日本血吸虫26kDa谷胱甘肽S—转移酶DNA疫苗的研究及其保 …

本文对大陆株日本血吸虫２６ｋＤａ谷胱甘肽Ｓ－转移酶（Ｓｊ２６ＧＳＴ）的ＤＮＡ疫苗进行研究，并观察了其免疫保护效果。分别构建含Ｓｊ２６ＧＳＴ基因的重组质粒ｐＣＤ－Ｓｊ２６和ｐＢＫ－Ｓｊ２６，采用脂质体介导的基因转移将ｐＣＤ－Ｓｊ２６和ｐＢＫ－Ｓｊ２６分别导入ＮＩＨ３Ｔ３成纤维细胞，用免疫荧光法（ＩＦＡ）证实Ｓｊ２６ＧＳＴ在真核细胞中的表达。分别将ｐＣＤ－Ｓｊ２６和ｐＢＫ－Ｓｊ２６及ｐＢＫ－ＣＭＶ肌注     

日本血吸虫31kDa组织蛋白酶B DNA疫苗保护性免疫效果观察

目的观察日本血吸虫31kDa组织蛋白酶BDNA疫苗(Sj31B1N)在小鼠体内的保护性免疫效果.方法用Sj31B1N和Sj31B1N+pUCDNA疫苗肌注免疫BALB/C小鼠,用空白质粒载体VR1012做对照,在0、4、8周共免疫3次,每次免疫前及末次免疫后4周从尾静脉采血收集血清,经ELISA法检测小鼠血清抗体升高时,用日本血吸虫尾蚴攻击感染小鼠.结果Sj31B1N和Sj31B1N+pUC减虫率分别为24.2%和22.0%;肝卵减少率分别为34.9%和39.5%,每雌肝卵减少率分别为30.4%和35.3%.结论小鼠接种Sj31B1N后对日本血吸虫感染有减虫、减卵作用及抗雌虫生殖的作用.加质粒佐剂pUC未见有增强免疫效果的作用.     

血吸虫谷胱甘肽-S-转移酶DNA疫苗的研究进展

采用DNA疫苗防治血吸虫病是当前研究的热点领域,本文综述了日本血吸虫、曼氏血吸虫和埃及血吸虫等谷胱甘肽-S-转移酶DNA疫苗方面的研究进展。     

日本血吸虫26kDa谷胱甘肽S—转移酶在大肠杆菌的温控高？…

以重组质粒ｐＳｊ２６为模板，ＰＣＲ扩增出编码２６ｋＤａ谷胱甘肽Ｓ－转移酶（Ｓｊ２６ＧＳＴ）的ｃＤＮＡ，双酶切后克隆到ｐＢＶ２２０ＤＮＡ，构建ｐＢＶ２２０－Ｓｊ２６温控表达载体，ＣａＣｌ２法转化大肠杆菌ＤＨ５α，氨苄青霉素筛选转化子，酶切图谱分析及ＰＣＲ鉴定阳性克隆。阳性克隆菌在３０℃培养，４２℃温控表达Ｓｊ２６。测定表达产物ＧＳＴ活性，并用ｒＳｊ２６抗原免疫的鼠血清及日本血吸虫感染鼠血清进行Ｄｏｔ     

日本血吸虫26kDa谷胱甘肽S-转移酶在大肠杆菌的温控高效表达及鉴定

以重组质粒pSj26为模板，PCR扩增出编码26kDa谷胱甘肽S-转移酶（Sj26GST）的cDNA，双酶切后克隆到pBV220DNA，构建pBV220-Sj26温控表达载体，CaCl2法转化大肠杆菌DH5α，氨苄青霉素筛选转化子，酶切图谱分析及PCR鉴定阳性克隆。阳性克隆菌在30℃培养，42℃温控表达Sj26。测定表达产物GST活性，并用rSj26抗原免疫的鼠血清及日本血吸虫感染鼠血清进行Dot－ELISA和Westernblot检测其抗原性。实验结果表明PBV220－Sj26温控表达产物具有GST酶活性。SDS－PAGE经考马斯亮蓝染色可见染色较深的26kDa条带，该条带占菌体总蛋白的33．83％。抗rSj26的免疫鼠血清及日本血吸虫感染鼠血清均可识别26kDa条带。实验结果表明日本血吸虫26kDa条带能在大肠杆菌温控高效表达。     

