胰岛素样生长因子1和胰岛素对人α1(Ⅰ)前胶原启动子活性的影响1

目的探讨胰岛素样生长因子1(IGF-1)和胰岛素对人α1(Ⅰ)前胶原(COL1A1)基因启动子的调控作用及肿瘤坏死因子α(TNFα)、干扰素γ(IFNγ)、干扰素α(IFNα)对这一作用的影响.方法构建含COL1A1基因启动子序列与氯霉素乙酰基转移酶(CAT)报告基因的重组体pCOLH0.27与pCOLH2.5,它们分别含该启动子序列-268～+42bp(0.27kb)与-2483～+42bp(2.5kb)片段.将这2个重组体瞬时转染人皮肤成纤维细胞,加入IGF-1或胰岛素,部分细胞还加入TNFα或IFNγ或IFNα,测定CAT活性.结果13nmol/LIGF-1使转染后的这2个重组体活性分别增高3.68倍与4.04倍.2.5μmol/L的胰岛素亦使之分别增高3.69倍与3.93倍.TNFα、IFNγ、IFNα能降低IGF-1与胰岛素诱导的pCOLH2.5活性.结论IGF-1和胰岛素能在转录水平促进COL1A1基因的表达,TNF-α、IFNγ、IFNα能抑制IGF-1和胰岛素的这一作用.     

胰岛素样生长因子1和胰岛素对人α1(Ⅰ)前胶原启动子活性的影响

目的 :探讨胰岛素样生长因子 1(IGF 1)和胰岛素对人α1(Ⅰ )前胶原 (COL1A1)基因启动子的调控作用及肿瘤坏死因子α(TNFα)、干扰素γ(IFNγ)、干扰素α(IFNα)对这一作用的影响。方法 :构建含COL1A1基因启动子序列与氯霉素乙酰基转移酶 (CAT)报告基因的重组体pCOLH0 2 7与pCOLH2 5 ,它们分别含该启动子序列 2 68～ 4 2bp( 0 2 7kb)与 2 4 83～ 4 2bp( 2 5kb)片段。将这 2个重组体瞬时转染人皮肤成纤维细胞 ,加入IGF 1或胰岛素 ,部分细胞还加入TNFα或IFNγ或IFNα,测定CAT活性。结果 :13nmol/LIGF 1使转染后的这 2个重组体活性分别增高 3 68倍与 4 0 4倍。 2 5 μmol/L的胰岛素亦使之分别增高 3 69倍与 3 93倍。TNFα、IFNγ、IFNα能降低IGF 1与胰岛素诱导的pCOLH2 5活性。结论 :IGF 1和胰岛素能在转录水平促进COL1A1基因的表达 ,TNF α、IFNγ、IFNα能抑制IGF 1和胰岛素的这一作用。     

应用寡核苷酸圈套技术研究胰岛素调控人α1(Ⅰ)型胶原基因转录

目的应用寡核苷酸圈套技术研究胰岛素对人COL1A1基因转录的调控。方法建立稳定转染pCOLH12.5质粒(含CAT基因与人COL1A1基因-2483～ 42bp片段)的WI-38细胞株,加入不同剂量胰岛素,测CAT值;分别瞬时转染不同序列ssPT入克隆细胞株中,加入2.5μmol/ml的胰岛素,测CAT值。结果2.5μmol/ml的胰岛素显著增加了COL1A1基因启动子活性;含sp1位点的ssPT浓度为120 nmol/L时,受胰岛素刺激所增加的CAT值得到显著抑制,不含sp1位点的ssPT无此作用。结论ssPT能够应用于基因转录调控的研究。胰岛素在人COL1A1基因上的反应元件可能位于启动子-129至-105区域内。     

胰岛素样生长因子-1基因真核表达载体的构建

目的构建胰岛素样生长因子-1(IGF-1)基因重组逆转录病毒,为将IGF-1基因应用于神经系统疾病的治疗打下基础。方法质粒pcDNA3.1-IGF-1经EcoR I和Xho I双酶切后亚克隆至逆转录病毒载体pLXSN,构建成重组逆转录病毒表达载体pLXSN-IGF-1,采用酶切及测序对重组体进行鉴定。而后脂质体转染pLXSN-IGF-1至包装细胞pA317,检测培养上清病毒滴度。结果重组真核基因表达载体pLXSN-IGF-1经EcoR I和Xho I双酶切后,得到了400 bp和6.0 kb两条带;以重组体为模板进行PCR检测,400 bp的目的基因片段呈阳性;重组体测序结果与预期结果完全一致;建立了细胞系PA317-IGF-1,其培养上清平均病毒滴度为6.5×105CFU/ml。结论成功构建了IGF-1基因重组逆转录病毒。     

