稀土元素镧对丹参活性物质积累及其合成途径中酶基因表达的影响

该文研究了镧对丹参毛状根中活性物质积累及其合成途径中酶基因表达的影响,为揭示土壤因子镧影响丹参药材品质形成的环境机制奠定基础。采用HPLC测定丹参毛状根中活性物质含量;采用Tiangen多糖多酚植物总RNA提取试剂盒提取RNA,采用Takara反转录试剂盒合成c DNA,采用PCR荧光定量试剂盒进行实时定量分析,采用SPSS软件进行数据分析。结果显示镧处理对丹参毛状根内丹参酮类和酚酸类的积累表现出显著的促进效应,处理后9 d其酚酸类成分含量达到峰值,丹参酮类成分含量随处理时间的延长而增加(15 d内);镧处理后丹参体内活性物质积累的峰值时间相对滞后于酶基因表达的峰值时期,FPPS,TAT,HPPR 3个酶基因与丹参酮ⅡA、迷迭香酸和丹酚酸B含量变化趋势相似,暗示FPPS,TAT,HPPR 3个酶基因在镧诱导的丹参活性物质积累中发挥重要作用。     

诱导子对丹参毛状根酚酸类和丹参酮类成分积累的影响

目的:考察生物诱导子真菌菌丝提取物和非生物诱导子茉莉酸甲酯及二者协同作用对丹参毛状根酚酸类和丹参酮类成分积累的综合性影响.方法:在继代培养21 d的丹参毛状根中添加不同的诱导子及诱导子组合,分别测定不同收获期毛状根的生长量和两大类成分的积累量.结果:3种处理均显著抑制了丹参毛状根的生长,促进了隐丹参酮和二氢丹参酮Ⅰ的积累,但对酚酸类成分的积累却有不同的作用,茉莉酸甲酯可以促进酚酸类成分的积累,真菌诱导子在一定程度上抑制了酚酸类成分的积累.结论:真菌诱导子和茉莉酸甲酯以及二者协同作用对丹参毛状根不同成分的积累具有不同的影响,3种处理条件下水溶性成分的积累和脂溶性成分的积累基本不存在关联性.     

基于茉莉酸甲酯诱导的丹参毛状根酚酸类成分次生代谢机制研究

目的:研究外源茉莉酸甲酯诱导后丹参毛状根中酚酸类有效成分形成的次生代谢分子机制.方法:用茉莉酸甲酯(MJ,100μmol·L-1)对丹参毛状根进行诱导实验,分别在0,6,12,24,36h收获材料,运用实时定量PCR对丹参中迷迭香酸次生代谢途径上的关键酶基因的mRNA表达水平进行检测.同时,采用LC-MS测定各个时间点毛状根材料中迷迭香酸(RA)、丹酚酸B(LAB)及咖啡酸(CA)的含量.结果与结论:外源性信号分子MJ作用于丹参毛状根,酚酸类成分迅速积累,表现为CA,RA均在诱导后24h达到最大值,LAB的含量36h后达到最高.其诱导机制可能与不同程度的激活RA合成中苯丙氨酸途径上关键酶基因PAL,4CL,C4H与酪氨酸途径中TAT,HPPR基因的表达有关,基因表达在时间呈现先后性,其中,4CL与PAL的贡献度较大.这为今后更深一步的研究丹参水溶性酚酸类成分的次生代谢途径机制提供了依据.     

稀土元素镧与丹参毛状根中活性成分及其生物合成中关键酶的量效关系

目的:研究稀土元素镧与丹参毛状根中活性物质及其生物合成中关键酶基因表达的量效关系,结合Hormesis效应理论探讨镧调控丹参次生代谢产物的阈值,以期为丹参中次生代谢产物调控及镧肥的开发提供依据。方法:采用HPLC法测定丹参毛状根活性成分含量,采用TIANGEN多糖多酚植物总RNA提取试剂盒提取RNA,采用Takara反转录试剂盒合成cDNA,采用PCR荧光定量试剂盒进行实时定量检测,采用SPSS软件进行数据分析。结果:镧处理对丹参活性成分积累及关键酶基因表达量影响显著,丹参酮Ⅰ、丹参酮ⅡA、迷迭香酸和丹酚酸B表现出低浓度促进高浓度抑制的"抛物线"趋势;AACT、C4H、4CL、TAT和HPPR五个关键酶基因表达量同样表现出低促高抑的"抛物线"趋势,该趋势符合Hormesis理论曲线。结论:根据Hormesis理论分析,镧对丹参的促进浓度阈值上限在0.1~1.0 mmol·L~(-1)之间。     