血吸虫谷胱甘肽S-转移酶候选疫苗的研究现状

血吸虫病是一种严重危害人类健康的人兽共患寄生虫病,主要流行于亚洲、非洲和拉丁美洲的76个国家和地区.谷胱甘肽S-转移酶(GST)是WHO推荐使用的6种血吸虫疫苗候选抗原之一,用GST免疫小鼠、大鼠、牛或猴均可产生一定的保护力,提示GST是一种有希望的候选疫苗.该文综述了日本血吸虫Sj26GST和Sj28GST、曼氏血吸虫Sm28GST和埃及血吸虫Sh28GST等的研究现状.     

日本血吸虫中国大陆株23 kDa膜蛋白DNA疫苗诱导小鼠保护性免疫的研究

目的　研究日本血吸虫中国大陆株 2 3kDa膜蛋白 (SjC2 3)DNA疫苗诱导C5 7BL/6小鼠免疫保护作用。方法　将全长的SjC2 3基因克隆到真核表达载体pcDNA3.1,构建DNA疫苗 pcDNA3.1 SjC2 3。制备SjC2 3及IL 12的两个亚单位 p35、p4 0的DNA疫苗和对照 pcDNA3.1。 4 8只C5 7BL/6小鼠随机分为A、B、C 3组。A组小鼠肌注 10 0 μgpcDNA3.1;B组注射 10 0 μg pcDNA3.1 SjC2 3;C组肌注 pcDNA3.1 SjC2 3、pcDNA3.1 p35及pcDNA3.1 p4 0各 10 0 μg的混合物。每隔 2周各免疫 1次 ,共 3次。第 8周每鼠感染 4 5± 2条 /只尾蚴 ,4 5d后剖杀 ,计数成虫及肝内虫卵。采用免疫组化法检测SjC2 3及 p35、p4 0在小鼠局部组织内的表达 ;用脾细胞培养法检测经rSjC2 3 HD刺激后 ,攻击前、后小鼠脾细胞IL 2、IL 4、IL 10和IFN γ的水平。用Westernblotting检测血清中抗SjC2 3抗体。结果　SjC2 3以及p35、p4 0在免疫小鼠股四头肌细胞膜和细胞浆均获得表达。IL 2和IFN γ的水平攻击前、后在B组和C组均明显升高。Westernblotting检测抗SjC2 3抗体结果表明 ,免疫后两周 ,B组 8/10份血清为阳性 ,C组 9/10份血清阳性。B组和C组分别获得 2 6 .9%和 35 .4 %的减虫率 ,C组显著高于B组 (P <0 .0 5 ) ;减卵率分别为 2 2 .2 %和 2 8.4 %。结论　SjC     

日本血吸虫重组谷胱甘肽-S-转移酶诱生的保护性免疫应答特征的研究

目的：研究日本血吸虫重组谷胱甘肽－Ｓ－转移酶（ｒｅＳｊｃ２６ＧＳＴ）在不同品系小鼠（ＢＡＬＢ／ｃ小鼠及Ｃ５７ＢＬ／６小鼠）诱生免疫应答的差异。方法：将ｒｅＳｊｃ２６ＧＳＴ（弗氏佐剂）经皮下免疫ＢＡＬＢ／ｃ小鼠及Ｃ５７ＢＬ／６小鼠,收集免疫前和免疫后血清及取小鼠脾脏,分析ｒｅＳｊｃ２６ＧＳＴ免疫小鼠诱生的特异性抗体、脾脏淋巴细胞特异性增殖能力及细胞因子种类等。结果：ｒｅＳｊｃ２６ＧＳＴ免疫Ｃ５７ＢＬ／６小鼠所诱生的抗体总ＩｇＧ及ＩｇＧ亚类均较明显高于免疫ＢＡＬＢ／ｃ小鼠。抗体ＩｇＧ亚类分析显示,ｒｅＳｊｃ２６ＧＳＴ在Ｃ５７ＢＬ／６小鼠诱生较高滴度的ＩｇＧ１和ＩｇＧ２ａ及ＩｇＧ２ｂ（血清按１∶４００稀释,Ａ４９２ｎｍ值分别为＞３．０、１．１２７、＞３．０）,而在ＢＡＬＢ／ｃ小鼠主要诱生较低滴度的ＩｇＧ１和ＩｇＧ２ａ及ＩｇＧ２ｂ（血清按１∶４００稀释,Ａ４９２ｎｍ值分别为１．１８９、０．３９、０．６２５）;ｒｅＳｊｃ２６ＧＳＴ免疫能够诱导小鼠Ｔｈ细胞激活。细胞因子分析显示ｒｅＳｊｃ２６ＧＳＴ免疫Ｃ５７ＢＬ／６小鼠既能诱生较高水平的ＩＬ－２及ＩＦＮ－γ,又能诱生ＩＬ－５。而ｒｅＳｊｃ２６ＧＳＴ免疫ＢＡＬＢ／ｃ小鼠仅     