多种细胞因子对转化生长因子β1转录的调控作用

目的探讨细胞因子TNF-α、IFN-γ、IFN-α、PDGF-BB、bFGF对TGF-β1启动活性的影响.方法以人基因组DNA为模板,PCR扩增获得含有人TGF-β1基因启动子序列的-1 328～+812 bp片段,与氯霉素乙酰基转移酶(CAT)报告基因构建重组体phTGF2.14, 将其瞬时转染大鼠nFSC细胞,加入细胞因子进行干预,测定CAT活性.结果10 ng/ml TNF-α可以使重组体的CAT活性升高3.24倍;浓度为1 000 U/ml的IFN-γ、IFN-α使phTGF2.14的CAT活性分别降低至对照的(42±12)%、(58±6)%;浓度为10 ng/ml的PDGF-BB、bFGF对TGF-β1基因启动子的活性没有影响;IFN-γ、IFN-α和TNF-α联合应用TGF-β1基因启动子的活性分别为对照的1.32和1.46倍.结论TNF-α可促进TGF-β1基因启动子的活性;IFN-γ、IFN-α则对TGF-β1基因启动子的启动活性有抑制作用;IFN-γ、IFN-α可以阻断TNF-α对TGF-β1基因启动子的促进作用;PDGF-BB、bFGF对TGF-β1基因启动子的启动活性无影响,此研究为进一步研究细胞因子在纤维化疾病的相互作用机制提供了依据.     

人α2(Ⅰ)型胶原基因启动子活性研究

目的探索器官纤维化形成中调控Ⅰ型胶原基因高水平转录的启动片段及TGF-β、PDGF-BB、IGF-1等细胞因子对其活性的影响. 方法从人α2(Ⅰ)胶原基因转录起始点上游-2.4kb至+58bp的片段中,取长度不等的片段作为启动子与含氯霉素乙酰基转移酶(CAT)报告基因的质粒组成5个重组体,转染上述重组体至正常人原代培养皮肤成纤维细胞,测定细胞CAT表达水平以比较各重组体的启动子活性,同时加入细胞因子,以测定其对Ⅰ型胶原启动序列的影响. 结果除 -129～+58bp序列外,其余4个重组体CAT表达水平均较高,其中-2292～+58bp、-1476～+58bp序列具较强启动CAT表达活性,-339～+58bp、-616～+58bp片段次之.TGF-β、IGF-1均能在一定程度上调人α2(Ⅰ)胶原基因启动活性. 结论人α2(Ⅰ)胶原基因片段-2292～+58bp、-1476～ +58bp、-339～+58bp有高启动活性,是进一步研究纤维化相关DNA结合蛋白的重要调控靶序列.TGF-β、IGF-1促进胶原表达,与其上调胶原基因启动活性有关.     

普伐他汀对人Ⅰ期胶原α1（Ⅰ）链启动子活性调控的研究

目的：研究普伐他汀对人Ⅰ期胶原α1（Ⅰ）链启动子活性的调控,从转录水平上了解普伐他汀对Ⅰ期胶原合成的影响。方法：大鼠胸主动脉平滑肌细胞原代,传代培养,构建含人α1（Ⅰ）前原基因5'侧翼序列－2．5kb与报告基因氯霉素乙酰基转酶（CAT）的重组体phCOL2.5,用FuENE转染试剂瞬时转染平滑肌细胞,CAT－ELISA测定普伐他汀能明显抑制Ⅰ型胶原α1（Ⅰ）启动子和活性。结论：普伐他汀可以在转不水平上调节α1（Ⅰ）前胶原基因表达。     

普伐他汀对人I型胶原α1(I)链启动子活性调控的研究

目的研究普伐他汀人I型胶原α1(I)链启动子活性的调控 ,从转录水平上了解普伐他汀对Ⅰ型胶原合成的影响。方法大鼠胸主动脉平滑肌细胞原代、传代培养。构建含人α1(I)前胶原基因5'侧翼序列 -2.5kb与报告基因氯霉素乙酰基转移酶 (CAT)的重组体 phCOL2.5,用FuGENE转染试剂瞬时转染平滑肌细胞 ,CAT -ELISA测定普伐他汀对重组体的作用。结果设对照组的CAT值为1 ,普伐他汀组的CAT值为0.62±0.04 ,普伐他汀能明显抑制I型胶原α1(I)启动子的活性。结论普伐他汀可以在转录水平上调节人α1(I)前胶原基因表达。     

