于分子生物学与临床医学的有机结合。本文选取正常甲状腺FFPE标本20份,分别应用一步法、酚/氯仿抽提法和试剂盒法三种不同的方法提取总DNA,并应用传统PCR法和巢式PCR法对线粒体DNA(mtDNA)的D环区进行扩增。结果酚/氯仿抽提法所得样本DNA的OD260/D280比值最高,为1.703±0.086。一步法、酚/氯仿抽提法和试剂盒法提取DNA的普通PCR长片段扩增成功率分别为0%、5%和10%,而巢式PCR长片段扩增成功率分别为0%、95%和85%。可见用蛋白酶K消化、酚/氯仿纯化法提取的FFPE组织标本DNA质量可靠,巢式PCR技术是从石蜡标本中扩增长片段DNA的有效方法。     

阿尔茨海默病患者血液细胞线粒体内细胞色素C氧化酶亚基Ⅱ基因存在缺失

目的 调查25例老年痴呆患者血细胞线粒体中细胞色素C氧化酶亚基Ⅱ基因的突变情况,探讨线粒体DNA突变与阿尔茨海默病(AD)性老年痴呆发生发展的关系。方法 采用微量法提取血细胞总DNA直接作为PCR模板,进行巢式PCR扩增,最后采用DNA序列分析鉴定突变。结果在正常老人组,只扩增了280bp的线粒体细胞色素C氧化酶亚基Ⅱ基因(COX2)扩增片段,而在老年痴呆患者中出现了464bp和280bp的多态性扩增片段,并且发现了1个320bp的新的线粒体DNA缺失片段,1位AD患者的COX2基因存在一种新的缺失后重组现象,COX2基因的1条单链在np7503处断裂,另1条单链在np7785处断裂,这两个断裂的游离片段通过插入1个额外的胞嘧啶核苷酸重新连接起来。结论 老年痴呆患者中的COX2基因存在片段扩增多态性。     

大鼠脑线粒体DNA提取方法

本研究用一种简便方法提取大鼠脑线粒体 DNA(m t DNA) ,所得的线粒体 DNA纯度为 1.8± 0 .0 1,得率为每克脑组织 0 .8～ 1.0 μg线粒体 DNA,以此为模板进行 PCR反应 ,扩增线粒体 DNA编码基因 ,产量丰富、特异性高。该方法操作简便、成本低 ,适用于一般实验室     

Chelex100法提取的口腔黏膜细胞DNA在STR分析中的研究

目的探讨Chelex100法提取口腔黏膜细胞DNA在STR分析中应用的可靠性。方法优化采集口腔黏膜细胞,Chelex100法提取DNA,检测OD260/OD280比值及浓度,以DNA为模板,荧光标记法进行PCR扩增,基因分析仪上电泳,E-seq分析软件进行基因型分析。结果 Chelex100法提取口腔黏膜细胞DNA,OD260/OD280比值:1.397±0.0062(1.23~1.52),浓度:63.039±3.116 ng/μL(26.7~315.9ng/μL),PCR扩增电泳无非特异性带,在Li-COR 4300基因分析仪上电泳,E-seq分析软件进行基因型分析,满足了STR基因型分析研究。结论优化采集口腔黏膜细胞及DNA提取方法,具有快速、简便、经济特点,其提取到DNA的纯度及产量,通过对STR基因型分析结果验证本研究样本DNA是可靠的。     

白假丝酵母菌DNA提取方法的研究

目的建立一种提取白假丝酵母菌DNA的有效方法。方法采用蜗牛酶消化破壁形成原生质体，饱和酚／氯仿抽提法提取基因组DNA，用琼脂糖凝胶电泳及PCR反应等进行鉴定。结果提取物经琼脂糖凝胶电泳检测到DNA主带，基本无DNA碎带，提取的DNA浓度为（1．18±0．36）ug／ul，纯度好（OD260／OD280〉1．7），不用RNase酶处理，无需任何纯化即可用于PCR扩增。结论本研究中提取DNA的方法简便易行．提取物可适用于各种分子生物学研究。     

