噬菌体表面展示技术筛选抗血小板GPⅡb/Ⅲa复合物单链抗体

目的 用噬菌体表面展示技术，直接从抗血小板表面蛋白全套单链抗体噬菌体展示文库中筛选能与糖蛋白(GP)Ⅱb/Ⅲa复合物高亲合力结合的单链抗体克隆，为开发有自主知识产权的抗栓药物奠定基础。方法 从活化血小板免疫的小鼠脾淋巴细胞中提取总RNA，反转录成cDNA后，用抗体可变区混合引物扩增全套轻、重链可变区基因，经重叠延伸反应，装配成单链抗体(ScFv)基因，将其克隆到噬菌体载体pHENl中，构建单链抗体噬菌体抗体库。对抗体库进行亲合筛选后，ELISA法鉴定抗GPⅡb/Ⅲa复合物单链抗体。结果 经过4轮“吸附——竞争性洗脱——扩增”的富集过程，Phage—ELISA得到一个ELISA活性较高的能与GPⅡb/Ⅲa结合的克隆。序列测定符合抗体可变区结构特点。结论 成功构建了全套抗血小板表面蛋白单链抗体噬菌体展示文库，并筛选得到具有GPⅡb/Ⅲa结合能力的单链抗体基因。     

抑制血小板聚集功能的抗血小板膜糖蛋白GPⅡbⅢa自身抗体的筛选

目的：筛选出血浆中含有抑制血小板聚集的血小板膜糖蛋白GPⅡbⅢa自身抗体的血小板减少性紫癜(ITP)患者，为人源化抗GPⅡbⅢa基因工程抗体的研制做准备。方法：用改良MAIPA法检测24例慢性ITP患者血浆有无血小板膜糖蛋白GPⅡbⅢa自身抗体，用血小板聚集试验研究抗GPⅡbⅢa自身抗体对血小板聚集的影响。结果：24例慢性ITP患者中10例(41．7％)血浆中抗GPⅡbⅢa自身抗体阳性，2例明显抑制血小板聚集功能。结论：少数抗GPⅡbⅢa自身抗体可抑制血小板聚集功能。     

原发性血小板减少性紫癜患者抗血小板糖蛋白自身抗体的研究(测定药盒的研制与应用)

利用本室生产的二株抗人血小板单克隆抗体SZ-21和SZ-22,研制成功能够检测抗血小板膜糖蛋白(GP)Ⅱb和Ⅲa自身抗体的酶联免疫测定药盒。利用SZ-21或SZ-22(分别作用于GPⅢa和GPⅡb)包被的微孔结合正常血小板提取液中的GPⅡb/Ⅲa,洗涤后加入病人或正常对照的血浆,然后以辣根过氧化物酶联结的抗人IgG检测抗GPⅡb/Ⅲa的自身抗体。应用该药盒检测69例原发性血小板减少性紫癜(ITP)患者血浆中抗GP直Ⅱb/Ⅲa自身抗体,其中22例为阳性,阳性率31.8%。急性与慢性ITP的抗GPⅡb/Ⅲa抗体阳性率无差别,但儿童ITP组抗GPⅡb/Ⅲa抗体阳性率(20%)低于成人ITP组的阳性率(41.0%)。抗GPⅡb/Ⅲa抗体的阳性结果与PAIgG含量无相关,与血小板数也无相关。     

