RNA干涉脑胶质瘤MSP58基因后肿瘤转移相关基因的表达变化

目的采用基因芯片技术,观察RNA干涉法抑制人脑胶质瘤细胞系U251细胞MSP58基因表达后肿瘤转移相关基因的变化,从而了解MSP58在肿瘤转移相关基因通路中的可能定位。方法将特异性的MSP58干涉表达载体pSilencer3．1-MSP58转染人脑胶质瘤细胞系U251,同时构建相应的阴性对照载体pSilencer3．1-NC以及空载体pSilencer3．1-H1 neo。运用半定量RT-PCR及Western blot的方法检测稳定转染和未转染干涉载体的胶质瘤细胞MSP58的mRNA和蛋白的表达水平。运用基因芯片技术分析pSilencer3．1-MSP58转染后肿瘤转移相关基因表达的变化。结果成功建立了具有稳定下调MSP58基因表达的U251-S细胞、阴性对照U251-NC细胞以及含有空载体的U251-H1 neo细胞。干涉组细胞的MSP58的表达无论在mRNA水平还是在蛋白水平均较阴性对照组及空载体组细胞显著降低。基因芯片技术共筛选肿瘤转移相关基因128个,其中上调2倍以上的共有34个基因。结论干涉MSP58基因表达后,胶质瘤细胞增殖、迁移和侵袭能力的下降与肿瘤转移相关基因表达的变化有关。     

MSP58基因RNA干涉后对人脑胶质瘤细胞裸鼠移植瘤的影响

目的观察RNA干涉法（RNA interference,RNAi）抑制人脑胶质瘤U251细胞的MSP58基因表达后,对其在裸鼠体内成瘤性及增殖、侵袭性的影响。方法将特异性的MSP58干涉表达载体pSilencer3．1．MSP58转染人脑胶质瘤细胞系U251（U251．S）,同时构建相应的阴性对照组U251-NC,以及空载体组U251-H1neo。运用逆转录酶-多聚酶链反应（RT—PCR）及蛋白质印迹法（Westernblot）检测各组细胞的MSP58mRNA和蛋白表达水平。用各组U251细胞建立人脑胶质瘤裸鼠皮下移植瘤模型。结果成功建立了具有稳定下调MSP58基因表达的U251-S细胞。U251-S细胞MSP58的表达无论在mRNA水平还是在蛋白质水平均较U251组、U251-H1neo组及U251-NC组细胞显著降低（P〈0．01）。与接种U251、U251-H1neo和U251-NC细胞的裸鼠相比,接种U251-S细胞的裸鼠肿瘤形成时间延迟,肿瘤生长缓慢,肿瘤体积及瘤重均明显减小（P〈0．01）。结论MSP58基因RNAi后抑制了移植瘤细胞MSP58mRNA及蛋白的表达,进而明显抑制移植瘤的增殖和侵袭能力。     

稳定整合靶向性Survivin基因RNA干涉载体胶质瘤细胞系的建立

目的构建针对细胞凋亡抑制蛋白survivin（SVV）基因的特异性RNA干涉载体,并建立稳定转染该干涉载体的人胶质瘤细胞系。方法设计合成针对SVV基因和针对荧火虫荧光素酶（FLF）基因特异性RNA干涉片断,并分别克隆入pSilencer3．1-H1neo载体中,成功构建SVV基因RNA干涉载体pSilencer3．1-SVV和无关序列载体pSilencer3．1-FLF。RNA干涉载体、无关序列载体和空白载体经脂质体法转染胶质瘤细胞系U251,经G418筛选,采用实时定量反转录聚合酶链反应（real—timeRT—PCR）、免疫蛋白印迹（Western blot）和免疫细胞化学方法分别检测SVV基因在转染细胞中的表达情况。结果酶切鉴定和核苷酸序列分析证实,成功构建了SVV基因RNA干涉载体pSilencer3．1-SVV。获得了稳定转染干涉载体、无关序列载体和空白载体的细胞系分别命名为U251-S、U251-F和U251-P。U251-S细胞中SVV的mRNA和蛋白表达受到明显抑制,U251-F和U251-P细胞中SVV基因表达水平无明显变化。结论SVV基因特异性RNA干涉载体能够明显抑制SVV基因在U251细胞中的表达,这为进一步研究SVV在胶质瘤细胞系U251中的生物学功能和作用机制奠定了实验基础。     

