肝癌术后应用白介素12及白介素2诱导的自体肿瘤浸润淋巴细胞的临床观察

目的 观察肝癌患者术后单用白细胞介素2(IL-2)培养和IL-12+IL-2培养的自体肝癌肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)输注后,其特异性杀伤力、增殖能力、细胞因子的改变以及细胞免疫功能和临床症状的变化.方法 将手术切除的原发性肝癌组织进行体外分离,分别用含IL-2的培养液和含IL-12+IL-2的培养液培养,诱导TIL的生长.培养10-14 d测定细胞杀伤率、细胞因子和增殖能力,待细胞扩增达108-9/ml时进行输注,随访观察临床疗效.结果 ①输注IL-12+IL-2组TIL对自体肝癌细胞的细胞杀伤率、细胞扩增能力、细胞因子IFN-γ和TNF-α水平均比IL-2组明显增高;②输注IL-12+IL-2诱导的TIL组与IL-2诱导的TIL组输注后CD3+、CIM+、CD8+均升高,以CD3+、CD8+升高为主.与输注前比较,差异均有统计学意义;IL-12+IL-2组与IL-2组间比较,前者CD3+、CD8+、CD 56+上明显高于后者,差异均有统计学意义.③输注后两组患者的临床症状均比输注前改善明显,但两组间比较无明显差异.④接受TIL自体输注治疗的患者,其1年、3年、5年生存率均有所提高,IL-12+IL-2组与IL-2组与同期非TIL治疗组相比较(P＜0.05).结论 白介素12诱导肝癌TIL可明显增强TIL细胞的特异性细胞毒作用且增殖能力明显增强.肝癌患者术后输注IL-12+IL-2诱导的自体肝癌肿瘤浸润淋巴细胞比输注IL-2诱导的肝癌肿瘤浸润淋巴细胞能更有效地提高肝癌患者机体免疫机能,延长1年生存期,减少复发.     

小鼠肝癌细胞系Hepa1-6 B7.1瘤苗抗肿瘤免疫的实验研究

目的：研究小鼠肝癌细胞系Hepal-6转染B7.1基因后在体内外抗肿瘤免疫的作用。方法：采用脂质体介导的方法用pLXSNB7.1转染PA317包装细胞,经G418筛选出高滴度阳性的细胞克隆,以流式细胞仪检测B7.1分子的表达情况;用所获病毒上清进一步感染Hepal-6细胞,观察转染B7.1基因后Hepal-6细胞作为肿瘤疫苗在体内外诱发抗肿瘤免疫的情况。结果：Hepal-6/B7.1高表达B7.1分子,其致瘤性明显降低。接种小鼠后成瘤率为20%,而亲代Hepal-6细胞成瘤率为100%,转B7.1基因肿瘤细胞疫苗可抑制肿瘤生长速度,延长荷瘤小鼠生存期;且转B7.1基因肿瘤细胞疫苗具有保护性免疫反应。结论：转B7.1基因的肿瘤细胞作为肿瘤疫苗可有效地激发机体的抗肿瘤免疫反应。     

白细胞介素12诱导肝癌肿瘤浸润淋巴细胞的临床应用

目的 :对 IL -12 + IL -2培养的肝癌肿瘤浸润淋巴细胞 (TIL)与 IL-2诱导的 TIL作对照研究观察 TIL的特异性杀伤力、增殖能力、细胞因子的改变及临床疗效。方法 :将手术切除的原发性肝癌进行体外分离 ,分别用含 IL -2的培养液和含 IL-12 +IL-2的培养液培养 ,诱导 TIL的生长。培养 10～ 14天测定细胞杀伤率、细胞因子和增殖能力 ,待细胞扩增达 10 8～ 9· ml- 1 时进行回输 ,随访观察临床疗效。结果 :(1) IL-12 + IL -2组 TIL对自体肝癌细胞的细胞杀伤率比 IL -2组明显增高 (P<0 .0 1) ;(2 ) IL -12+ IL -2组 TIL比 IL-2组扩增能力明显增强 (P<0 .0 5 )。 (3 ) IL-12 + IL -2组较 IL-2组细胞因子γ干扰素 (IFN-γ)和肿瘤坏死因子 α(TNF-α)水平明显增高 (P<0 .0 5 )。 (4 ) TIL 回输后 IL-12 + IL-2组与 IL-2组 CD3+、CD4 +、CD8+均升高 ,以 CD3+、CD8+ 升高为主。与输注前比较差异均有显著性。 IL-12 + IL-2组与 IL-2组间比较 ,前者 CD3+ 、CD8+ 、CD56 + 上明显高于后者 ,差异显著 (P<0 .0 5 )。 (5 )患者的临床症状改善明显。 (6) IL-12 + IL-2组 1年、3年、5年生存率与 IL-2组 TIL回输肝癌患者对比差异均显著且复发率降低。结论 :白介素 12诱导肝癌 TIL可明显增强 TIL细胞的特异性细胞毒作用且增殖能     

