shRNA逆转耐阿霉素人乳腺癌细胞株（MCF-7/AdrR）的多药耐药性

目的〖HT5"SS〗： 利用短发夹RNA（short hairpin RNA,shRNA）表达载体逆转耐阿霉素人乳腺癌细胞株(MCF7/AdrR)的多药耐药性（multidrug resistance,MDR）。〖HT5W〗方法〖HT5"SS〗： 构建2个MDR1基因shRNA表达质粒,稳定转染MCF7/AdrR细胞。RTPCR分析MDR1基因mRNA的表达,Western blotting检测P糖蛋白(Pgp)的表达,流式细胞术和MTT法分别检测乳腺癌细胞的凋亡和对阿霉素的敏感     

PHⅡ-7对人乳腺癌多药耐药细胞MCF-7/ADR体外杀伤活性和逆转耐药作用

背景与目的:多药耐药(multidrug resistance,MDR)是恶性乳腺癌化疗失败的主要原因,而ABC转运蛋白家族的P-glycoprotein(P-gp)高表达是MDR的主要机制之一.因此研制能抑制P-gp表达及其功能的新型抗癌药是目前研究的热点.本研究旨在研究PH Ⅱ-7对人乳腺癌多药耐药细胞MCF-7/ADR体外抗瘤活性及逆转耐药的作用.方法:采用MTT法检测PHⅡ-7、多柔比星(adriamycin,ADR)及二者联合应用对人乳腺癌细胞MCF-7和耐药细胞株MCF-7/ADR的IC50值;采用流式细胞仪测定PH Ⅱ-7对MCF-7及MCF-7/ADR细胞凋亡的诱导作用;采用逆转录PCR和实时荧光定量PCR方法检测PHⅡ-7对多药耐药基因1(multidrug resistance gene 1,mdr1)表达水平的影响;通过流式细胞仪观察PHⅡ-7处理前后,MCF-7/ADR细胞内Rhodamine123浓度的改变,分析PHⅡ-7对p-gp外排功能的影响.结果:PH Ⅱ-7对MCF-7和MCF-7/ADR细胞均有生长抑制作用,IC50值分别为(6.07±0.85)和(5.51±1.22)μmol/L;低浓度PHⅡ-7与ADR联合应用能增强其细胞毒作用,二者具有协同作用.PHⅡ-7可诱导MCF-7和MCF-7/ADR细胞凋亡;在诱导凋亡过程中,PHⅡ-7可降低MCF-7/ADR细胞内mdrl基因的表达,抑制p-gp外排功能.结论:PHⅡ-7可诱导MCF-7/ADR凋亡,并具有对MCF-7相同的体外杀伤活性.PHⅡ-7可通过抑制P-gp的表达和功能逆转MCF-7/ADR耐药性.     

利用siRNA阻抑survivin基因表达诱导乳腺癌细胞系MCF-7细胞凋亡的研究

背景与目的:survivin属IAP基因家族成员,表达于多种肿瘤组织中,能促使细胞逃避凋亡,并促进细胞的异常有丝分裂。本研究旨在探讨敲除survivin基因后,癌细胞的增殖和凋亡情况。方法:利用RNAi阻抑人乳腺癌细胞内survivin基因的表达,RT-PCR和Westernblot法分析survivin基因mRNA和蛋白的表达,MTT法检测细胞生长增殖抑制率,流式细胞术检测细胞凋亡率。结果:survivinsiRNA转染组,survivin基因表达水平与未转染组比较下调了64%。随着siRNA浓度的增加,细胞增殖抑制率逐渐增高,200nmol/L剂量组细胞增殖抑制率最高,可达60.9%。不同浓度的siRNA可不同程度地诱导细胞凋亡,200nmol/L剂量组凋亡率最高,可达29.0%。结论:survivinsiRNA有可能成为治疗乳腺癌的新药物。     

