睾酮通过SDF-1α/CXCR4轴调控骨髓内皮祖细胞迁移

目的　探讨雄激素睾酮对小鼠骨髓源性内皮祖细胞（BM-EPC）迁移功能的影响及其机制。方法　6周龄雄性BALB/C小鼠,切除双侧睾丸,饲养4周,培养、鉴定BM-EPC。收集贴壁细胞随机分为8组：分别添加0、1、10、100　nmol/L睾酮以及相应浓度睾酮加氟他胺（雄激素受体阻断剂）预处理。Transwell实验检测各组BM-EPC经或未经趋化因子受体4（CXCR4）抑制剂AMD3100处理后向基质细胞衍生因子1α（SDF-1α）的迁移。逆转录聚合酶链反应和Western　blot检测各组BM-EPC　CXCR4的表达。Transwell实验检测BM-EPC的迁移。结果　与对照组相比,睾酮呈浓度依赖性促进BM-EPC向SDF-1α迁移（放大200倍视野下,A组：61.80±9.31;B组：83.20±6.53;C组：107.00±12.85;D组：134.80±8.64;P＜0.05）。与对照组相比,睾酮呈浓度依赖性促进BM-EPC　CXCR4　mRNA的表达（CXCR4　mRNA的相对表达量：A组：0.065±0.005;B组：0.114±0.002;C组：0.149±0.019;D组：0.209±0.013;P＜0.05）。睾酮呈浓度依赖性促进BM-EPC　CXCR4蛋白的表达（CXCR4与Actin表达量之比：A组：0.23±0.06;B组：0.40±0.02;C组：0.62±0.04;D组：0.77±0.05;P＜0.05）,但此作用被雄激素受体阻断剂氟他胺阻断。AMD3100阻断了不同浓度睾酮对BM-EPC的迁移作用。结论　睾酮通过雄激素受体途径作用于SDF-1α/CXCR4轴,上调BM-EPC　CXCR4的表达而增强其迁移功能。     

转化生长因子α对人内皮祖细胞分化功能的影响

目的研究转化生长因子α(TGF-α)对人内皮祖细胞(EPC)分化功能的影响并初步揭示其作用机制。方法从健康人外周血中分离EPC,分别用含0、1、10μg/L浓度的TGF-α完全培养基诱导培养。观察各组中EPC分化的形态变化,并利用流式细胞术检测各组EPC培养分化过程中CD34+/CD133+和CD31+/v WF+阳性细胞率,Real-time PCR方法测定各组中EPC分化的内皮细胞特异性基因内皮型一氧化氮合酶(e NOS)和Flk-1/KDR表达差异,并通过测定各组中一氧化氮(NO)含量变化比较EPC分化内皮细胞的功能,Western Blot检测各组EPC分化中TGF-α受体EGFR和血管内皮生长因子(VEGF)的表达。结果用TGF-α诱导培养分离的人EPC,细胞形态能够更快地由干细胞球形分化成梭形;流式细胞仪检测发现与空白对照组相比,1、10μg/L TGF-α组中3天时EPC标记CD34+/CD133+阳性率和7天时分化的内皮细胞标记CD31+/v WF+阳性率均显著增高,差异有统计学意义(P0.05);Real-time PCR检测各TGF-α组EPC分化的内皮细胞特异性基因e NOS和Flk-1/KDR表达量也显著上升(P0.05);1、10μg/L TGF-α诱导培养组中EPC分化的内皮细胞分泌NO含量显著升高(P0.05);1、10μg/L TGF-α诱导培养能够显著促进EPC分化过程中EGFR和VEGF的表达(P0.05)。结论 TGF-α能够显著促进人EPC的增殖分化及分化内皮细胞的功能,并通过与受体EGFR结合刺激VEGF表达发挥作用。     

睾酮对衰老心肌细胞及细胞周期调控因子的作用

目的 探讨不同剂量睾酮对心肌细胞衰老的干预作用及其可能机制.方法 用1 μmol/L、 100 nmol/L、10 nmol/L三种剂量睾酮干预自然衰老的小鼠心肌细胞,应用流式细胞仪检测各组细胞周期分布,用RT-PCR及Western印迹检测各组细胞p16INK4a、cyclinD1 mRNA、蛋白及去磷酸化RB蛋白的表达.结果 与衰老心肌细胞相比,1 μmol/L、100 nmol/L、10 nmol/L睾酮干预细胞G0/G1期比例明显降低(P＜0.05),这一作用具有剂量依赖性.睾酮干预可上调cyclinD1mRNA及蛋白表达,下调p16INK4a mRNA及蛋白表达,并使去磷酸化RB蛋白表达下降(P＜0.05),而这些作用均可被雄激素受体阻断剂而不被雌激素受体阻断剂所阻断(P＜0.05).结论 睾酮可剂量依赖性的抑制小鼠心肌细胞衰老,这一作用部分是通过睾酮上调cyclinD1表达,下调p16INK4a及去磷酸化RB蛋白表达而实现的.     