锌指蛋白A20 RNAi载体的构建及筛选

目的我们前期的实验结果显示A20 mRNA和蛋白在人脑胶质瘤组织及细胞系（U251、U87、BT325）中高表达，本研究拟构建A20RNAi载体，并检测其对U251细胞A20表达的抑制作用。方法构建三种针对人A20基因的真核干涉表达载体，以脂质体法将其分别转染人脑胶质瘤细胞系U251，以RT-PCR、蛋白印迹法检测各干涉载体对U251细胞中A20mRNA和蛋白表达的抑制作用。结果成功构建三种针对A20基因的RNAi载体，经RT-PCR、蛋白印迹检测筛选出对A20基因干涉效果最佳的载体，命名为pSilencer3．1-A20R1。结论成功构建A20基因干涉载体，为进一步探讨A20与脑胶质瘤恶性增殖、血管形成以及抗凋亡的关系奠定实验基础。     

Evi1基因对胶质瘤细胞株U87/U251增殖、侵袭的影响

目的探讨Evi1基因在不同级别胶质瘤组织中的表达,以及调控该基因对胶质瘤细胞株U87和U251细胞增殖、细胞周期和侵袭影响,为靶向癌基因治疗胶质瘤提供客观依据。方法首先通过实时定量PCR(qRT-PCR)分别检测人脑不同级别胶质瘤组织以及U87和U251细胞株中Evil基因的表达水平。用合成的小分子干扰RNA(small interfering RNA,siRNA)干扰下调U87和U251细胞Evi1基因表达作为干扰组,同时设空白和阴性对照组。qRT-PCR检测转染前后Evi1基因在U87和U251细胞中的表达和转染效率。CCK-8法检测实验组细胞的增殖能力,流式细胞仪分析Flow Cytometer(FCM)其细胞周期。Transwell以及划痕试验检测各组U87和U251的侵袭和迁移能力。以及用qRT-PCR分析下调Evi1基因后U87和U251细胞基质金属蛋白酶2(MMP2)的表达水平。结果 Evi1基因在胶质瘤组织中呈现高表达,且随着胶质瘤级别程度增加其表达水平亦上升,其中Ⅲ和Ⅳ级的胶质瘤组织以及U87、U251细胞Evi1基因表达明显高于非瘤脑组织(均P0.05)。通过siRNA下调Evi1基因后,胶质瘤细胞株U87和U251的增殖减缓(均P0.05),其侵袭和迁移能力明显下降(均P0.01),并能阻滞其细胞周期G1期(P0.05)。干扰组U87和U251细胞MMP2表达水平明显降低(均P0.01)。结论 Evi1基因在胶质瘤中呈高表达,干扰U87和U251细胞Evi1基因可抑制胶质瘤的增殖和侵袭。     

稳定整合靶向性14—3—3ζ基因RNA干涉载体的胶质瘤细胞系建立

目的构建针对细胞凋亡抑制蛋白14-3-3ζ基因的特异性RNA干涉载体,并建立稳定转染该干涉载体的人胶质瘤细胞系。方法根据14-3-3ζ编码序列,设计并合成针对14-3-3ζ基因的特异性RNA干涉片断,并将其克隆入pSilencer3．1．H1neo干涉载体中,构建14-3-3ζ基因shRNA真核表达载体pSilencer-14-3-3ζ。重组载体pSilencer-14-3-3ζ和pSilencer3．1-Hlneo阴性对照载体pSilencer3．1-HlneoNegative经脂质体LipofectamineTM2000介导法转染胶质瘤细胞株U251;转染细胞经过G418筛选,采用Westernblot方法分别在蛋白水平检测、筛选G418抗性的克隆细胞。结果酶切鉴定和核苷酸序列分析证实,成功构建了14-3-3ζ基因shRNA真核表达载体pSilencer-14-3-3ζ,经酶切、测序鉴定证实克隆正确。获得了稳定转染pSilencer-14-3-3ζ载体的胶质瘤细胞株。结论14-3-3ζ基因特异性RNA干涉载体能够显著抑制14-3-3ζ基因在U251细胞中的表达,这为进一步研究14-3-3ζ在胶质瘤细胞系U251中的生物学功能和作用机制奠定了实验基础。     