黑色素瘤抗原-1诱导特异性抗肝癌免疫应答

目的:探讨黑色素瘤抗原-1(MAGE-1)对特异性抗肝癌免疫应答反应的影响。方法:分别用转染pcD-NA3.1-MAGE-1(重组子)、pcDNA3.1(空质粒)以及未行转染的人肝癌细胞SMMC-7721冻融抗原致敏树突状细胞(DC),诱导T淋巴细胞增殖分化为细胞毒性T淋巴细胞(CTL)。乳酸脱氢酶释放法检测CTL对SMMC-7721细胞的杀伤活性。48只C57BL小鼠随机分为重组子组、空质粒组和PBS组,每组16只。用pcDNA3.1-MAGE-1预先免疫重组子组小鼠,1次/10d,第3次免疫后第5天ELISA法检测各组8只小鼠脾细胞培养液中IFN-γ和IL-2的含量,第6天各组8只小鼠接种鼠源性肝癌细胞H22,观察其生存时间。结果:未转染、空质粒和重组子组诱导的CTL对靶细胞的杀伤率以及各组小鼠股四头肌MAGE-1mRNA表达的比较差异有统计学意义(F=139.601和538.650,P﹤0.001),重组子组高于未转染和空质粒组。PBS组和空质粒组小鼠脾细胞培养液中IFN-γ和IL-2的含量为0,重组子组小鼠脾细胞培养液中IFN-γ含量为(372.33±10.08)ng/L,IL-2含量为(108.67±12.81)ng/L。3组小鼠荷瘤生存时间比较差异有统计学意义(F=31.837,P<0.001),重组子组小鼠生存时间明显延长。结论:MAGE-1可诱导特异性抗肿瘤免疫应答,从而显著延长荷瘤小鼠的生存时间。     

下调PTEN促进肝癌抑制性肿瘤免疫微环境形成

目的 探索PTEN在肝细胞癌免疫微环境形成中的作用.方法 实验小鼠C57BL/6被随机分为PTEN小干扰RNA(small interfering RNA,siRNA)组和siRNA阴性对照(negative control,NC)组,构建小鼠皮下移植瘤模型,并在小鼠皮下移植瘤中分别注射PTEN siRNA及siRNA...     

树突状细胞疫苗与肿瘤免疫

抗原脉冲的树突状细胞（ｄｅｎｄｒｉｔｉｃｃｅｌ，ＤＣ）的潜能和新颖的肿瘤靶的鉴定，重新激起对恶性肿瘤治疗型疫苗的研究兴趣，已成为许多研究课题的热点。本文综述ＤＣ在肿瘤免疫治疗中的开发应用。１引言人体免疫系统具有抵御恶性细胞失控制性生长的能力，其核心是...     

SEA诱导树突状细胞抗膀胱肿瘤免疫应答的实验研究

目的 研究超抗原金黄色葡萄球菌肠毒素Ａ（ＳＥＡ）刺激后的树突状细胞（ＤＣ）体内诱导的抗膀胱肿瘤免疫效应。方法 分离小鼠Ｔ７３９脾脏ＤＣ,加ＳＥＡ贴壁培养并富集细胞,观察其对ＤＣ功能特性的影响及体内诱导的抗肿瘤免疫保护反应。结果 经ＳＥＡ刺激后的ＤＣ共刺激分子Ｂ７表达显著增加,刺激Ｔ细胞增殖能力明显增强（Ｐ〈０．０５）;在体内诱导出更强的细胞毒性Ｔ细胞（ＣＴＬ）,有效抵抗膀胱肿瘤细胞ＢＴ１７３９的攻击。结论 ＳＥＡ可活化ＤＣ,使后者在体内诱导出显著的抗膀胱肿瘤保护性免疫反应。     