普伐他汀对人Ⅰ型胶原α 1(Ⅰ)链启动子活性调控的研究

目的研究普伐他汀人Ⅰ型胶原α1(Ⅰ)链启动子活性的调控,从转录水平上了解普伐他汀对Ⅰ型胶原合成的影响.方法大鼠胸主动脉平滑肌细胞原代、传代培养.构建含人α 1(Ⅰ)前胶原基因5'侧翼序列-2.5kb与报告基因氯霉素乙酰基转移酶(CAT)的重组体phCOL2.5,用FuGENE转染试剂瞬时转染平滑肌细胞,CAT-ELISA测定普伐他汀对重组体的作用.结果设对照组的CAT值为1,普伐他汀组的CAT值为0.62±0.04,普伐他汀能明显抑制Ⅰ型胶原α1(Ⅰ)启动子的活性.结论普伐他汀可以在转录水平上调节人α1(Ⅰ)前胶原基因表达.     

人胰岛素样生长因子-1基因的克隆、表达和活性检测

目的 克隆人胰岛素样生长因子Ⅰ型(hIGF-1)，构建真核表达载体并进行表达及活性检测，为IGF-1基因治疗糖尿病奠定基础。方法 提取胎儿肝脏总RNA，RT-PCR法扩增IGF-1cDNA片段，重组于pUCM-T载体，测序正确后构建表达载体，转染猴肾成纤维细胞系COS-7，用原位杂交和免疫组织化学检测表达，收集培养上清以胰岛素刺激释放实验进行活性测定。结果 扩增得到710bp带有Kozak序列的IGF-1cDNA片段；成功构建了真核表达载体pCI-neo／hIGF-1；IGF-1在COS-7细胞得到了表达，并具有刺激胰岛素分泌的活性。结论 新构建的载体pCI-neo／hIGF-1能在COS-7细胞中表达、分泌，且所分泌的IGF-1具有生物活性。     

人α2（I）型胶原基因启动子活性研究

目的 探索器官纤维化形成中调控I型胶原基因高水平转录的启动片段及TGF-β、PDGF－BB、IGF－1等细胞因子对其活性的影响。方法 从人α2（I）胶原基因转录起始点上游－2.4kb至＋58bp的片段中，取长度不等的片段作为启动子与含氯霉素乙酰基转移酶（CAT）报告基因的质粒组成5个重组体，转染上述重组体至正常人原代培养皮肤成纤维细胞，测定细胞CAT表达水平以比较各重组体的启动子活性，同时加入细胞因子，以测定其对I型胶原启动序列的影响。结果 除－129～＋58bp序列外，其余4个重组体CAT表达水平均较高，其中－2292～＋58bp、－1476～ 58bp序列具较强启动CAT表达活性，－339～ 58bp、－616～ 58bp片段次之。TGF－β、IGF－1均能在一定程度上调人α2（I）胶原基因启动活性。结论 人α2（I）胶原基因片段－2292～ 58bp、－1476～ 58bp、－339～ 58bp有高启动活性，是进一步研究纤维化相关DNA结合蛋白的重要调控靶序列。TGF－β、IGF－1促进胶原表达，与其上调胶原基因启动活性有关。     

人B细胞活化因子基因启动子活性研究

为探索与自身免疫病发病密切相关的B细胞活化因子(BAFF)基因高水平转录的启动序列及IFN-γ等炎性细胞因子对其活性的影响,以人BAFF基因转录起始点上游-1 349 bp至-329 bp的片段为靶序列,取长度不等的片段作为启动子与含氯霉素乙酰基转移酶(CAT)报告基因的质粒组成5个重组体,脂质体转染法转染上述重组体至人骨髓白血病细胞株:HL-60,CAT-ELISA测定细胞CAT表达水平以比较各重组体的启动子活性;同时加入细胞因子IL-10、IFN-γ、IL-4、重组人BAFF蛋白(rBAFF),以测定其对BAFF启动序列的影响。结果表明,-1 349~-329 bp、-1 349~-743 bp序列具有强启动调控活性,而-1 349~-1 099 bp片段启动活性最低。细胞因子IFN-γ、IL-10和rBAFF均能在一定程度上调人BAFF基因的启动活性,IL-4则一定程度地抑制BAFF基因的启动活性。研究提示,人BAFF基因-1349~-743 bp片段是进一步研究BAFF基因转录相关DNA结合蛋白的重要调控靶序列。细胞因子IL-10、IFN-γ、IL-4、rBAFF可以一定程度的在转录水平影响BAFF合成和分泌。     