日本血吸虫23kDa膜蛋白DNA疫苗保护性免疫及IL—12免疫佐剂作用的研究

目的研究日本血吸虫中国大陆株23kDa膜蛋白(SjC23)DNA疫苗诱导BALB/c小鼠免疫保护作用以及IL-12的免疫增强效果.方法56只BALB/c雌性小鼠随机分为A、B、C、D4组,每组14只.A组(对照组),于每鼠两腿股四头肌注射100μgpcDNA3.1质粒DNA;B组(SjC23组),注射100μgpcDNA3.1-SjC 23质粒DNA;C组(SjC 23+IL-12DNA组),注射100μgpcD-NA3.1-SjC23、100μgpcDNA3.1-p35、100μgpcDNA3.1-p40质粒DNA的混合液;D组(SjC23+rIL-12蛋白组),免疫剂量同SjC23组.共免疫3次,每次免疫间隔2周,剂量和方法同第1次.于末次免疫后1个月,每鼠攻击感染(45±2)条日本血吸虫中国大陆株尾蚴.但D组的小鼠在攻击感染当天,及感染后第2、4、6天经腹腔注射0.2μg/鼠rIL-12蛋白.攻击后45d剖杀小鼠,计数成虫及肝内虫卵数.于末次免疫后2周对照组及SjC23组用51Cr释放法测定SjC23介导的特异性细胞毒作用;用脾细胞培养法检测经重组日本血吸虫23kDa膜蛋白亲水区大片段融合蛋白(GST-HD)刺激后,在免疫后及攻击后小鼠脾细胞IL-2、IL-4、IL-10和IFN-γ的水平.分别于攻击前后2周经小鼠尾静脉采血,用ELISA法检测血清中抗SjC23抗体.结果51Cr释放法测定SjC 23介导的特异性细胞毒作用,SjC 23组获得了56.4%的细胞毒活性,而对照组为25.8%;细胞因子IL-2和IFN-γ的水平在攻击前、后SjC23组较对照组有明显的升高,而IL-4和IL-10则无变化.ELISA法检测抗SjC 23抗体结果表明,免疫后2周,SjC23组4/10份血清为阳性,SjC 23+IL-12 DNA组5/10份血清阳性,SjC23+rIL-12蛋白组5/10份血清阳性.动物保护性实验结果显示,与对照组相比,B、C组和D组分别获得了28.1%、40.1%和41.7%的减虫率,减卵率分别为37.9%、53.3%和51.7%,加用IL-12的C组和D组与单独使用SjC 23的B组相比减虫率和减卵率均显著增加(P＜0.05).结论SjC23 DNA疫苗具有诱导BALB/c小鼠产生部分抗血吸虫免疫作用,IL-12作为细胞因子佐剂具有提高SjC23 DNA疫苗免疫保护性的作用.     