肝癌肿瘤血管密度的研究

目的 探讨肿瘤血管密度（ＭＶＤ）与肝细胞肝癌根治性切除病人预后的关系。方法 采用免疫组化法利用ＣＤ３４单克隆抗体检测７８例肝癌病例根治性切除后生存率与ＭＶＤ的关系。结果 本组ＭＶＤ中位值为１００,因此ＭＶＤ≥１００的肿瘤定义为多血管型（ｎ＝４２）,ＭＶＤ〈１００的肿瘤定义为少血管型（ｎ＝３６）。Ｃｏｘ逐步回归模型证实肿瘤大小是病例生存率唯一的决定因素。在小肝癌病例（〈５ｃｍ,ｎ＝４０）,根治性切除     

热休克小鼠肝癌细胞(H_(22))源Exosomes的体内抗肝癌作用研究

目的:在荷瘤 BALB/c 小鼠观察热休克小鼠肝癌细胞(H_(22))源 Exosomes(HS-Exo) 激发宿主抗肝癌免疫应答的效应.方法:用自行分离纯化的小鼠肝癌细胞 H_(22) 源 Exosomes 及 HS-Exo 免疫小鼠,然后给小鼠皮下接种 H_(22) 肿瘤细胞,观察肿瘤的生长状况.用MTT法检测小鼠脾细胞增殖情况和细胞毒活性;用免疫组织化学法检测肿瘤组织中CD_4~+、CD_8~+T淋巴细胞浸润情况.BALB/c 小鼠皮下接种 H_(22) 细胞,肿瘤长至可触及大小后,分别注射Exosomes及HS-Exo进行治疗,观察各组肿瘤大小及其小鼠存活期.结果:与对照组 Exosomes 相比,HS-Exo 能使肿瘤出现时间延迟,肿瘤生长缓慢(P<0.05);更能促进脾淋巴细胞增殖并增强其细胞毒活性(P<0.05),能更有效的诱导 CD_4~+ 和 CD_8~+T 细胞活化(P<0.05);更为显著的抑制了小鼠的肿瘤生长(P<0.05).结论:HS-Exo 具有更强的免疫活性,能更好的诱导小鼠抗 H_(22) 肝癌作用,有针对亲本细胞的免疫保护作用,并且具有更为显著的肿瘤治疗作用.     

消减免疫法制备抗肝癌凋亡细胞相关抗原单克隆抗体

目的　分析肝癌细胞凋亡过程中相关分子的表达情况 ,制备抗凋亡相关抗原的 m Ab.方法　用 6 0 m L· L- 1乙醇作用 6 h诱导 HCC- 92 0 4细胞凋亡 . May- Grunwald- Giemsa(MGG)法染色观察细胞形态 .流式细胞仪分析细胞 DNA含量 .环磷酰胺消减免疫法免疫 10只小鼠 ,另取 10只小鼠用常规法免疫作为对照 .末次免疫后取鼠尾血清进行免疫细胞化学法检测 .选取尾血清与凋亡细胞和非凋亡细胞的反应差异最明显者取脾细胞 ,与骨髓瘤细胞 SP2 /0融合 . EL ISA法筛选 .计算杂交瘤细胞融合率和抗体阳性率 .有限稀释法连续克隆化 .免疫细胞化学法进一步筛选 .Western blot法分析m Ab相关抗原的分子质量 .结果　 MGG染色可见大部分细胞出现凋亡 .流式细胞仪分析可见亚二倍体凋亡峰 .实验组有 2只鼠的尾血清在凋亡细胞呈强阳性 ,而与非凋亡细胞的反应很弱 .两组的细胞融合率无明显差异 ;在凋亡细胞高表达 ,而在非凋亡细胞低表达的抗体的产生率也未见明显差异 .实验组总的抗体产生率明显低于对照组 (P<0 .0 1) ,在凋亡细胞与非凋亡细胞均高表达的抗体的产生率也明显低于对照组 (P<0 .0 1) .筛选出 1株在乙醇诱导的 HCC- 92 0 4凋亡细胞核内高表达 ,而在非凋亡的 HCC- 92 0 4细胞低表达的 m Ab.此 m Ab相关抗原的相对分子     