与年龄相关的人类心肌线粒体DNA损伤

随老年人数增加,与年龄相关的器官功能减退的可能机制引起人们的关注。随年龄的增加,线粒体DNA(mt DNA)的损伤增多可能是此机制的主要因素。线粒体负责细胞的能量生成,mt DNA特点之一是比细胞核DNA更容易突变。且突变在人一生中积累。我们的实验显示:mt DNA发生缺乏随年龄增加而增加。如果mt DNA突变与老年性器官功能障碍有关,则①mt DNA突变到多少数少才出现临床症状与体征。因为一个线粒体有2～3个mt DNA拷贝,一个细胞中有几千个mt DNA分子;②mt DNA基因突变的机制是什么?我们用动力学PCR技术对     

用虫种特异性线粒体基因序列鉴定2例疑似曼氏裂头蚴感染无虫病理标本

目的 探讨采用线粒体细胞色素C氧化酶亚基1(CO1)基因特异性序列鉴定临床无虫病理标本中裂头蚴感染的可靠性.方法 应用免疫曼氏裂头蚴的兔血清检测病理切片中裂头蚴的抗原,有2例呈阳性,疑似裂头蚴感染的无虫病例,按照DNA提取试剂盒说明书提取核酸,用曼氏裂头蚴线粒体CO1基因特异性序列的两对引物作扩增.结果 经PCR 2次扩增后得到目的 序列,电泳条带出现在预期的位置.2例病理标本扩增的核苷酸序列与已知基因片断序列比对,引物F650/R800扩增条带符合率分别为100%和97%,引物F965/R1120扩增条带符合率均为100%.结论 用裂头蚴线粒体CO1特异性基因引物作重复PCR扩增,对鉴定无虫病理标本曼氏裂头蚴感染有诊断意义.     

一种快速分离纯化外周血细胞线粒体DNA方法的建立

目的探索快速分离纯化人外周血细胞线粒体DNA(mtDNA)的方法. 方法收集抗凝外周血,首先破红细胞,然后裂解白细胞,去除细胞膜和核DNA后获得mtDNA;再经过去除蛋白和RNA,获得纯mtDNA.用PCR扩增人线粒体ND1基因片段,PCR产物经纯化后测序和核苷酸同源性分析.结果用本研究中建立的方法制备的mtDNA纯度高,每毫升抗凝血可获得100ng左右的mtDNA.经过PCR扩增ND1基因433bp片段,较用细胞总DNA为模板,模板用量少,扩增产物多.测序后经核苷酸同源性分析证实扩增片段为ND1基因.结论本研究中建立的快速分离外周血细胞mtDNA的方法,可制备高纯度的mtDNA用于线粒体相关研究.     

改进TRIZOL法提取基因组DNA

目的建立一种在提取总RNA的同时又能制备基因组DNA的方法。方法利用TR IZOL法收集水相沉淀总RNA后余下的中间层和有机相,合并去除蛋白质,再提取基因组DNA。通过紫外分光光度法和电泳法予以鉴定,并以之为模板进行PCR扩增鉴定。结果提取的基因组DNA纯度和浓度俱佳,用于PCR扩增效果良好。结论改进的TR IZOL法可以更加充分地利用实验材料,且可靠易行。     