日本血吸虫DNA疫苗pCDSj32在小鼠皮肤组织内的表达及其保护性免疫效果观察

目的用皮内基因免疫注射的方法定位显示重组质粒pCDSj32在皮肤细胞的表达及其诱发小鼠抗日本血吸虫尾蚴攻击感染的保护性免疫效果.方法用生理盐水做媒体,将大量制备的质粒pCDSj32溶至100μg/100μ1,于小鼠尾根部远端1～2cm处进行皮内注射,4wk后取注射部位皮肤,石蜡包埋、切片,用间接免疫荧光法和免疫组化技术观察pCDSj32在皮肤细胞的表达.对照组和100μg/100μ1 pCDSj32单剂量免疫组小鼠各10只,于免疫后4wk,分别用40条日本血吸虫尾蚴攻击感染,计数成虫数和每克肝组织虫卵数.结果 pCDSj32皮内免疫注射后,可在朗罕细胞、表皮的角质形成细胞、真皮的成纤维细胞和毛囊基底细胞的胞浆内表达,表达产物具有免疫原性.与对照组相比,100μg/100μ1 pCDSj32单剂量免疫后4wk,可产生较好的保护效果,减成虫率达38.30%,肝脏组织减虫卵率为56.01%.结论首次用皮内基因免疫的方法证明日本血吸虫DNA疫苗pCDSj32可在皮肤多种细胞内表达,并可诱导小鼠产生较强的抗血吸虫感染的保护力.该免疫方法是继肌肉免疫注射之后又一种颇为有效的基因免疫途径,它将为抗血吸虫感染免疫提供一种模拟生理应答的有效途径.     

日本血吸虫Sj32DNA疫苗免疫效果的观察

目的：探讨血吸虫Ｓｊ３２ＤＮＡ疫苗抗血吸虫感染的免疫效果。方法：采用ＰＣＲ技术,人工合成引物,以重组ＤＮＡｐＳｊ３２为模板,扩增出编码３２ｋＤａ天冬酰胺肽链酶,即Ｓｊ３２全长ｃＤＮＡ和引入了起始密码子终止密码子的部分ｃＤＮＡ片段,将其分别克隆到ｐＫＢ－ＣＭＶ,构建真核表达载体ｐＢＫ－Ｓｊ３２－１和ｐＢＫ－Ｓｊ３２－２。采用脂质体介导的基因转移将两种重组ＤＮＡ导入ＮＩＨ３Ｔ３细胞,间接免疫荧光法证实Ｓｊ３２在真核细胞中表达。小批量制备纯化ＤＮＡ,进行动物免疫试验。将两种构建的真核表达载体分别直接ｉｍＢＡＬＢ／ｃ小鼠,共免疫３次,攻击感染后６ｗｋ剖杀小鼠。收集血清,ＥＬＩＳＡ法检测抗体水平,并计数成虫负荷及肝组织虫卵数。结果：ｐＢＫ－Ｓｊ３２－１组与ｐＢＫ－Ｓｊ３２－２组免疫小鼠后的减虫率分别为３８．６％和３０．９％,肝组织减卵率分别为５５．７％和５５．２％,与对照组比较,其间差别均具有极显著性意义（Ｐ＜０．０１）。各ＤＮＡ疫苗免疫组能诱导一定水平的抗血吸虫抗体。结论：Ｓｊ３２ＤＮＡ疫苗可诱导小鼠产生一定程度的保护性免疫力,有可能作为血吸虫疫苗候选抗原分子。     

日本血吸虫（中国大陆株）磷酸丙糖异构酶DNA疫苗的研制及其保护性免疫的研

目的 研究日本血吸虫中国大陆株磷酸丙糖异构酶ＤＮＡ疫苗诱导Ｃ５７ＢＬ／６小 保护性免疫作用。方法 分别以ｐＵＣ１９－ＳｊＣＴＰＩ和ｐｃＤＮＡ１．１－ＩＬ－１２为模板设计引物。将ＰＣＲ扩增到的ＳｊＣＴＰＩ基因以及ＩＬ－１２的亚单位Ｐ３５和Ｐ４０基因克隆到真核表达载体ｐｃＤＮＡ．３．１中大量制备ｐｃＤ－ＮＡ３．１－ＳｊＣＴＰＩ和ｐｃＤＮＡ３．１－Ｐ３５、ｐｃＤＮＡ３．１－Ｐ４０的质粒ＤＮＡ,把４５只５～６周龄Ｃ５７ＢＬ／６小鼠分成３组。对照组（ｐｃＤＮＡ组）肌肉注射１００ｕｇ的ｐｃＤＮＡ３．１;实验组（ＴＰＩ组）肌肉注射１００ｕｇ的ｐｃＤＮＡ３．１－ＳｊＣＴＰＩ;加强组（ＴＰＩ＋ＩＬ－１２组）肌肉注射１００ｕｇ的ｐｃＤＮＡ３．１－ＳｊＣＴＰＩ及１００ｕｇ的ｐｃＤＮＡ３．１－Ｐ３５和ｐｃＤＮＡ３．１－Ｐ４０的混合物     