雌激素受体介导Genistein对内皮型一氧化氮合酶表达的诱导作用

目的 研究雌激素受体介导的基因组效应在Genistein促进内皮型一氧化氮合酶表达过程中的作用.方法 体外培养人脐静脉内皮细胞,在氧化型低密度脂蛋白(100 mg/L)干预内皮细胞的基础上,经雌激素受体拮抗剂ICI182780(1 μmol/L)或经基因转录阻断剂放线菌素D(5 mg/L)作用30 min后,再加入Genistein(100 nmol/L)作用24 h,实时定量PCR检测内皮型一氧化氮合酶mRNA表达,Western Blotting检测内皮型一氧化氮合酶蛋白的表达.结果 与空白对照组相比,氧化型低密度脂蛋白(100 mg/L)明显下调内皮型一氧化氮合酶 mRNA和蛋白表达(P<0.05);Genistein明显上调内皮型一氧化氮合酶 mRNA和蛋白表达(P<0.05),而且Genistein对内皮型一氧化氮合酶的诱导作用被雌激素受体拮抗剂ICI182780和基因转录阻断剂放线菌素D明显抑制(P<0.05 ).结论 Genistein促进内皮型一氧化氮合酶的表达与雌激素受体介导的基因组效应密切相关.     

小窝蛋白-1在膜雌激素受体介导的内皮祖细胞增殖中的作用

目的 探讨微囊结构关键蛋白——小窝蛋白-1( caveolin-1,CAV-1)在膜雌激素受体介导的内皮祖细胞(endothelial progenitor cells,EPC)增殖中的作用.方法 培养的EPC分别用不同浓度( 10-9～10-6 mol/L)雌二醇-牛血清白蛋白复合物(E2-BSA)作用24h或10-8 mol/L E2-BSA作用不同时间,或加雌激素受体阻断剂ICI 182,780、环糊精(MβCD)以及CAV-1 siRNA处理,在DMDM培养基中培养的EPC(不加任何试剂)作为对照,使用3H-脱氧胸苷掺入法检测其对EPC增殖的影响.CAV-1 siRNA干扰的效果利用免疫印迹法检测CAV-1蛋白表达来验证.结果 10-8 mol/L E2-BSA作用24h促进EPC增殖作用最大(比对照组高了约87.5％),ICI 182,780可以抑制其增殖作用,表明膜雌激素受体介导的信号通路参与了雌激素对EPC的增殖作用.用环糊精破坏微囊结构以及使用CAV-1 siRNA下调CAV-1蛋白表达都可抑制EPC的增殖(分别比10-8 mol/L E2-BSA组低了18.6％和41.2％).结论 膜雌激素受体可以通过CAV-1促进EPC的增殖.     

血管内皮生长因子调节内皮祖细胞生物学功能

目的研究血管内皮生长因子（VEGF）对体外培养骨髓源性内皮祖细胞（EPCs）数量及增殖、迁移、黏附功能的影响及机制初探。方法密度梯度离心法获取骨髓单个核细胞,FITC-荆豆凝集素I、DiI-乙酰化低密度脂蛋白荧光双染鉴定。单个核细胞培养7d后分为对照组和VEGF干预组。VEGF干预组加入不同浓度VEGF（25,50,75,100μg／L）培养48h,分别采用四氮唑溴盐比色法、改良的Boyden小室和黏附能力测定观察EPCs的增殖、迁移和黏附能力。RT—PCR法半定量检测VEGF对EPCs内皮型一氧化氮合酶（eNOS）mRNA表达的影响。硝酸还原酶法比色测定VEGF对EPCs分泌一氧化氮的影响。结果VEGF可浓度依赖性地增加EPCs数量并明显促进EPCs的黏附、迁移和增殖能力,与对照组比较差异显著。VEGF可上调EPCseNOSmRNA的表达,促进EPCs分泌一氧化氮。结论VEGF可能通过上调EPCseNOSmRNA的表达影响EPCs部分生物学功能。     