冷冻切片后甲醛固定石蜡包埋组织DNA质量分析

目的分析冷冻切片后再行甲醛固定、石蜡包埋组织的DNA质量,探讨其在分子病理检测中的应用价值。方法收集已行术中快速冷冻病理诊断的肺腺癌14例,分别提取同一病例冷冻切片后剩余组织蜡块及常规包埋组织蜡块DNA,检测DNA浓度及OD260/OD280值,行内参基因PCR扩增以检测DNA完整性,并以ARMS法行EGFR基因突变检测。结果冷冻切片后固定包埋组织提取DNA浓度及OD260/OD280均值,分别为157.33 ng/μL及1.96,均较常规包埋组织低;所有冷冻后包埋组织提取的DNA均具有100 bp及200 bp的PCR产物,但仅部分能扩增出300 bp及400 bp的PCR产物,DNA完整性稍逊于常规固定包埋组织;冷冻后包埋组织与常规包埋组织EGFR基因突变检测结果完全一致。结论组织冷冻后再行甲醛固定及石蜡包埋,会使得组织DNA进一步降解及片段化,但仍适用于ARMS法的分子病理学检测。     

粪便不同保存方法对动物基因组DNA提取效果的影响

目的为了探索一种既能使野外采集的粪便样品DNA保存完好,又方便带回实验室用于分子水平研究的粪便保存方法。方法本研究通过将普氏原羚的粪便在野外分别采取60℃干燥后低温保存,75％乙醇保存,100％乙醇保存,直接低温(保温箱中加生物冰袋)保存,在1个月内、5个月后、8个月后对粪便DNA进行抽提,并将提取的DNA作为模板进行PCR扩增,基因克隆测序。结果短期内均可得到高质量的DNA,DNA大小在23kb左右,电泳带型整齐,无降解,线粒体的扩增结果也完全一致,而用100％乙醇保存粪便DNA的时间更为长久。结论不同的保存方法提取动物基因组效果不一样。     

糖尿病大鼠心肌DNA损伤及DNA修复酶表达的变化

目的探讨大鼠糖尿病心肌病变的心肌细胞DNA损伤及DNA修复酶OGG1和APE1表达的变化。方法提取糖尿病大鼠心肌组织中DNA、RNA及总蛋白。用Q-PCR检测心肌DNA损伤;用RT-q PCR和Western blot检测DNA修复酶OGG1和APE1表达的变化。用ELISA检测DNA内8羟基脱氧鸟苷(8-OHd G)的含量变化。结果糖尿病大鼠心肌mt DNA出现明显损伤(P0.05),n DNA无明显损伤,DNA内8-OHd G的含量增加(P0.05),OGG1和APE1的表达增加(P0.01)。结论糖尿病大鼠心肌组织内出现mt DNA损伤,虽然OGG1和APE1的表达是增加的,但可能并不足以修复mt DNA的损伤,导致mt DNA的损伤累积,引起心脏功能的损伤。     

慢性阻塞性肺疾病发病与线粒体DNA单倍型相关

目的探讨外周血白细胞线粒体DNA(mt DNA)单倍型与慢性阻塞性肺疾病(COPD)遗传易感性之间的关系。方法 COPD患者60名,对照组45名。PCR扩增mt DNA髙变区和10 171~10 659区DNA片段并测序。将获得的核苷酸序列信息与修订后的mt DNA剑桥序列比对,根据汉族人群mt DNA单倍型分类树把所有样本划分到相应的单倍群。结果 COPD组和对照组都分为A、F和M7等9种单倍型;其中A单倍型在COPD组有较高比例(P0.05),F单倍型在对照组有较高比例(P0.05)。结论 A单倍型可以增加COPD的发病风险,F单倍型可以降低COPD的发病风险。COPD的发生发展可能与mt DNA单倍型突变有关。     

石蜡包埋组织提取DNA不同条件下的PCR扩增

背景：在甲醛固定石蜡包埋组织的制作及保存过程中会对DNA造成损害,提取的DNA在用于PCR扩增时部分结果并不理想。 目的：比较分析石蜡包埋组织中提取DNA应用于PCR反应的影响因素。 方法：从10.0 μm×2、10.0 μm×4和10.0 μm×5石蜡包埋食管癌组织切片中提取DNA,以0.05,0.1,0.2 μg模板DNA量扩增内参基因β-actin,PCR反应循环次数分别为35,40,45次,分析影响PCR反应的因素。 结果与结论：琼脂糖凝胶电泳结果显示以10.0 μm×2组织切片量,PCR反应循环次数40次,PCR反应模板DNA量      0.05 μg扩增取得的目的基因DNA的质量最高。说明减少石蜡包埋组织用量和减少模板DNA量有助于获得高质量的PCR反应条带,且PCR反应循环次数应大于40次,小于45次,再增加循环次数,则意义不大。 关键词：石蜡包埋组织;提取DNA;PCR反应;循环次数;模板DNA doi:10.3969/j.issn.1673-8225.2012.11.017     