血小板膜糖蛋白特异性抗体与免疫性血小板减少症患者疗效及出血程度的关系

目的探讨血小板膜糖蛋白(GP)特异性抗体与原发免疫性血小板减少症(ITP)患者临床疗效及出血程度之间的关系。方法 2013年10月至2015年6月40例新诊断ITP患者纳入研究,所有患者均接受口服大剂量地塞米松(40 mg/d×4 d)治疗。应用改良单克隆抗体俘获血小板抗原技术(MAIPA)检测患者体内抗血小板GPⅡb/Ⅲa和GPⅠb/Ⅸ抗体,分析抗体与ITP患者疗效及出血程度的关系。结果大剂量地塞米松治疗后,血小板膜糖蛋白特异性抗体阴性的患者疗效(95.0%)明显优于抗体阳性的患者(60.0%)(P0.05),抗GPⅠb/Ⅸ抗体阴性的患者疗效(90.9%)优于抗GPⅠb/Ⅸ抗体阳性的患者(61.1%)(P0.05)。抗体阳性患者2级出血(55.0%)高于抗体阴性患者(20.0%)(P0.05)。1级出血时抗GPⅡb/Ⅲa抗体阳性(9.5%)、抗GPⅡb/Ⅲa与抗GPⅠb/Ⅸ双抗体阳性(28.6%)出血程度均高于抗GPⅠb/Ⅸ阳性,差异均有统计学意义(P﹤0.05)。2级出血时抗GPⅠb/Ⅸ抗体阳性(33.3%)、抗GPⅡb/Ⅲa与抗GPⅠb/Ⅸ双抗体阳性(40.0%)出血程度比较,差异无统计学意义(P0.05)。结论抗GPⅠb/Ⅸ抗体阳性的ITP患者对大剂量地塞米松治疗的反应差,血小板膜糖蛋白特异性抗体阳性的患者较抗体阴性患者临床出血程度重。     

人抗HBs轻链基因的序列测定及序列分析

目的:获得人源性乙型肝炎病毒抗HBs轻链基因.方法:从已构建的人源性噬菌体抗体库中,用固相化HBs/Ag对构建的人源性噬菌体抗体库进行三轮淘筛,经ELISA实验,筛选到抗HBs噬菌体抗体(P/N:2.415)的阳性克隆,根据已知序列合成一对轻链引物,进行PCR扩增,扩增出轻链目的基因片段,将目的基因片段定向克隆入质粒pUC18,进行序列测定及分析.结果:筛选出的克隆具有HBsAg特异性亲和力,构建了pUCl8-抗HBsk链重组质粒,序列分析其为κ链,为643bp包括了可变区和恒定区.结论:利用抗原抗体特异性反应从噬菌体抗体库中筛选到抗HBs轻链基因.     

用抗血小板膜糖蛋白ⅡbⅢa单克隆抗体检测ITP自身抗体的临床应用

本文利用抗血小板膜糖蛋白Ⅱ、b、Ⅲa(GPⅡb、GPⅢa)单克隆抗体,采取酶联免疫双抗体夹心法分别检测了26例特发性血小板减少性紫癜(ITP)患者血浆抗GPⅡb、GPⅢa自身抗体.结果显示3例抗GPⅡb阳性(约占11.5%),1例抗GPⅢa(约占3.8%),7例同时抗GPⅡb.GPⅢa(约占26.9%),阳性总数为11例(约占42.3%);且抗GPⅡb. GPⅢa阳性结果与血小板数无关.     

人源天然Fab噬菌体抗体库的构建及抗c-Met抗体的筛选?鉴定

目的:构建大容量人源天然Fab噬菌体抗体库,筛选抗c-Met特异性抗体并进行初步鉴定.方法:采集20位健康成人的骨髓淋巴细胞.用PCR扩增人Fab片断抗体基因,插入载体pComb3XSS内,构建人源天然Fab抗体库.以固相化的抗原对抗体库进行6轮筛选后,随机挑选60个克隆用Phage ELISA、BstO I酶切片断分析进行检测,阳性克隆作可溶性表达和鉴定.结果:构建的Fab噬菌体抗体库的库容为1.2×109,从中筛选到1株与c-Met特异性结合的人源抗体克隆,命名为AM2-26.DNA序列分析证明为人免疫球蛋白可变区基因,Western blot证实为人源抗c-Met Fab抗体片段,ELISA特异性鉴定阳性.结论:构建了大容量人源天然Fab抗体库,从中获得1株抗c-Met人源Fab抗体片段,有望为抗肿瘤药物的研制提供新的候选分子.     