睾酮抑制大鼠血管平滑肌细胞泡沫化及机制研究

目的研究睾酮对氧化型低密度脂蛋白(ox-LDL)诱导大鼠血管平滑肌细胞(VSMC)转化为泡沫细胞的抑制作用,并探讨其可能机制。方法培养大鼠VSMC,分为对照组、ox-LDL组、低(1nmol/L)、中(10nmol/L)、高(100nmol/L)浓度睾酮组。另外,设置睾酮组(100nmol/L)、氟他胺组(1μmol/L)、睾酮与氟他胺合用组,并与ox-LDL共培养建立泡沫细胞模型。利用油红O染色及酶荧光法检测不同浓度睾酮及氟他胺预处理对VSMC内脂质含量的影响,免疫印迹法检测各组细胞内线粒体融合素2(Mfn2)、清道夫受体CD36和ATP结合盒转运蛋白A1(ABCA1)的表达变化。结果与ox-LDL组比较,不同浓度睾酮组VSMC脂质蓄积减少,总胆固醇、游离胆固醇和胆固醇酯的含量均降低(P<0.05),Mfn2和ABCA1表达增加(P<0.05),CD36表达降低(P<0.05)。与睾酮组比较,睾酮与氟他胺合用组VSMC脂质蓄积增加,总胆固醇、游离胆固醇和胆固醇酯的含量均增加(P<0.05),Mfn2和ABCA1表达降低(P<0.05),CD36表达增加(P<0.05)。结论睾酮以雄激素受体依赖的方式,抑制ox-LDL诱导的VSMC泡沫化过程,其作用与睾酮上调Mfn2表达进而调节CD36和ABCA1表达有关。     

睾酮抑制高盐喂养下雄性大鼠血管内皮生长因子的表达和释放

目的探讨不同水平睾酮对高盐饮食下雄性大鼠血管内皮生长因子的影响。方法雄性Wistar大鼠32只随机分为4组：假手术组（Sham组）,去势组（Cas组）,去势后补充睾酮组（TC组）,去势后补充睾酮和氟他胺组（FTC组）。每组8只。各组大鼠均以8%氯化钠高盐颗粒饲料喂养;Sham组施以假手术,Cas、TC及FTC组均施以去势手术。TC组及FTC组予丙酸睾酮2mg/kg、隔日1次皮下注射,FTC组同时予氟他胺1mg/kg、每日1次灌胃,持续8周。8周后采用酶联免疫吸附测定法（ELISA）测定各组血清中睾酮、血管内皮生长因子（VEGF）的浓度,实时定量PCR（RT-PCR）测定血管内皮中VEGF mRNA的表达水平。结果（1）Cas组睾酮浓度[（0.26±0.02）μg/L]与Sham组[（3.15±0.54）μg/L]相比明显下降,而FTC组[（5.47±1.29）μg/L]、TC组[（2.80±0.30）ng/L]则明显升高（均P＜0.01）;（2）与Sham组的血清VEGF浓度[（20.837±13.823）ng/L]相比,Cas组[（47.246±19.733）ng/L, P＜0.01]和FTC组[（46.043±22.607）ng/L,P＜0.05]明显升高,TC组[（22.870±12.057）ng/L]则无明显差异（P＞0.05）;（3）与Sham组相比,Cas组和FTC组血管内皮细胞VEGF mRNA表达水平均显著降低（均P＜0.01）,而TC组无显著差异（P＞0.05）。结论高盐饮食下,睾酮水平增高抑制血管内皮生长因子的表达和释放。     

葡萄糖对内皮祖细胞表达低氧诱导因子1α的影响

目的 观察葡萄糖对内皮祖细胞(EPC)表达低氧诱导因子1α(HIF-1α)和血管内皮生长因子(VEGF)的影响.方法 在EPC培养体系中加入不同浓度葡萄糖,分别在常氧(21%氧浓度)和低氧(1%氧浓度)条件下培养.检测各组HIF-1α及VEGF的基因和蛋白表达水平.结果 葡萄糖浓度相同,低氧组表达HIF-1α mRNA高于常氧组,VEGF的表达无统计学差异;氧浓度相同,10mmol/L葡萄糖组EPC表达HIF-1α mRNA高于其余两组,且随着葡萄糖浓度增加,VEGF表达逐渐下降.常氧浓度下测不到HIF-1α蛋白表达;低氧浓度下,10mmol/L葡萄糖组EPC表达HIF-1α最高.结论 高糖对低氧条件下的EPC具有毒性作用,能减弱其表达HIF-1α和VEGF.     

软脂酸对人脐静脉血内皮祖细胞增殖、凋亡及Bcl-2表达的影响

目的 探讨软脂酸(PA)对人脐静脉血内皮祖细胞(EPC)增殖、凋亡及Bcl-2表达的影响.方法 密度梯度离心法获取人脐静脉血单个核细胞,培养7 d 后,收集贴壁细胞并加入不同浓度软脂酸(分别为200 mmol/L、400 mmol/L、600 mmol/L)干预48 h.MTT法检测 PA对 EPC增殖能力的影响;流式细胞仪检测 PA对细胞凋亡率的影响;提取细胞RNA,采用逆转录一聚台酶链式反应(RT-PCR)技术检测Bcl-2mRNA表达;采用免疫组织化学法检测Bcl-2蛋白表达水平.结果 PA呈浓度依赖性抑制EPC增殖,诱导EPC凋亡(P<0.05或P<0.01);基础状态下EPC表达Bcl-2mRNA及蛋白,PA处理能抑制其表达,并存在量效关系(P<0.05或P<0.01).结论 PA通过下调Bcl-2表达诱导EPC凋亡、抑制EPC增殖,这可能影响血管内皮的修复及新生血管的形成.     