胰岛素样生长因子-1拮抗c17.2神经干细胞的放射损伤

目的：评价IGF-1（胰岛素样生长因子-1）对放射引起的c17.2神经干细胞凋亡或坏死所产生的拮抗作用。方法:c17.2神经干细胞培养，免疫组化检测神经干细胞特异性抗原nestin（巢蛋白）及X-gal（吡喃半乳糖苷衍生物）染色检测 lac-z基因的表达。将IGF-1重组腺病毒转染c17.2神经干细胞，免疫组化法鉴定IGF-1蛋白的表达。建立放射引起体外培养的c17.2神经干细胞损伤的模型,流式细胞术及TUNEL法（原位末端标记）评判细胞的凋亡或坏死。观察胰岛素样生长因子-1重组腺病毒转染对细胞凋亡或坏死程度的影响。结果:绝大部分细胞nestin抗原染色阳性，X-gal染色阳性。免疫组化检测结果表明转染病毒的c17.2神经干细胞有IGF-1蛋白的表达，相同照射剂量下转染重组腺病毒的细胞凋亡率及坏死率较未转染细胞低 。结论：重组腺病毒介导的IGF-1转染可减少放射引起的c17.2神经干细胞的坏死和凋亡。IGF-1基因对神经干细胞有保护作用。     

胰岛素对人单核/巨噬细胞ACAT1基因P1和P7启动子活性的影响

 目的：研究胰岛素对人单核/巨噬细胞酰基辅酶A:胆固醇酰基转移酶1（acyl coenzyme A:cholesterol acyltransferase 1, ACAT1）基因P1和P7启动子的活性及其转录产物表达的影响,从而探讨它们在胰岛素调控ACAT1基因表达中的作用。方法：将人ACAT1基因P1和P7启动子调控的报告基因载体pGL3E-P1和pGL3E-P7 瞬时转染入体外培养人THP-1 单核细胞系,给予不同剂量的胰岛素处理,通过双萤光素酶报告系统检测P1和P7启动子的活性。体外培养THP-1细胞和由佛波脂诱导分化的巨噬细胞,同样用不同剂量的胰岛素干预24 h,应用逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）检测THP-1细胞ACAT1 基因P1和P7启动子转录产物表达,用SYBR GreenⅠ实时定量RT-PCR方法检测THP-1细胞和诱导分化的巨噬细胞ACAT1 mRNA的表达。结果：不同剂量胰岛素处理的人THP-1细胞,与对照组相比,ACAT1基因 P1启动子的活性及其转录产物量均显著增强,并随胰岛素剂量的增加而升高。应用实时定量RT-PCR方法检测ACAT1 mRNA的表达与上述结果相一致。结论：胰岛素可通过激活人单核/巨噬细胞ACAT1 基因P1启动子上调ACAT1 mRNA的表达,其作用呈剂量依赖性。     

重组人TGF-β1对TGF-β1基因启动活性的影响

目的：探讨TGF-β1对人TGF-β1基因自身启动子活性的影响。方法：以人全血基因组DNA为模板，PER扩增获得TGF-β1基因转录起始位点上游5′端-1328～ 812bp和 227～ 812bp的片段，以此作为启动子与含氯霉素乙酰基转移酶(CAT)报告基因而不含启动子的pCAT-enhancer质粒构建成重组质粒，并将其转染至大鼠星状细胞株nFSC中，细胞在DMEM培养基中进行培养，用不同浓度的TGF-β1进行干涉，测定并比较细胞的CAT表达水平。结果：不同浓度的TGF-β1对大鼠的肝脏星状细胞的增殖具有抑制作用，而且这种抑制作用在实验用的浓度范围内具有剂量依赖关系；浓度为2．5ng/ml TGF-β1可以使转染phTGF0．585、phTGF1．120、phTGF1．423、phTGF1．680、phTGF2．140质粒的大鼠肝星状细胞的CAT活性分别增加2～5倍。结论：TGF-β1在大鼠nFSC细胞中对TGF-β1启动子活性具有自身促进作用，为进一步研究TGF-β1的调节机制提供了依据。     