三氧化二砷逆转人乳腺癌MCF-7/ADM细胞耐药的机制研究

目的　探讨三氧化二砷 (As2 O3 )对人乳腺癌MCF 7/ADM细胞耐药性的逆转作用及其相关机制。方法　采用MTT法检测As2 O3 的细胞毒性及非细胞毒性剂量 ,对MCF 7/ADM细胞药敏性的影响。以荧光分光光度计测定细胞内药物浓度的改变 ,明确As2 O3 对MCF 7/ADM的逆转作用。同时 ,于逆转前后分别采用生化方法测定谷胱甘肽S 转移酶 (GSTs)酶活性 ,RT PCR方法检测GST πmRNA表达水平的改变。结果　As2 O3 的非细胞毒性剂量为 0 .2 μmol/L ,低毒剂量为 0 .8μmol/L。0 .2 μmol/LAs2 O3 可增加MCF 7/ADM细胞内阿霉素 (ADM)浓度 ,使细胞MCF 7/ADM的IC50 由原来的5 3.74 μmol/L降低至 2 5 .0 μmol/L ,其逆转倍数为 2 .1倍。在 0 .2 μmol/L、0 .8μmol/LAs2 O3 作用前后 ,GSTs酶活性有显著性改变 ,由 2 9.6 8± 0 .2 9(U/ml)分别降低为 19.2 9± 2 .10 (U/ml)、12 .6 6± 2 .78(U/ml) ,P <0 .0 5 ,而GST πmRNA的表达水平也呈不同程度的下调。结论　As2 O3 可部分逆转人乳腺癌MCF 7/ADM细胞对ADM的耐药性 ,其逆转机制可能与细胞内GST π的改变有关。     

载体表达小干扰RNA逆转卵巢癌的多药耐药

目的:探讨载体表达的小干扰RNA(smallinterferingRNA,siRNA)逆转卵巢癌细胞多药耐药的可行性。方法:浓度梯度诱导法建立人卵巢癌阿霉素耐药细胞株OVCAR/AR;脂质体介导将MDR1特异性siRNA的表达载体(pSN/mdr1a和pSN/mdr1b)转染OVCAR/AR细胞;实时定量RT-PCR检测MDRlmRNA的表达;流式细胞术检测P-gp的表达,罗丹明试验检测P-gp的药物转运功能;MTT法检测OVCAR/AR细胞对化疗药的抵抗性。结果:转染pSN/mdr1a和pSN/mdr1b后,OVCAR/AR细胞的MDR1mRNA和P-gp的表达均显著下降,P-gp的转运功能减少,OVCAR/AR细胞对阿霉素、泰素的耐药性逆转。结论:载体表达的siRNA可持久有效地抑制卵巢癌耐药细胞MDR1mRNA和P-gp的表达,并逆转其多药耐药。     

乳腺癌多药耐药细胞MCF-7/ADR中Twist的表达与EMT现象的实验研究

目的：观察乳腺癌多药耐药细胞MCF-7／ADR中Twist表达及上皮-间质转化现象．探讨其与MCF-7／ADR侵袭转移能力增强的相关性。方法：分别以RT-PCR法、链霉亲和素-生物素酶复合物（Strept avidin biotin complex，SABC）免疫组织化学方法和Western blot法检测乳腺癌细胞系MCF-7及其多药耐药株MCF-7／ADR中介导EMT发生的转录因子Twist、上皮性标记基因E-钙粘素（E—cadherin）和间质性标记基因N-钙粘素（N—cadherin）表达的改变情况。结果：亲本细胞MCF-7中E—cadherin mRNA的表达和蛋白水平的表达均为阳性，Twist和N—cadherin表达阴性；多药耐药株MCF-7／ADR中E—cadherin mRNA和蛋白表达缺失，而在亲本细胞MCF-7中不表达的Twist和N—cadherin表达阳性。结论：在多药耐药乳腺癌细胞MCF-7／ADR中．其侵袭力增强可能与Twist介导的EMT发生有关。     