白花丹参毛状根诱导体系的建立与其内生真菌提高毛状根中丹酚酸含量的研究

目的建立白花丹参毛状根诱导体系及检测其丹酚酸的合成,研究内生真菌对毛状根中丹酚酸生物合成的影响。方法通过发根农杆菌ACCC10060浸染白花丹参叶片,成功诱导出毛状根,毛状根在6,7-V液体培养基中扩大培养60d,并测定毛状根中丹酚酸的含量。白花丹参毛状根在6,7-V培养基中培养12 d后,添加从白花丹参分离的不同浓度的内生真菌诱导子,测定毛状根丹酚酸含量。结果发根农杆菌ACCC10060能够成功从白花丹参叶片诱导出毛状根,毛状根培养40 d和50 d时丹酚酸B和丹参素的最高产量可达9.38mg·g-1DW和1.281 mg·g-1DW。60(μg glc equ).ml-1内生真菌诱导子是促进丹酚酸合成的最佳浓度,内生真菌处理后30 d后,丹酚酸B和丹参素的产量分别增加1.55和2.68倍。结论白花丹参毛状根诱导培养可以做为一种生产丹酚酸的有效途径,60(μg glc equ)·ml-1内生真菌诱导子可以显著提高毛状根中丹酚酸含量。     

活性氧在密旋链霉菌Act12诱导丹参毛状根中丹参酮积累中的作用

作者前期研究成果显示密旋链霉菌Act12可以上调丹参酮生物合成途径上的关键酶基因的表达大幅提高丹参毛状根中丹参酮含量。该实验则进一步研究了活性氧在Act12诱导丹参毛状根中丹参酮积累的作用。在继代培养21 d的丹参毛状根中添加Act12不同的诱导子及诱导子组合,分别测定不同收获期毛状根的生物量,毛状根中活性氧积累量,丹参酮类成分的积累量和关键酶基因表达量。Act12诱导后丹参毛状根中活性氧含量上升,HMGR和DXR基因表达上调,最高分别达到对照的32.4,4.8倍,毛状根中丹参酮积累增加,最高达到对照的10.2倍;加入活性氧抑制剂CAT和SOD后,丹参毛状根中的活性氧含量较Act12处理显著下降,HMGR和DXR基因表达也明显下降,毛状根中丹参酮含量较Act12处理下降了74.6%。活性氧介导了Act12诱导丹参酮积累,Act12很可能是通过ROS信号通路激活了MVA和MEP途径,从而提高了丹参酮在毛状根中的含量。     

茉莉酸参与介导镧诱导丹参毛状根活性物质的积累

目的:验证氯化镧诱导丹参毛状根活性物质积累的信号分子。方法:采用HPLC法测定丹参毛状根中活性物质含量;采用"loss and gain"策略对信号分子进行验证。结果:茉莉酸甲酯对镧的响应规律与丹参毛状根中活性物质对镧元素响应规律相符且对丹参毛状根活性物质积累起促进作用;经茉莉酸甲酯淬灭剂和抑制剂处理验证发现,抑制剂和淬灭剂对丹参毛状根中活性物质积累起抑制作用,而抑制剂与氯化镧同时处理能逆转抑制剂对活性物质的抑制作用。结论:茉莉酸甲酯是氯化镧诱导丹参毛状根活性物质积累的信号分子,但不是唯一的信号分子。     

赤霉素及其合成抑制剂对丹参酮类活性物质含量的影响

目的研究赤霉素及其合成抑制剂对丹参毛状根中丹参酮类活性物质含量的影响.方法分别将不同浓度的赤霉素和多效唑加入到丹参毛状根的液体培养基中,培养25 d后对毛状根中的隐丹参酮、丹参酮Ⅰ和丹参酮Ⅱ.含量进行测定.结果赤霉素可以促进丹参毛状根中丹参酮类活性物质的积累,而多效唑则抑制了它们的积累.结论推测多效唑是丹参毛状根中丹参酮ⅡA等化合物的合成抑制剂,且赤霉素可以作为一种有效的丹参酮类活性成分的诱导子.     