血小板特异性抗体检测对血小板减少性紫癜鉴别的诊断意义

目的探讨血小板特异性抗体（抗GPⅠb、抗GPⅡb、抗CPⅢa）检测对区别免疫性与非免疫性血小板减少性紫癜诊断的临床价值。方法本院有70例血小板减少性紫癜患者,其中37例为免疫性血小板减少患者,33例为非免疫性血小板减少患者,应用单克隆抗体俘获血小板抗原技术（MAIPA）检测血小板特异性抗体（抗GPⅠb、抗GPⅡb、抗Ⅲa）。结果37例免疫性血小板减少患者中有26例血小板特异性抗体检测至少一项阳性,占70．2％。非免疫性血小板减少患者为6．1％。结论自体免疫性血小板减少性紫癜（AITP）患者血小板膜糖蛋白特异性抗体的总阳性率（抗GPⅡb或抗GPⅢa或抗GPⅠb特异性自身抗体阳性）为70．2％。显著高于非免疫组6．1％（χ^2=29．97,P〈0．05）,因此,我们认为血小板特异性抗体检测是特异性较强的一项指标,对提高ITP确诊率及鉴别免疫性和非免疫性血小板减少性紫癜有重要的临床意义。     

流式微球芯片俘获技术对免疫性血小板减少症患者抗体的检测及临床意义

目的 使用流式微球检测法测定免疫性血小板减少症(ITP)患者自身抗体的表达,探索该方法 在诊断ITP患者中的临床意义,并探究血小板特异性自身抗体的种类与临床用药疗效之间的关系.方法 对81例ITP患者的抗血小板膜糖蛋白Ⅰb(GPⅠb)抗体、抗血小板膜糖蛋白Ⅱb/Ⅲa(GPⅡb/Ⅲa)抗体表达使用流式微球芯片俘获技术(F...     

从大容量噬菌体抗体库中筛选人源性抗角蛋白scFv

目的从大容量噬菌体抗体库中筛选人源性抗角蛋白单链抗体(scFv),测定其特异性结合活性并进行基因序列分析。方法以混合分子量人表皮角蛋白包被固相,对构建的大容量噬菌体抗体库进行筛选,经4轮“吸附洗脱扩增”后,挑取单克隆,用ELISA法测定特异性结合活性,并对阳性克隆抗体基因进行DNA指纹分析及序列同源性分析。结果经4轮筛选,获得9株可表达抗人角蛋白单链抗体的克隆,酶切鉴定正确后,经DNA指纹分析及序列同源性分析证明为不同的抗体基因。结论利用噬菌体抗体库技术获得了人源性抗角蛋白单链抗体,为临床应用研究提供了具有更广阔应用前景的人源小分子抗体。     

抗血小板膜糖蛋白自身抗体测定的临床意义

原发性血小板减少性紫癜(ITP)的发病机制是由于抗血小板抗体引起血小板破坏过多所致。这种特异性的抗血小板抗体大部分是IgG型,产生血小板抗体的血小板相关抗原的性质,目前尚难肯定。我院1987年由苏州医学院血栓研究室提供抗血小板膜糖蛋白Ⅱb/Ⅲa(GPⅡ/Ⅲa)单克隆抗体测定35例ITP患者血浆中抗血小板膜GPⅡb/Ⅲa自身抗体(后简称抗GPⅡb/Ⅲa)含量,并同时测定30例正常人血浆进行比较。一、观察对象和方法1.对照组:30名健康献血员及本院职工,男12例,女18例,年龄20～42岁,无出     

抗HBsAg人源噬菌体抗体重链基因的序列分析

应用噬菌体抗体库技术筛选抗ＨＢｓＡｇ人源噬菌体抗体重链基因，并用基因序列分析技术对其进行序列分析。结果：筛选出抗ＡＢｓＡｇ人源噬菌体抗体并发现其重链基因序列与人免疫球蛋白重链基因序列同源性可达９５％以上，且与人免疫球蛋白第Ⅲ家族的框架区基因序列同源性均可高达９７％。结论：筛选的抗ＨＢｓＡｇ人源噬菌体抗体的重链基因属于人免疫球蛋白基因第Ⅲ家族成员     