大黄素对乳腺癌多药耐药细胞株MCF-7/Adr的耐药逆转作用

目的：探讨中药成分大黄素(Emodin，EMD)对乳腺癌多药耐药细胞株MCF-7／Adr的耐药逆转作用。方法：药物敏感试验采用四唑氮盐(MTT)比色法，P糖蛋白以Western-blot法检测。结果：EMD在0～20μmol／L浓度时作用14天后对MCF-7／Adr未见明显毒性作用；EMD在10μmol／L浓度时，其耐药逆转倍数为1．7倍。EMD在20μmol／L浓度时，处理MCF-7／Adr2、4、6和11天后，检测P糖蛋白发现自第4天起P糖蛋白表达下降，至第11天无法检测到P糖蛋白的表达。结论：EMD具有逆转MCF-7／Adr多药耐药性的作用，可明显下调P糖蛋白的表达，且逆转作用持久。     

小分子干扰RNA联合反义脱氧寡核苷酸靶向逆转人乳腺癌细胞MCF-7/ADR多药耐药的研究

目的探讨针对多药耐药基因(MDR-1)的小分子干扰RNA(siRNAs)和反义脱氧寡核苷酸(asODNs)联合应用逆转人乳腺癌细胞MCF-7/ADR的作用效果。方法设计并合成针对MDR-1基因同一序列的siRNAs和asODNs及阴性对照siRNAs,采用转染试剂lipofectamineTM2000分别转染人乳腺癌耐药细胞MCF-7/ADR;利用RT-PCR检测MDR-1mRNA和Western blot检测MDR-1蛋白质的表达;采用罗丹明123外排实验检测P-gp的转运功能,MTT法检测MCF-7/ADR细胞对阿霉素的耐药逆转效果。结果siRNAs、asODNs、asODNs和siRNAs联合应用均能降低MDR-1mRNA及其蛋白质表达,提高P-gp的转运功能,使细胞对阿霉素的敏感性明显恢复;asODNs和siRNAs联合应用效果明显提高;低浓度siRNAs(200nmol/L)比高浓度asODNs(5μmol/L)的效果强。结论siRNAs、asODNs能有效逆转人乳腺癌细胞MCF-7/ADR的多药耐药,asODNs和siRNAs联合应用效果明显加强。     

沉默HuR的表达增加人乳腺癌耐药MCF-7/Adr细胞对多柔比星的敏感性

目的：研究RNA干扰人抗原R（human antigen R,HuR）基因的表达对人乳腺癌耐药细胞株MCF-7/Adr对多柔比星（doxorubicin）敏感性的影响。 方法： 构建靶向 HuR基因 的shRNA表达质粒（pGenesil-siHuR）,稳定转染至MCF-7/Adr细胞,real-time PCR检测细胞中 MDR1 mRNA的表达,Western blotting检测MCF-7/Adr细胞中由 MDR1 基因编码的P糖蛋白（P-glycoprotein,P-gp）的表达,MTT法检测pGenesil-siHuR 转染后MCF-7/Adr细胞在多柔比星作用后的存活率和IC50,流式细胞术检测MCF-7/Adr细胞的凋亡率。 结果： 与未转染的MCF-7/Adr细胞比较,pGenesil-siHuR质粒转染MCF-7/Adr细胞中 MDR1 mRNA的表达水平明显减低\[（0184±0.029） vs （1.203±0.026）,P<0.01\],P-gp表达水平明显降低。pGenesil-siHuR质粒转染MCF-7/Adr细胞后,MCF-7/Adr细胞对多柔比星的IC50从未转染的(148.2±2.3）nmol/L降至(42.9±0.4）nmol/L;经多柔比星处理后,pGenesil-siHuR质粒转染组MCF-7/Adr细胞的凋亡率明显上升\[（34.6±1.1）% vs （1.1±0.2）%,P<001\]。 结论： RNA干扰HuR的表达能抑制 MDR1基因 的表达,增加耐药乳腺癌MCF-7/Adr细胞对多柔比星的敏感性。     