不同氮源对丹参和藏丹参毛状根有效成分积累的影响

目的氮素是中药材有效成分积累的重要影响元素,为探讨不同氮源对丹参Salviamiltiorrhiza和藏丹参Salvia castanea毛状根生长和活性成分积累的影响。方法分别采用硝酸铵、水解乳蛋白、蛋白胨、牛肉浸膏、酪蛋白和酵母提取物6种氮源处理对丹参和藏丹参毛状根的影响,分析毛状根生长及活性成分积累的变化。结果硝酸铵最有利于2种丹参毛状根的生长。水解乳蛋白能够显著促进丹酚酸类成分的积累,与硝酸铵对照相比,丹参迷迭香酸和丹酚酸B含量分别提高了2.94倍和3.27倍,藏丹参二者含量分别提高了13.74倍和2.01倍。酵母提取物对2种丹参毛状根二氢丹参酮Ι和隐丹参酮积累的促进效果最为显著,水解乳蛋白能显著促进丹参根中丹参酮IIA的积累,牛肉浸膏则对藏丹参中丹参酮IIA积累的促进作用最为显著。结论硝酸铵是2种丹参毛状根生长的最佳氮源,水解乳蛋白是丹酚酸积累的最佳氮源,不同氮源对4种丹参酮的影响不一致,丹参和藏丹参对不同氮源的响应也不一致。该研究不仅对丹参毛状根规模化培养及活性成分工业化生产具有一定指导意义,也对藏丹参资源的开发利用提供了借鉴作用。     

胞内、外Ca2+在水杨酸诱导丹参幼苗迷迭香酸生物合成过程中的作用

目的: 为探讨胞内、外钙离子是否在水杨酸诱导丹参迷迭香酸生物合成中起作用。 方法: 以生长50 d的丹参幼苗为材料,通过喷施水杨酸诱导迷迭香酸合成量增加,再利用胞外钙通道抑制剂verapamil(Vp)和LaCl₃、胞内钙调素拮抗剂trifluoperazine (TFP)和胞内钙通道上IP₃受体抑制剂LiCl处理,分别考察水杨酸、钙离子通道抑制剂/钙调素拮抗剂处理后迷迭香酸的合成量及其合成相关酶(PAL,TAT)的活性变化。 结果: 2.0 mmol·L^-1的水杨酸处理24 h后可诱导迷迭香酸合成量升高到(40.51±2.16) mg·g^-1,是对照的1.97倍,迷迭香酸合成相关酶PAL活性升高到对照的1.42倍,TAT活性升高到对照的1.29倍;Vp,LaCl₃,TFP,LiCl处理均抑制了水杨酸诱导的PAL,TAT活性的升高,从而导致了迷迭香酸合成量降低。 结论: 水杨酸诱导丹参迷迭香酸生物合成过程中,胞内、外钙离子发挥着重要的信号转导作用。     

不同光质对丹参生长及有效成分积累和 相关酶活性的影响

目的:以丹参幼苗为材料,研究不同光质(白光,蓝光,红光)对其生长,有效成分积累和相关酶活性的影响.方法:不同光质处理丹参幼苗,测定相关指标,结合方差统计方法进行分析比较.结果:丹参生长及有效成分积累受不同光色影响显著,与同等PAR的白光相比较,增加蓝光(WB)处理使植株株高显著降低;增加红光(WR)处理使丹参根长、根直径、根鲜重和干重分别显著增加.丹酚酸B含量在补充蓝光与补充红光后均显著提高,而丹参酮ⅡA含量未受补充光质显著影响;蓝光处理下氧化物歧化酶(SOD)、过氧化物酶(POD)、苯丙氨酸解氨酶(PAL)、酪氨酸氨基转移酶(TAT)和多酚氧化酶(PPO)活性显著提高;红光处理下过氧化物酶(POD)、酪氨酸氨基转移酶(TAT)和多酚氧化酶(PPO)活性显著提高.同时实验证明,种子直播幼苗比根栽苗对光色反应敏感.结论:补充红光能够显著促进丹参根系的生长,其有效成分丹酚酸B含量在补充蓝光与补充红光后显著提高,补充蓝光与补充红光能够显著提高丹参TAT和PPO活性.     