抗HBsAg人源噬菌体抗体重链基因的序列分析

应用噬菌体抗体库技术筛选抗ＨＢｓＡｇ人源噬菌体抗体重链基因，并用基因序列分析技术对其进行序列分析。结果：筛选出抗ＡＢｓＡｇ人源噬菌体抗体并发现其重链基因序列与人免疫球蛋白重链基因序列同源性可达９５％以上，且与人免疫球蛋白第Ⅲ家族的框架区基因序列同源性均可高达９７％。结论：筛选的抗ＨＢｓＡｇ人源噬菌体抗体的重链基因属于人免疫球蛋白基因第Ⅲ家族成员。     

人血小板功能抗体及其片段的识别

目的研究特发性血小板减少性紫癜（ITP）患者血小板膜糖蛋白（GP）特异性IgG抗体及其片段的免疫活性及对血小板聚集功能的影响.方法用改良单克隆抗体特异性俘获血小板抗原技术（MAIPA）检测84例慢性ITP患者血浆中抗GPⅡb/Ⅲa、GPⅠb/Ⅸ及GPⅥ自身抗体,比浊法血小板聚集试验筛选出自身抗体阳性并能抑制血小板聚集的患者,用蛋白A柱纯化其血浆IgG抗体并用胃蛋白酶制备F（ab＇）2片段.检测纯化的IgG抗体及其酶切片段与血小板GP的结合活性及对正常人血小板聚集功能的影响.结果 （1）84例ITP患者血浆中,48例（57.1%）抗GPⅡb/Ⅲa和/或GPⅠb/Ⅸ和/或GPⅥ自身抗体阳性,其中7例（14.6%）明显抑制了二磷酸腺苷、瑞斯托霉素或胶原诱导的血小板聚集;（2）纯化的IgG及F（ab＇）2片段具有与相应血小板GP的结合活性;（3）4例患者纯化IgG及F（ab＇）2片段具有抑制血小板聚集的功能.结论 F（ab＇）2片段是IgG自身抗体的功能片段,它不但保留了良好的抗原结合活性且可部分抑制血小板聚集功能,为人源化血小板糖蛋白特异性抗体的制备奠定了基础.     

抗恙虫病东方体噬菌体抗体库的构建和初步筛选

目的 构建抗恙虫病东方体噬菌体抗体库并进行初步筛选,获得与恙虫病东方体膜抗原特异性结合的抗体克隆,为研制恙虫病的快速诊断试剂盒奠定基础.方法 从感染恙虫病东方体小鼠的脾细胞中提取RNA,经逆转录、PCR扩增出抗体轻链和重链基因,将轻链基因和表达载体pComb3进行酶切、连接.转化大肠杆菌XL1-blue,构建轻链库;再对轻链重组质粒和重链Fd基因进行酶切、连接,转化大肠杆菌XL1-blue,构建组合文库,以辅助噬菌体VCS M13进行超感染.用恙虫病东方体56 kDa型特异性抗原作为筛选抗原,进行4轮富集筛选后用ELISA法进行阳性克隆的鉴定.结果 构建了库容为3.46×106的鼠源性抗恙虫病东方体的噬菌体Fab片段抗体库.经过4轮富集筛选,抗体库中的目的 抗体得以富集约160倍,并用ELISA法对其进行鉴定,得到了7个阳性克隆.结论 构建的抗恙虫病东方体噬菌体抗体库,库容为3.46×106,滴度为2.5×1012 cfu/ml,基本上达到了建库要求,能够满足多样性的需求,并成功的筛选出抗恙虫病东方体56 kDa蛋白的抗体,用过氧化物酶标记的抗M13抗体进行了初步鉴定,认为具有一定的特异性.     