日本血吸虫23 kDa膜蛋白DNA疫苗和蛋白质疫苗联合应用免疫保护性作用的研究

目的　研究 Sj C2 3DNA疫苗和 Sj C2 3蛋白疫苗联合免疫对 C5 7BL/ 6感染小鼠的免疫保护作用。方法　分别构建和制备 Sj C2 3DNA疫苗 (pc DNA3.1- Sj C2 3)和蛋白疫苗 (Sj C2 3大亲水片段融合蛋白 GST- HD)。 4 8只 C5 7BL / 6小鼠随机分为 A、B、C、D 4组 ,每组 12只。 A组 (Sj C2 3DNA+GST- HD联合应用组 )每只小鼠分别在第 0、2周经股四头肌注射 10 0μg Sj C2 3质粒 DNA,在第 4周经背部皮下多点注射 5 0 μg GST- HD+5 0 μg CFA;B组 (Sj C2 3DNA组 )每只小鼠分别在第 0、2、4周经股四头肌注射 10 0 μg Sj C2 3质粒 DNA;C组 (蛋白疫苗组 )于第 4周每鼠经背部皮下多点注射5 0μg GST- HD+5 0μg CFA 1次 ;D组 (对照组 )每鼠分别在第 0、2、4周肌注 10 0μg pc DNA 3.1。各组在末次免疫后 30 d每鼠以 4 5± 2条 /只日本血吸虫尾蚴攻击感染 ,攻击后 4 5 d剖杀小鼠 ,计数成虫及肝内虫卵数。在免疫前、末次免疫后和攻击后从小鼠尾静脉采血 ,分离血清 ,用 Western- blot法检测抗体反应。结果　联合组与质粒对照组相比 ,获得了 36 .9%的减虫率和 30 .7%减卵率 ;而单独Sj C2 3DNA疫苗组的减虫率为 2 6 .9% ,显著低于联合组 (P<0 .0 5 )和 2 2 .2 %的减卵率 ,单独蛋白疫苗组 (GST- HD)为 15 .2 %和 12 .2 %     

不同剂量日本血吸虫裸露DNA疫苗pCDSj32诱发小鼠保护性免疫力的初步研究

应用已构建的日本血吸虫裸露ＤＮＡ疫苗ｐＣＤＳｊ３２经骨骼肌免疫小鼠，获得了较好的保护性免疫效果。１００μｇ和２００μｇｐＣＤＳｊ３２免疫后，减成虫率分别为５２．４３％和３６．４７％；肝组织减卵率分别为５４．１９％和５７．７９％；并对各组小鼠肝脏虫卵肉芽肿的面积进行了测量。结果表明，ｐＣＤＳｊ３２免疫小鼠后可减少虫荷，降低血吸虫的产卵量，抑制肝脏虫卵肉芽肿的形成。     

日本血吸虫DNA疫苗pCDSj32不同免疫次数及末次免疫后不同攻击时间对小鼠保护性免疫力的观察

目的　观察日本血吸虫 DNA疫苗 p CDSj32不同免疫次数及末次免疫后不同攻击时间对小鼠保护性免疫力的影响。方法　分别以 10 0 μg/ 10 0 μl的 p CDSj32经股四头肌注射免疫 BAL B/ c小鼠 ,并分为一次免疫组合三次免疫组。各组于末次免疫后 4wk或 8wk,每只小鼠用 40条日本血吸虫尾蚴攻击感染。 6 wk后剖杀小鼠 ,观察各组小鼠的减成虫率和肝组织减卵率。结果　各免疫组与对照组相比均产生较好的保护免疫效果 ,减成虫率为 35 .6 1%～ 44 .44 % ,肝组织减卵率为 39.6 4%～6 9.0 6 %。结论　 DNA疫苗不同免疫次数及末次免疫后不同攻击时间对小鼠抗血吸虫尾蚴攻击感染效果有一定的影响。该疫苗免疫一次及免疫后 8wk攻击感染可获得最佳免疫效果     