Endothelial progenitors

The studies carried out during the last two decades have represented a great effort in trying to identify and define cell populations endowed with the phenotypic and functional properties of endothelial progenitors. From these studies a scenario now emerges indicating that in the blood there are very rare endothelial progenitor cells, called endothelial colony-forming cells (ECFCs) or late outgrowth endothelial cells, not originated from bone marrow, capable of generating phenotypically and functionally competent endothelial cells, capable to be incorporated in vivo into growing vessels. ECFCs are present in the circulation as well as cells resident in the vascular endothelial intima. In addition to these progenitors, there are some hematopoietic progenitor cells capable of generating a monocytic cell progeny exerting a pro-angiogenic activity in vivo, but unable to be directly incorporated into growing vessels. These cells exert a pro-angiogenic effect in vivo through a paracrine mechanism based on the secretion of growth factors and cytokines.     

Endothelial aging

Aging is considered to be the major risk factor for the development of atherosclerosis and, therefore, for coronary artery disease. Apart from age-associated remodeling of the vascular wall, which includes luminal enlargement, intimal and medial thickening, and increased vascular stiffness, endothelial function declines with age. This is most obvious from the attenuation of endothelium-dependent dilator responses, which is a consequence of the alteration in the expression and/or activity of the endothelial NO synthase, upregulation of the inducible NO synthase, and increased formation of reactive oxygen species. Aging is also associated with a reduction in the regenerative capacity of the endothelium and endothelial senescence, which is characterized by an increased rate of endothelial cell apoptosis.     

Circulating Endothelial Cells and Endothelial Progenitor Cells in Obstructive Sleep Apnea

Increased circulating endothelial cells (CECs) have been observed in patients with vascular injury associated with acute myocardial infarction, pulmonary hypertension, and congestive heart failure. Decreased circulating endothelial progenitor cells (EPCs) have been observed in patients with risk factors for cardiovascular disease. Obstructive sleep apnea (OSA) is associated with increased risk of cardiovascular disease and endothelial dysfunction. Subjects were recruited from patients referred for overnight polysomnograms; 17 subjects had OSA and 10 control subjects did not have OSA. All subjects lacked vascular disease and risk factors for vascular disease. Peripheral blood was obtained from fasting subjects in the morning, following sleep studies. CECs and EPCs were quantified using magnetic bead separation with UV epifluorescence microscopy and flow cytometry immunophenotyping, respectively. Cell counts and demographic variables were compared using unpaired t tests. Regression analysis was performed comparing cell counts with the apnea-hypopnea index (AHI) and nadir SaO(2). Subjects with OSA and controls did not differ significantly in terms of age and body mass index. Subjects with OSA had higher AHI, lower nadir SaO(2), and greater sleepiness (Epworth Sleepiness Scale scores). There were no significant differences in CEC (7.0+/-1.5 vs. 4.9+/-0.9, p>0.05) or EPC (1077+/-318 vs. 853+/-176, p>0.05) between controls and OSA cases, respectively. In this small study, we found no differences in CECs or circulating EPCs between patients with OSA and controls. OSA may not be associated with these markers of vascular endothelial cell injury in patients with no concomitant vascular disease.     

体外反搏对冠心病患者血管内皮及其功能的影响

目的:通过增强型体外反搏治疗经皮冠状动脉腔内成形和支架置入术后的冠心病患者,观察对血管内皮舒张功能影响,以及是否会对血管内皮造成损伤。方法:将51例冠心病患者(均为经皮冠状动脉腔内成形和支架置入术后)分成两组,按1:2匹配,反搏组17例,对照组34例。两组均给予常规药物治疗,此外反搏组予以3个疗程的体外反搏治疗。血流介导的血管舒张反应(FMD)和硝酸甘油介导的血管舒张反应(NMD)采用Celermajer法;高敏C反应蛋白(hsCRP)的检测采用免疫比浊法。结果:对照组治疗后FMD、NMD、hsCRP较治疗前无明显变化(P＞0.05),反搏组治疗后FMD明显升高(P＜0.01), NMD也有升高(P＜0.05),hsCRP无明显变化(P＞0.05);组间比较发现,反搏组FMD和NMD的提高程度较对照组明显(P＜0.01),两组间hsCRP的改变无明显差异(P＞0.05)。结论:增强型体外反搏通过提高对血管壁内皮细胞的切应力,改善了经皮冠状动脉腔内成形和支架置入术后冠心病患者的内皮功能,使血管的舒张功能增加,且没有造成血管内皮的损伤,为冠心病患者的综合治疗提供了实验依据。