新型超微载体FA-PAMAM介导hTERT-siRNA对人脑胶质瘤细胞系U251抑制作用的体外研究

目的 探讨由叶酸(FA)修饰的聚酰胺-胺型高聚物(PAMAM)制成的新型超微载体FA-PAMAM介导人端粒酶催化亚基(Htert)-siRNA对人脑胶质瘤细胞系U251的抑制作用.方法 人脑胶质瘤细胞系U251被分为FA-PAMAM/Htert-siRNA转染组(干涉组)、FA-PAMAM空载对照组(空载对照组)和空白对照组.利用FA-PAMAM介导Htert-siRNA体外转染胶质瘤细胞系U251,流式细胞仪检测各组细胞转染效率、细胞增殖活性、Htert Mrna表达水平、端粒酶活性以及细胞凋亡率.结果 FA-PAMAM在体外能够有效地将Htert-siRNA转染导入胶质瘤细胞系U251,转染效率为67.36%;干涉组细胞存活率随转染时间的延长而逐渐降低,以转染后48 h最低,仅为(68.97±1.19)%,与同一时限空载对照组比较,差异有统计学意义(P=0.000);转染后72h,干涉组Htert Mrna表达水平较空载对照组和空白对照组下调57%,差异有统计学意义(均P=0.000);转染后72h,干涉组端粒酶活性为(52.57±5.34)TPG,与空载对照组和空白对照组比较明显下调,差异有统计学意义(均P=0.000);转染72h后,干涉组细胞凋亡率为(29.63±2.91)%,高于空载对照组和空白对照组,差异有统计学意义(均P=0.000),肿瘤细胞生长明显受到抑制.结论 FA-PAMAM作为一种新型超微载体可于体外有效转染Htert-siRNA,具有高效、低细胞毒性之优点;Htert-siRNA可作为胶质瘤基因治疗的靶点.     

FOXC2过表达通过激活Wnt/β-catenin信号通路促进胶质瘤U87细胞增殖、迁移

目的 探讨FOXC2过表达对胶质瘤U87细胞增殖、侵袭、迁移的影响及其机制.方法 体外培养人脑胶质瘤U87细胞和人脑胶质细胞HEB.U87细胞随机分为空白组(未转染任何质粒)、空载体组(转染pcDNA3.1空载体质粒)、FOXC2过表达组(转染pcDNA3.1-FOXC2过表达质粒)、FOXC2+抑制剂组[转染pcDN...     

MSP58基因小干扰RNA对胶质瘤细胞系U251增殖的影响

目的观察核微球蛋白58（MSP58）基因特异性siRNA（small interfering RNA）对神经胶质瘤U251细胞的体外增殖的影响。方法体外化学合成针对MSP58基因的siRNA,脂质体法转染神经胶质瘤细胞系U251,荧光显微镜观察转染效率,逆转录酶-多聚酶链反应（RT-PCR）和Western blot分别检测MSP58基因的mRNA和蛋白表达水平,甲基噻唑基四唑法（MTT法）绘制细胞生长曲线,流式细胞仪（FCM）分析细胞周期。结果MSP58基因的特异性siRNA转染U251细胞后,MSP58的mRNA和蛋白表达水平明显降低,细胞增殖受到明显抑制;流式细胞仪检测显示转染后的U251细胞G2/M期细胞明显减少（P〈0.01）,S期细胞略有减少,G1期细胞明显增加（P〈0.01）,G1期发生明显阻滞。结论MSP58基因的特异性siRNA可明显抑制神经胶质瘤细胞U251的增殖,并引起G1期细胞阻滞。     

RNAi沉默Gli1基因对人胶质瘤细胞U251增殖与凋亡的影响

目的 研究RNA干扰技术(RNAi)沉默Hedgehog(Hh)信号转导途径中核心转录因子Gli1基因表达后对U251细胞增殖与凋亡以及下游因子Bcl-2、Bax、cycin D1表达的影响。 方法 合成、转染4对针对Gli1 mRNA不同位点序列的siRNA (58、59、60、61)至人胶质瘤U251细胞,RT-PCR检测细胞Gli1 mRNA的表达,筛选最有效抑制Gli1 mRNA表达的siRNA干扰片段(siRNA-Gli1);RT-PCR、Western blotting分别检测转染SiRNA-Gli后不同时间U251细胞Gli1mRNA和蛋白的表达,确定转染干扰的时间规律;实验分为3组：siRNA-Gli1组（转染筛选后siRNA-Gli1片断）、siRNA-NC组（转染阴性对照siRNA片断）、siRNA-N组（空白对照）。RT-PCR、Western blotting分别检测各组转染48 h后U251细胞cyclin D1、Bcl-2及Bax mRN和蛋白的表达,MTT、流式细胞术分别检测细胞增殖、凋亡及细胞周期的变化。 结果 干扰片断58、59、60、61、NC的转染效率均达69.2％;RT-PCR检测显示转染后48 h U251-60细胞无明显Gli1 mRNA表达,选择60作为最佳干扰片段siRNA-Gli1转染U251细胞,48h时无明显Gli1 mRNA和蛋白表达,确定48 h为转染干扰的最佳时间;转染48 h后与siRNA-N和siRNA-NC组相比,siRNA-Gli1组U251细胞Bcl-2、cyclin D1 mRNA和蛋白表达下调、Bax mRNA和蛋白上调,差异均有统计学意义(P＜0.05)。MTT检测显示24、48和72 h时siRNA-Gli1组细胞增殖抑制率均明显高于siRNA-NC和siRNA-N组,差异均有统计学意义(P＜0.05)。流式细胞术结果显示siRNA-Gli1组细胞凋亡率高于siRNA-NC和siRNA-N组,差异有统计学意义(P＜0.05),且siRNA-Gli1组G1/G0期细胞比例增加,S期细胞明显减少。 结论 针对Gli1基因设计合成的siRNA-Gli1能明显抑制人胶质瘤U251细胞生长并能诱导其凋亡,其机制可能与下调cyclin D1、Bcl-2的表达,上调Bax的表达有关。     