抗纤维化细胞因子对TGF-β1基因启动转录活性的影响

转化生长因子β1(transforming growth factor-β1)是一类现已明确的致纤维化细胞因子,具有广泛的生物学效应,对细胞外基质(ECM)基因表达、降解、细胞增殖分化、凋亡及免疫功能都具有重要调节作用。前期我们研究发现,TGF-β1启动调控序列中单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism,SNP)位点-509C>T与肝纤维化进展及血浆中TGF-β1浓度有明显的相关性。本研究旨在探讨抗纤维化细胞因子(IL-10、HGF、IFN-γ)对含TGF-β1基因-509C>T启动调控序列活性的影响。我们以特定-509C>T基因型患者DNA为模板,用PCR方法扩增得到一对长度为2.14kb(-1328~+812)含有-509C>T变异的TGF-β1上游基因片段,并将其与不含启动子的pCAT3-enhancer报告基因载体重组,构建重组体phT-GF2.14C和phTGF2.14T。用脂质体转染法将两种重组体分别转染至正常人肝脏细胞中,分别用IL-10(4ng/ml)、HGF(10ng/ml)、IFN-γ(20ng/ml)干预转染后细胞。ELISA法测定转染细胞的报告基因CAT活性。结果表明:肝细胞转染重组体phTGF2.14C细胞的CAT活性明显高于转染重组体phTGF2.14T(t=12.5882,P=0.0002)。IFN-γ对TGF-β1基因启动子phTGF2.14C、phTGF2.14T均具有显著抑制作用。细胞因子IL-10和HGF对其调控作用不显著。TGF-β1基因-509C>T中C等位基因可明显增强TGF-β1基因上游启动调控序列的转录活性,IFN-γ作为一种抗纤维化细胞因子在基因转录水平对含有两种等位基因-509C>T的TGF-β1基因上游启动调控序列均具有抑制作用。而作为抗纤维化细胞因子的IL-10与HGF在2.14Kb(-1328~+812)区域内对TGF-β1基因上游启动调控序列的作用不显著。     

新型基因工程干扰素受体结合域的改造及其生物活性测定

目的 改造干扰素功能结合域，以提高干扰素的生物学活性。方法 在新型基因工程干扰素（IFNα1c/86D)AB环内通过点突变技术引入2个独立酶切位点EcoRV和EstEⅡ，用聚合酶链反应（PCR）技术在干扰素cDNA水平对母体干扰素LoopAB的31位甲硫氨酸换成天冬氨酸（M－D），32位天冬氨酸换成脯氨酸（D－P），将重组基因在大肠埃希菌中表达，用滤泡口炎病毒（VSV）－人羊膜传代细胞（WISH）系统检测抗病毒活性。用比色MTT实验检测抗增殖活性。结果 通过突变，31和32位氨基酸获得重组突变体3132IFNα1c/86D，经限制性内切酶图分析、DNA序列和抗病毒活性测定，初步表明3132IFNα1c/86D是母体干扰素IFNα1c/86D抗病毒活性的8倍，抗增殖作用与母体干扰素相比差异无显著性。结论 改造干扰素受体结合域，可提高干扰素的抗病毒活性。     

干扰素调节因子3 rs2304204野生型及突变型重组质粒的构建及活性分析

目的构建干扰素调节因子3（IRF-3）rs2304204野生型及突变型重组质粒并比较二者启动子活性。为进一步研究IRF-3对HBV感染的影响打下基础。方法以人全血DNA为模板,扩增含rs2304204位点的IRF-3启动子区1355bp目的序列,插入pGL3-Basic载体中,构建rs2304204野生型的重组质粒（wIRF-3）。以wIRF-3为模板,利用基因定点突变试剂盒构建rs2304204突变型重组质粒（mIRF-3）。wIRF．3、mIRF-3和pGL3-Basic质粒分别转染HEK293细胞,采用双荧光素酶报告基因检测试剂盒检测荧光素酶活性,并计算荧光素酶相对活性单位（RLU）。结果成功构建IRF-3rs2304204野生型及突变型重组质粒,且wIRF-3质粒转染组RLU明显高于mIRF-3质粒转染组（P〈0．005）。结论野生型重组质粒的启动子活性明显高于突变型重组质粒,启动子活性的不同可能进而影响机体抗HBV感染的临床结局。     

人胰岛素样生长因子-1基因克隆及其真核表达载体的构建

目的:从胎儿肝组织中克隆人胰岛素样生长因子-1(IGF-1)基因,并构建真核表达载体pCI-neo/hlGF-1.方法:提取胎儿肝总RNA,RT-PCR法扩增IGF-1 cDNA片段,重组于pUCM-T载体,测序正确后构建表达载体.结果:扩增得到710bp带有Kozak序列的IGF-1 cDNA片段,成功构建了真核表达载体pCI-neo/hlGF-1.结论:通过RT-PCR的方法克隆了人IGF-1 cDNA,并成功构建了真核表达载体pCI-neo/hIGF-1,为IGF-1基因治疗糖尿病创造了条件.