一种可用于PCR和RAPD分析的基因组DNA单管快速提取法

PCR技术是一种非常有用的遗传操作技术，但它在群体分析中常常因从大量样品中提取基因组DNA的繁重劳动而受限制．理想的DNA提取方法应该可以应用于各种组织，减少处理时的工作量和提取费用，尽量缩减用于分析的组织样品量，并且不应产生对环境有害的废弃物。我们发现了一种新的组织DNA单将快速提取法．提取的DNA经大量稀释后仍能用于PCR反应。这种方法不需要离心，每天可提取6000个样品，每个样品中提取的DNA可完成4000次PCR扩增，而且这种方法可广泛用于提取动物、植物和微生物中的DNA．这种快速提取法包括两个步骤：DNA样品的…     

粪便不同保存方法对动物基因组DNA

为了探索一种既能使野外采集的粪便样品DNA保存完好，又方便带回实验室用于分子水平研究的粪便保存方法。本研究通过将普氏原羚的粪便在野外分别采取60℃干燥后低温保存，75%乙醇保存，100%乙醇保存，直接低温（保温箱中加生物冰袋）保存，在1个月内、5个月后、8个月后对粪便DNA进行抽提，并将提取的DNA作为模板进行PCR扩增，基因克隆测序。结果表明，短期内都均可得到高质量的DNA，DNA大小在23 Kb左右，电泳带型整齐，无降解，线粒体的扩增结果也完全一致，而用100％ 乙醇保存粪便DNA的时间更为长久。     

微量血提取DNA法在PPARγ基因突变研究中的应用

目的建立一种大样本外周血基因组DNA的提取方法.方法改良经典基因组DNA提取方法,用TritonX-100和Tris-HCl混合溶解红细胞.结果用该法提取的DNA,A260nm/A280nm均大于1.89, 含量大约300μg/ml,PCR扩增产物酶切结果良好.结论该方法简便、经济,可用于大样本的基因分析.     

喉癌中线粒体DNA拷贝数和D-loop区基因突变与临床病理的相关性

目的探讨喉癌线粒体DNA(mitochondrial DNA,mt DNA)拷贝数和D-loop区基因突变与临床病理特征的相关性。方法收集武汉市第一医院诊治的40例喉癌患者,取mt DNA的CoxⅡ和核DNA的β-actin为目的片段进行实时荧光定量PCR(quantitative real-time PCR,qRT-PCR)扩增,对mt DNA D-loop区进行测序。结果喉癌组织中mt DNA拷贝数(0. 925±0. 136)高于其对应癌旁组织(0. 815±0. 096),两者差异有统计学意义(P 0. 05)。mt DNA拷贝数与患者淋巴结转移相关(P 0. 05),但与患者性别、吸烟、饮酒、肿瘤分期以及肿瘤分化无关。40例喉癌中有21例(52. 50%) mt DNA D-loop区共检测17个突变位点、34个突变;发现86个多态性位点;且mt DNA D-loop区基因突变与患者淋巴结转移和肿瘤分化程度相关(P均0. 05),其与患者性别、吸烟、饮酒以及肿瘤分期无关。结论喉癌组织中mt DNA拷贝数高于其对应癌旁组织,且mt DNA Dloop区存在高频基因突变,提示mt DNA拷贝数变化以及D-loop区基因突变与喉癌的发生、发展密切相关。