血小板膜糖蛋白自身抗体检测新方法--流式微球技术

目的 建立流式微球技术检测血小板膜表面糖蛋白特异性自身抗体（GPⅡb/Ⅲa、GPⅠb/IX）,探讨其在特发性血小板减少性紫癜（ITP）患者体内表达情况及其与激素治疗效果之间的关系.方法 取67例ITP患者及30例健康对照组的外周血,分离、裂解血小板与单抗包被微球共同孵育后加入PE标记多克隆抗体,流式细胞仪分析,评价ITP患者激素治疗效果.结果 ITP患者血小板GPⅡb/Ⅲa、GPⅠb/IX自身抗体荧光强度为4.58（0.22～30.20）、4.78（0.56～22.00）,对照组为0.92（0.23～2.28）、0.87（0.22～2.13）.以微球荧光强度比率（测定/对照）CD41a＞0.025%、CD42＞2.12%定为阳性,用流式微球技术同时检测两种抗血小板抗体,诊断ITP敏感性为95.5%（64/67）、特异性为90.9%,阳性预测值为96.7%.ITP患者激素治疗效果与抗体检测结果呈负相关（r=-0.318）.结论 流式微球技术检测血小板膜糖蛋白自身抗体对ITP诊断的敏感性、特异性较高,对治疗及预后也有一定临床指导意义.     

血清学检测H-Y噬菌体Fab抗体阳性克隆的分析

目的 为分析H-Y噬菌体Fab抗体特异性,筛选用于抗体亲和力提高的H-Y噬菌体Fab抗体阳性克隆.方法 以从噬菌体Fab抗体库中筛选到具有雄性特异性结合活性的阳性克隆A6、A8、E6为基础,通过C57BL/6鼠脾细胞为抗原的ELISA分析3株阳性克隆的特异性,镜下观察亲和力较好的A8阳性克隆ELISA结果,利用生物信息学方法预测分析该克隆的抗体基因可变区序列和结构.结果 ELISA分析显示3株阳性克隆具有雄性特异性,其中A8阳性克隆具备较好的雄性特异性.A8克隆具有免疫球蛋白轻链和重链可变区结构,其重链、轻链可变区分别属于VHI和VκIV基因家族.结论 A8阳性克隆可用于后续的导向筛选和抗体基因改造等研究工作.     

再生障碍性贫血血小板相关抗体及血浆抗血小板膜糖蛋白抗体检测

对74例再生障碍性贫血患者进行了血小板相关抗体(PAIgG、PAIgA、PAIgM、PAC_3)及血浆中抗血小板膜糖蛋白(GP Ib、GP Ⅱb/Ⅲa)抗体的测定。结果表明,PAIgG和PAIgM增高有显著性,29.6％的患者血浆中可检出抗GP Ib及/或抗GP Ⅱb/Ⅲa抗体、提示病理免疫机制可能参与再障血小板异常的作用。     

人源性抗核抗体Fab片段的筛选及鉴定

目的:制备人源性抗核抗体Fab片段.方法:通过4轮淘筛,富集已构建的人源性抗核抗体Fab片段噬菌体抗体库,间接ELISA法鉴定4轮淘筛后抗核抗体Fab片段噬菌体抗体;提取阳性克隆的噬菌粒DNA,切除gⅢ基因片段,自连接后转化大肠杆菌XL1-Blue,以IPTG诱导表达可溶性人源性抗核抗体Fab片段;应用间接ELISA法及荧光免疫法对表达上清进行鉴定.结果:第4轮洗脱的噬菌体滴度较第1轮增加200条倍,从抗核抗体Fab片段噬菌体库中筛选出2株阳性克隆,切除gⅢ基因后自连的噬菌粒DNA经XhoⅠ单酶切证实连接成功.间接ELISA法检测结果显示:制备的可溶性人源性抗核抗体Fab片段均呈现抗dsDNA阳性,具有抗原特异性;免疫荧光法结果显示:Hep2细胞和猴肝脏组织细胞核显示均质型荧光,绿蝇短膜虫的动基体显示均质型荧光.结论:成功制备具有抗原特异性的可溶性、人源性抗核抗体Fab片段,为高亲和力抗核抗体Fab片段的制备奠定了基础.     

利用噬菌体展示技术筛选人源抗肝癌单链抗体

目的:利用噬菌体展示技术,从Griffinl Library人源噬菌体单链抗体库中筛选出人源抗肝癌单链抗体.方法:扩增Griffinl Library人源噬菌体单链抗体库后,以甲胎蛋白(AFP)为包被抗原,用免疫试管法富集筛选人源抗肝癌单链抗体,用ELISA法鉴定获得的阳性克隆,对其基因进行测序.将淘选出的阳性单链抗体...