纳米技术应用于肿瘤免疫治疗的研究进展

近年来,人们对肿瘤生物学和免疫学的基本原理有了更深入的了解,肿瘤的免疫治疗已经取得重大进展,极大促进了一系列新免疫治疗肿瘤药物的发展。肿瘤免疫治疗是指重新启动人体自身免疫系统消除肿瘤细胞。然而,免疫调节化合物系统传递的安全性和有效性问题限制了肿瘤免疫疗法的推广与应用。纳米技术由于其独特的优点,如靶向性好、不良反应少、稳定性好,各种具有不同理化特性的纳米靶向递送体系被开发出来,以刺激免疫系统实现抗肿瘤治疗。本文就近年来纳米技术联合免疫治疗肿瘤的研究进展作一综述。     

苦参碱诱导人肝癌细胞系HepG2凋亡的研究

目的 观察苦参碱是否能诱导人肝癌细胞系HepG2凋亡及凋亡相关基因的变化。方法 0－3.0g/L苦参碱处理HepG2细胞,光镜和电镜下观察细胞形态;TUNEL法原位检测DNA断裂;流式细胞仪检测凋亡峰;AnnexinV-FITC/PI双标记检测早期凋亡;免疫组化和原位杂交法检测wp53,bcl-2,bax,c-myc,Fas等凋亡相关基因的表达,采用真彩色图像分析仪定量检测。结果 1.5-3.0g/L苦参碱可诱导HepG2凋亡,并且使凋亡相关基因wp53,bax,Fas表达上调,而抗调亡基因bcl-2,c-myc表达下调。结论 一定浓度的苦参碱可诱导人肝癌细胞HepG2凋亡,并且该凋亡与凋亡相关基因表达增强和抗凋亡相关基因表达减弱有关。     

小鼠肝癌细胞(H22)源外泌体的体内抗肝癌作用研究

目的在荷瘤动物模型观察小鼠肝癌细胞（H22）来源的外泌体（exosomes）激发宿主抗肝癌免疫应答的效应。方法用自行分离纯化的小鼠肝癌细胞H22源外泌体免疫小鼠,然后给小鼠皮下注射H22肿瘤细胞,观察肿瘤的生长状况。用MTT法检测小鼠脾细胞增殖情况和细胞毒活性;用免疫组织化学法检测肿瘤组织中CD4^＋、CD8^＋T淋巴细胞浸润情况。结果该外泌体使肿瘤出现时间延迟,肿瘤生长缓慢,小鼠生存率提高。促进脾淋巴细胞增殖并增强其细胞毒活性,促进CD4^＋和CD^8＋T细胞活化。结论小鼠肝癌细胞（H22）源外泌体能诱导抗肿瘤应答,有效地诱导特异性的杀伤肿瘤细胞活性,有针对亲本细胞的免疫保护作用。     

苦参素抗肝癌作用研究

苦参素是生物碱类药物,在临床上主要用于慢性肝炎等疾病的治疗。近年来,苦参素抗肝癌的治疗已逐渐受到广大学者的关注。苦参素抗肝癌作用机制主要包括抑制肝癌细胞增殖、诱导肝癌细胞分化、促进肝癌细胞凋亡、抑制端粒酶活性、阻滞细胞周期进展、调节宿主免疫功能、抑制肝癌血管内皮细胞增殖、逆转肝癌细胞多耐药性。现就苦参素抗肝癌的作用机制、实验研究和临床应用进行综述。     

抗人肝癌单克隆抗体的制备及鉴定

用国人肝癌细胞免疫BALB/c鼠,经三次细胞融合、反复筛选及克隆化,得到了15株杂交瘤;又经正常肝组织及肝癌细胞吸收试验,进一步选出两株杂交瘤。它们分别能持续稳定地分泌特异性抗人肝癌单克隆抗体A-QGY_1和A-QGY_2。此两株单克隆抗体只与体外培养或患者组织中的肝癌细胞产生反应,而不与正常成人和胎儿肝组织及其他多种正常或肿瘤组织发生反应,与乙肝病毒抗原及甲胎蛋白、癌胚抗原等也无免疫交叉反应。     