可溶性重组日本血吸虫26 kDa GST的优化表达

目的探讨在大肠杆菌中表达可溶性重组日本血吸虫谷胱甘肽S-转移酶(rSj26 GST)的优化条件。方法用含有Sj26基因的原核表达载体pGEX-3X转化大肠杆菌BL21(DE3),将影响可溶性rSj26 GST表达的4个因素,即温度、诱导剂IPTG浓度、诱导时细菌的密度和诱导时间进行正交设计,确定其优化表达条件并大量表达,采用谷胱甘肽亲和层析法纯化表达的蛋白,测定酶活性,通过Western blot鉴定免疫活性。结果正交设计的直观分析和方差分析结果显示:可溶性rSj26GST最佳表达条件为温度25℃,IPTG的浓度1 mmol/L,诱导前细菌的生长密度0.9,诱导表达时间8 h。可溶性rSj26 GST纯化的产量为16 mg/L,Western blot证实rSj26 GST具有良好免疫原性和免疫反应性。结论通过正交设计确定了可溶性rSj26 GST在大肠杆菌中表达的优化条件。     

日本血吸虫混合DNA疫苗免疫效果观察

目的 为提高日本血吸虫DNA疫苗免疫效力,观察日本血吸虫抗原分子的混合DNA疫苗诱导小鼠的抗攻击感染的保护性免疫。方法 大量制备真核质粒pBK-CMV-Sj26和pBK-CMV-Sj23,然后将单价DNA疫苗pBK-CMV-Sj26和pBK-CMV-Sj23混合后免疫小鼠。实验分为4组：混合疫苗组、单价疫苗pBK-CMV-Sj23组、空质粒对照组及生理盐水对照组。各组于0周、3周、5周在小鼠股四头肌注射相应质粒DNA或生理盐水,第9周小鼠用血吸虫尾蚴攻击感染,第15周剖杀小鼠计算减虫率及减卵率。结果 与对照组比较,实验组小鼠减虫率及减卵率有极显著性意义（P＜0．01）;与单价pBK-CMV-Sj23组比较,混合DNA疫苗组的减虫率及减卵率有显著性意义（P＜0．05）。结论 血吸虫混合DNA疫苗诱导小鼠对血吸虫的保护力优于单价DNA疫苗。     

日本血吸虫(中国大陆株)磷酸丙糖异构酶DNA疫苗的研制及其保护性免疫的研究

目的　研究日本血吸虫中国大陆株磷酸丙糖异构酶 DNA疫苗诱导 C5 7BL /6小鼠的保护性免疫作用。方法　分别以 p U C19- Sj CTPI和 pc DNA1.1- IL - 12为模板设计引物 ,将 PCR扩增到的Sj CTPI基因以及 IL - 12的亚单位 P35 和 P40 基因克隆到真核表达载体 pc DNA .3.1中。大量制备 pc D-NA3.1- Sj CTPI和 pc DNA 3.1- P35 、pc DNA3.1- P40 的质粒 DNA。把 45只 5～ 6周龄 C5 7BL /6小鼠分成 3组 ,对照组 (pc DNA组 )肌肉注射 10 0μg的 pc DNA3.1;实验组 (TPI组 )肌肉注射 10 0μg的pc DNA3. 1- Sj CTPI;加强组 (TPI IL - 12组 )肌肉注射 10 0μg的 pc DNA 3.1- Sj CTPI及 10 0μg的pc DNA3.1- P35 和 pc DNA3.1- P40 的混合物 ,分别于第 1、5周各免疫 1次 ,第 9周每鼠用 45条尾蚴攻击感染 ,攻击后 45 d剖杀小鼠 ,计数成虫、肝内虫卵。采用免疫组化法检测 Sj CTPI在局部肌组织内的表达 ,用脾细胞培养法检测特异性抗原刺激后的 IL - 2、IL - 4、IL - 10、IFN-γ在攻击前后的水平。分别于 2次免疫前和攻击前及攻击后 2周经尾静脉采血 ,分别采用 EL ISA和 Western- blot检测血清中抗 TPI抗体。结果　 Sj CTPI可在 C5 7BL /6小鼠骨骼肌细胞膜、细胞浆中得到表达。细胞因子 IL -2的水平在攻击前、后 ,实验组