MDR1小干扰RNA调节人脑多形性胶质母细胞瘤细胞系BT325的药物敏感性

背景与目的:胶质瘤的治疗一直是困扰着医学界的一大难题,在药物治疗过程中出现的多药耐药是化疗失败的重要原因。其中由MDR1基因编码的P-糖蛋白(P-glycoprotein,P-gp)是关键因素。本实验拟探讨MDR1小干扰RNA(smallinterferingRNA,siRNA)对人脑多形性胶质母细胞瘤耐药细胞BT325药物敏感性的调节作用。方法:以BT325细胞作为研究对象,设计3条67nt寡核苷酸序列并分为MDR1A组、MDR1B组和MDR1C组,经质粒扩增提取测序,转染于对数生长期的BT325细胞。嘌呤霉素筛选转染siRNA成功的细胞。RT-PCR检测转染前后MDR1mRNA水平。免疫组化和流式细胞仪分析P-gp的表达,对转染后的细胞进行药敏实验。结果:转染后的细胞呈指数倍生长。RT-PCR结果显示,转染MDR1siRNA后,BT325细胞MDRmRNA有不同程度的降低,其中MDR1A组、MDR1B组、MDR1C组分别为0.18±0.05、0.30±0.09和0.36±0.13,而对照组0.76±0.06(P<0.001)。流式细胞仪及免疫组化表明,正常细胞P-gp的表达率为85.73%,而转染组表达率下降至1.44%。药敏实验显示,阿霉素、长春新碱对转染MDR1siRNA的BT325细胞的IC50均有不同程度降低,且出现凋亡峰(P<0.05),MDR1A组、MDR1B组和MDR1C组G0/G1期细胞较正常组分别增加了13.55%、14.53%和1.46%(P<0.05)。结论:MDR1小干扰RNA可以在转录后水平对多药耐药进行调节,使MDR1基因表达下调,提高对药物的敏感性,诱导细胞凋亡。     

诺美孕酮逆转乳腺癌耐药细胞株多药耐药性的研究

目的 研究诺美孕酮（NOM）对乳腺癌耐药细胞株（MCF7／ADR）多药耐药性（MDR）的影响,探讨其调节机制。方法 应用MTT法,研究NOM对MCF7／ADR药物敏感性的影响。采用半定量逆转录聚合酶联反应（RT－PCR）和免疫细胞化学染色,分析耐药基因MDR1、谷胱甘肽S转移酶Pi(GSTπ）、拓扑异构酶Ⅱα（Topo Ⅱα)和多药耐药相关蛋白（MRP）表达的变化。通过流式细胞技术观察NOM对MCF7／ADR细胞内药物积累和细胞周期的影响。结果 NOM对MCF7／ADR的MDR具有明显的逆转作用,在20,10和5μmol/L浓度时的逆转倍数分别为21,12和8倍,逆转强度明显高于前身化合物甲地孕酮,而与维拉帕米相当。5μmol/L NOM处理MCF7／ADR后,MDRI的mRNA表达水平明显降低,呈现时间依赖性变化;P糖蛋白（P－gp)和GSTπ蛋白的变化符合相应mRNA表达的变化;MRP和Topo Ⅱα基因表达未见明显变化。用NOM 20,10和5μmol/L分别处理2h后,ADR在细胞内的积累分别增加到2．7倍、2．3倍和1．5倍。同时,NOM可明显加强ADR对MCF7／ADR细胞在G2M期的阻滞作用。结论 NOM具有较强的逆转MCF7／ADR细胞MDR的作用,其逆转机制为多种途径,包括时间依赖性下调MDRI和GSTπ基因的表达,增加细胞内药物积累,加强ADR对MCF7／ADR在G2M期的阻滞作用等。     