锌指蛋白403对人U251胶质瘤细胞增殖、侵袭和迁移的影响

目的研究锌指蛋白403(gametogenetin-binding protein 2,GGNBP2)表达水平对人胶质瘤细胞增殖,侵袭,迁移能力的影响。方法培养人U251胶质瘤细胞,慢病毒转染构建稳定过表达GGNBP2的U251胶质瘤细胞后,q RT-PCR及Western Blot检测转染效率;CCK8检测细胞细胞增殖能力;Transwell小室法检U251胶质瘤细胞侵袭和迁移能力变化;Western Blot检测AKT,p-AKT,PCNA,MMP9表达水平的改变。结果成功构建稳定过表达GGNBP2的人U251胶质瘤细胞株,与对照组和空载组比较,过表达组细胞增殖(P0.05),侵袭力(57±6 vs.203±6,205±7,F=512.4,P0.05),迁移力(74±7 vs.254±14,248±13,F=242.5,P0.05)明显抑制;Western Blot结果显示,与对照组和空载组比较,过表达组p-AKT(F=45.4,P0.05),PCNA(F=348.5,P0.05),MMP9(F=88.7,P0.05)表达水平明显降低。结论 GGNBP2可能通过抑制AKT的磷酸化水平,并经过相应的信号通路下调PCNA,MMP9表达水平,从而抑制胶质瘤细胞增殖,侵袭和迁移,提示GGNBP2可能成为胶质瘤治疗的潜在靶点。     

白藜芦醇通过下调CD44表达抑制胶质瘤U251细胞增殖和侵袭

目的 探讨白藜芦醇对脑胶质瘤细胞增殖和侵袭的影响及可能的分子调控机制。方法 体外培养胶质瘤U251细胞,分别用浓度为0μmol/L、50μmol/L、100μmol/L、150μmol/L白藜芦醇继续培养48 h,参考Lipofectamine2000TM说明书将pcDNA3.1/CD44(CD44过表达)、pcDNA3.1（过表达对照）等质粒转染胶质瘤U251细胞并培养24 h进行后续实验。利用CCK-8法检测细胞增殖,利用Transwell实验检测细胞侵袭;RT-PCR和免疫印迹法检测细胞CD44、CyclinD1、CDK4、MMP2和MMP9的mRNA和蛋白表达。结果 白藜芦醇明显抑制U251细胞的增殖和侵袭能力（P<0.05）,而且呈浓度依赖性（P<0.05）;所以,用150μmol/L白藜芦醇进行CD44干预实验。白藜芦醇明显抑制U251细胞CD44、CyclinD1、CDK4、MMP2和MMP9的mRNA和蛋白表达（P<0.05）,而且呈浓度依赖性（P<0.05）。CD44过表达明显抑制白藜芦醇对胶质瘤U251细胞增殖和侵袭的抑制作用（P<0....     

FAK siRNA重组质粒的构建及其对胶质瘤U251细胞 增殖及侵袭能力的抑制作用

目的 探讨应用RNA干扰技术沉默黏着斑激酶（FAK）基因表达对人脑胶质瘤U251细胞增殖和侵袭能力的影响。方法 将构建成功的FAK siRNA重组质粒转染至U251细胞,合成与FAK基因序列无关的siRNA作为阴性对照,以野生型U251细胞作为空白对照组。运用PCR和免疫印迹法观察FAK mRNA和蛋白表达情况,实时细胞分析仪检测观察细胞增殖情况,Transwell小室侵袭模型研究细胞侵袭能力。结果 重组质粒pBSilence1.1-FAK构建成功;与空白对照组和阴性对照组相比,干扰组细胞增殖减慢（P <0.05）;Transwell小室体外侵袭结果 显示,干扰组穿膜细胞数仅为（17.1±1.0）,明显低于空白对照组（68.2±4.5;P <0.05）和阴性对照组（67.0±2.3;P <0.05）。结论 沉默FAK基因表达可有效抑制人胶质瘤U251细胞的增殖和侵袭能力。