丹参转基因毛状根离体培养体系的建立及分析

目的:建立起丹参的转基因毛状根诱导及离体培养体系。方法:考察了不同外植体、不同农杆菌侵染时间和共培养时间诱导丹参毛状根的效率,共培养外植体用400 g.L-1Cef水除菌5 min,接种在MS+400 g.L-1Cef+2.5 g.L-1Hyg的固体培养基上,完全除菌后转接入6,7-V+2.5 g.L-1Hyg液体培养基继代培养,GFP荧光检测阳性毛状根,PCR检测农杆菌特征基因rolC,并测定不同生长时期的毛状根干重和二氢丹参酮I的积累。结果:用丹参叶片基部诱导毛状根,成功率可达到93.3%;农杆菌侵染10 min诱导效率最高为63.3%;共培养2～3 d诱导效果最好;PCR结合GFP荧光检测的方法鉴定阳性转基因材料具有较高的可信性;丹参毛状根生物量变化与次生代谢物积累之间有着紧密联系。结论:成功建立起丹参转基因毛状根离体培养体系,为进一步的基因工程应用打下基础。     

茉莉酸甲酯对丹参毛状根中水溶性酚酸类化合物积累的影响

 目的 研究茉莉酸甲酯（methyl jasmonate,MJ）对丹参毛状根生长和其中丹参素、迷迭香酸、丹酚酸B 3种化合物含量的影响。方法 以MJ浓度和添加时间为2个影响因素,设计5个水平的正交实验,观察不同MJ浓度和添加时间对丹参毛状根生长和丹参素、迷迭香酸、丹酚酸B 3种化合物含量的影响。结果 MJ的加入对丹参毛状根生长有一定抑制作用,并能显著改变丹参素、迷迭香酸、丹酚酸B的含量。在接种第15天添加浓度为300 μmol·L-1MJ、共培养15 d的毛状根中丹参素含量达（0.510±0.054）%,约为对照样品（0.179±0.02)%的2.85倍;接种第20天加入浓度为300 μmol·L-1MJ、共培养10 d的毛状根中迷迭香酸的含量达（14.358±0.710）%,约为对照样品（7.021±0.403）%的2倍;接种0天时添加200 μmol·L-1 MJ、共培养30 d的丹参毛状根中丹酚酸B的含量高达（1.592±0.120）%,约为对照样品（0.189±0.05）%的8.42倍。结论 茉莉酸甲酯能明显改变丹参素、迷迭香酸、丹酚酸B在丹参毛状根中的积累,并且随MJ浓度和添加时间的改变呈现一定规律性,这对丹酚酸类化合物在植物体内生物合成途经的研究有一定借鉴意义。     

丹参毛状根的诱导及培养条件的优化

为了建立丹参毛状根的诱导方法及液体培养体系,以发根农杆菌A4,LBA9402,15834为试验菌株分别侵染丹参无菌苗叶片,诱导丹参毛状根,PCR扩增筛选阳性株系,HPLC测定丹酚酸含量并在此基础上进一步优化毛状根的液体培养条件。结果显示：3种发根农杆菌A4,LBA9402,15834均诱导出丹参毛状根,经PCR鉴定证明其Ri质粒T-DNA均已整合到丹参基因组中,其中发根农杆菌LBA9402和A4诱导的丹参毛状根丹酚酸含量较高,质量分数分别为（3.27±0.37）%,（3.17±0.20）%;由发根农杆菌LBA9402诱导MSOH液体培养基培养的丹参毛状根丹酚酸含量较高,质量分数为（4.56±0.36）%;由发根农杆菌LBA9402诱导,pH为4.81的MSOH液体培养基培养的丹参毛状根丹酚酸含量最高可达4.85%。因此,以发根农杆菌LBA9402和A4诱导的丹参毛状根在pH为4.81的MSOH液体培养基中培养的丹酚酸含量较高。为进一步利用基因工程技术改良中药丹参的品质奠定了基础。