多药耐药相关蛋白反义RNA对耐阿霉素人小细胞肺癌细胞株GLC4/ADR耐药性的调节

目的 构建表达多药耐药相关蛋白（MRP）反义RNA的真核表达载体,转染耐药细胞株,初步探讨其影响多药耐药（MDR）的作用机理。方法 以MRPcDNA为模板,应用PCR扩增MRPmRNA5′端（含起始子密码）及MRP mNRA3′端（含终止子密码）片段,通过定向克隆方法,构建表达MRP反义RNA的两个重组载体。通过Lipofectamine将其导入小细胞肺癌（SCLC）耐阿霉素（ADR）的细胞株GLC4／ADR中,经G418筛选,得到分别含pcDNA3空载（MO）、MRP mRNA5′端为靶区的反义RNA（Ma),MRPmRNA3′端为靶区的反义RNA（Mb)的3个细胞克隆。检测细胞内ADR的蓄积改变以及荷瘤裸鼠对ADR的敏感性。结果 经RT－PCR检测,外源片段可获稳定表达。Ma细胞及Mb细胞中,MRP表达分别抑制约14．0％和83．0％,且胞内ADR蓄积量均有一定程度的增加;对ADR的耐药倍数与对照细胞MO相比,分别下降9．5％和28．4％。虽然,MRP反义RNA对细胞的生长、细胞周期及ADR诱导的早期凋亡均无明显影响,但可提高荷瘤裸鼠对ADR的敏感性。结论 MRP反义RNA能抑制MRP蛋白的表达,并使转染细胞内ADR浓度增加,从而逆转MRP介导的MDR。对于配合化疗,提高MRP高表达患者的疗效,具有潜在的应用意义。     

含MDR基因的人乳腺癌MCF 7/pZMDR多药耐药细胞株的构建

目的：肿瘤细胞的多药抗药性（ＭＤＲ）是化疗失败的主要原因之一，Ｐ－糖蛋白高表达是ＭＤＲ的主要机制，逆转ＭＤＲ成为肿瘤治疗亟待解决的问题。目前用于研究抗药性和筛选逆转抗药性药物的模型较少，本实验拟构建多药抗药性细胞株。方法：采用基因工程技术，重组ＭＤＲ１基因ｃＤＮＡ于逆转录病毒载体ｐＺＩＲ－ＮｅｏＳＶ（Ｘ）的克隆位点，并用脂染胺（ｌｉｐｏｆｅｃｔＡＭＩＮＥ）介导的ＤＮＡ转移技术，将其转入包装细胞ＰＡ３１７中，收集含病毒子的培养上清液感染对药物敏感的人乳癌细胞株ＭＣＦ－７，经筛选培养基筛选，ＰＣＲ、免疫组化及阿霉素在细胞内的分布等实验。结果：含ＭＤＲ基因的逆转录病毒载体ｐＺＭＤＲ的构建方法证明是正确的，ＭＤＲ１ｃＤＮＡ已整合在染色体基因组中并表达Ｐ－糖蛋白。结论：建立的ＭＣＦ－７／ｐＺＭＤＲ细胞为一特异表达Ｐ－糖蛋白的多药抗药性转基因细胞株     

靶向人胃癌SGC7901/VCR细胞多药耐药基因1小分子干扰RNA的有效序列筛选

目的筛选靶向人胃癌SGC7901/VCR细胞多药耐药基因1(MDR1)小分子干扰RNA(siRNA)的有效序列。方法设计并体外转录靶向MDR1的4条siRNA(MDR1si326、MDR1si1513、MDR1si2631和MDR1si3071),转染SGC7901/VCR细胞。用RT PCR检测MDR1mRNA表达,免疫印迹检测P糖蛋白(P gp)表达,流式细胞仪检测细胞内阿霉素(ADR)蓄积,四甲基偶氮唑蓝(MTT)法检测细胞对ADR的敏感性。结果4条siRNA均能不同程度逆转SGC7901/VCR细胞MDR1介导的多药耐药。转染后48h,MDR1si326组和MDR1si2631组的mRNA表达水平分别为0.42±0.07和0.49±0.02,较MDR1si1513或MDR1si3071组明显下降(P<0.05);MDR1si326组细胞内ADR蓄积最显著,中位数为30.03,MDR1si2631组次之,MDR1si3071组较少,MDR1si1513组最少(P<0.05);MDR1si2631组对ADR耐药的相对逆转率最高,为(98.12±0.26)%,MDR1si326组次之(P<0.05),MDR1si1513组和MDR1si3071组的差别不大(P>0.05)。转染后72h,MDR1si326组蛋白质表达水平下降最明显。结论MDR1si326对人胃癌SGC7901/VCR细胞MDR1介导的耐药逆转效果最好,MDR1si2631次之,MDR1si3071较差,MDR1si1513最差。     

RNA干扰对乳腺癌MCF-7细胞株WT 1基因表达的抑制作用

目的：为探索治疗乳腺癌新途径，研究RNA干扰（RNA interferance，RNAi）对MCF-7细胞株WT 1基因表达的抑制作用。方法：设计制备多对针对WT 1基因的小干扰RNA（small interfering RNA，siRNA），转染MCF-7细胞，采用实时定量PCR（real—time quantitative polymerase chainreaction，RQ-PCR）法测定WT1 mRNA的表达，western blot测定WT1蛋白的表达，流式细胞仪检测加入长春新碱后的MCF-7细胞凋亡率。结果：siRNA能有效抑制WT1基因的表达，但不呈剂量关系，在较低浓度可维持RNAi至少4d时间，WT1基因表达下调的MCF-7细胞凋亡率增加。结论：RNAi能有效抑制MCF-7细胞中WT1基因的表达，同时转染siRNA后细胞对长春新碱敏感。     

粉防己碱对人口腔上皮癌多药耐药KB-MRP1细胞株多药耐药性的逆转作用

背景与目的:粉防己碱(tetrandrine,Tet)是从中草药粉防已的根块中提取的双苄基异喹啉生物碱,具有逆转P-糖蛋白(P-glycoprotein,P-gp)介导的肿瘤多药耐药(multidrug resistance,MDR)作用.本研究探讨粉防己碱对人口腔上皮癌多药耐药细胞株KB-MRP1耐药的逆转作用及其可能的机制.方法:采用MTT法检测不同浓度粉防己碱对KB-3-1细胞和KB-MRP1细胞的增殖抑制效应;MTT法检测顺铂(cisplatin,DDP)、长春新碱(vincristine,VCR)、阿霉素(adriamycin,ADM)、依托泊苷(etoposide,VP-16)对KB-3-1、KB-MRP1细胞增殖的抑制作用及加用粉防己碱时的变化;采用流式细胞仪检测细胞内ADM蓄积程度以及细胞凋亡.结果:1.5μg/ml及更低浓度的粉防己碱对KB-3-1和KB-MRP1细胞无明显细胞毒性作用.KB-MRP1对VCR、ADM、VP-16和DDP的耐药倍数分别为21.23、38.39、12.47和1.31.加入1 μg/ml粉防己碱后,KB-MRP1对VCR、ADM、VP-16的耐药逆转倍数分别为4.96、5.85和4.27倍.加入1.5 μg/ml粉防己碱后,KB-MRP1对上述化疗药物的敏感程度提高更明显.1.5 μg/ml浓度的粉防己碱可明显提高ADM在KB-MRP1细胞内的蓄积,增强VCR诱导的KB-MRP1细胞凋亡.结论:粉防己碱可以逆转KB-MRP1细胞的多药耐药,逆转效果与药物浓度有关,逆转机制可能与增加细胞内化疗药物蓄积和增强化疗药物诱导的细胞凋亡有关.