抗人肝癌单克隆抗体的制备及鉴定

The hepatocellular carcinoma (HCC) cell line, QGY-7703, derived from a Chinese patient, was used to immunize the BALB/c mice. Fifteen hybridomas producing McAb that reacted with QGY-7703 cells were isolated from 858 hybridomas created in three cell fusions. In further studies two McAb, namely, AQGY1 and A-QGY2, were selected which specifically stained HCC cells grown in vitro. The reactivity of these McAb was not removed by the absorption by homogenates of the normal liver, but was by homogenates of HCC cells. A-QGY1 and A-QGY2 also reacted definitely with HCC cells in liver tissues of HCC patients, but neither with other cells in the tissues nor with nontransformed liver tissues of the same patients. Furthermore these two McAb stained the adult or fetal liver tissues, nor all of the other normal or tumor tissues that had been tested. Blocking and absorbing experiments revealed that A-QGY1 and AQGY2 antigens had no immunohomogenicity with antigens such as HBsAg, HBcAg, HBeAg, AFP and CEA. The specificity of these two McAb may be used potentially for the sero diagnosis, histologic identification, radioimmunoimaging and destruction of human hepatocellular carcinoma.     

树突状细胞在肿瘤免疫中的作用

继手术、化疗、放疗之后免疫治疗越来越受到医学界的重视。但是,肿瘤的低免疫原性和机体对肿瘤的低免疫反应性,使得免疫治疗受到限制。目前,树突状细胞(DC)的免疫呈递作用,在提高机体对肿瘤的免疫反应得到进一步认识。有望成为临床上治疗肿瘤的新方法。     

IL-15联合肿瘤全细胞疫苗抗小鼠结肠癌的实验研究

目的 研究IL-15能否协助肿瘤全细胞疫苗诱发有效的抗肿瘤免疫反应.方法 建立小鼠皮下CT26结肠癌模型,将32只荷瘤小鼠随机分为4组:对照组(200 pL PBS)、CT26疫苗组(200 μL细胞疫苗,含2×106细胞)、mIL-15组(200 μL脂质体-质粒DNA复合物,含20 μg pORF9-mIL-15质粒)和CT26十mlL-15联合治疗组C100 μL脂质体-质粒DNA复合物(20 μg pORF9-mIL-15质粒)和100 μL细胞疫苗(2×106细胞)].阳离子脂质体按3:1的比例包裹真核表达质粒pORF9-mIL-15制成纳米复合物.各组小鼠采用皮下多点注射的方式进行治疗,定时观察各组小鼠肿瘤生长情况并测量肿瘤体积.实验结柬时取肿瘤进行组织病理学观察及肿瘤组织原位凋亡检测.结果 CT26十mIL-15组小鼠肿瘤的生长受到抑制.抑瘤率为45%,与其他3组比较差异有统计学意义(P<0.05);肿瘤组织病理学分析显示CT26十mlL-15组小鼠肿瘤内部坏死区域较其他3组明显增多;肿瘤组织原位凋亡检测显示CT26+raiL-15组小鼠肿瘤内部细胞凋亡增多,凋亡指数为(46.7±7.2)%,与对照组(4.9±1.4)%、CT26疫苗组(5.4±1.4)%和mlL-15组(15.6±4.2)%比较,差异有统计学意义(P<0.05).结论 IL-15能够增强全细胞疫苗的免疫治疗效果.     

甲胎蛋白DNA疫苗的构建及诱导小鼠抗肿瘤免疫的实验研究

目的克隆小鼠甲胎蛋白(murineα-fetoprote in,mAFP)基因,构建mAFP DNA疫苗并检测其诱导mAFP特异性CTL反应及抗肿瘤免疫的能力。方法利用RT-PCR从Hepa 1-6细胞总RNA中克隆出mAFP基因,亚克隆于pcD-NA3.1中构建DNA疫苗pmAFP,酶切、测序和表达鉴定;pmAFP稳定转染EL-4细胞建立EL-4(mAFP)细胞系;pmAFP免疫小鼠,接种EL-4(mAFP)细胞,观察肿瘤生长情况;E lispot法检测免疫后小鼠脾脏细胞中产生IFN-γ的细胞频数;另外,对免疫的小鼠采血进行肝、肾功能检测。结果RT-PCR成功克隆出小鼠AFP基因;酶切、测序和表达鉴定证实DNA疫苗pmAFP构建成功;RT-PCR证实EL-4(mAFP)细胞中有mAFP mRNA的表达;pmAFP免疫组小鼠的肿瘤体积(1 042.42±123.71)mm3明显小于pcDNA3.1组(P<0.01)和PBS组(P<0.01);pmAFP免疫小鼠的脾脏细胞产生IFN-γ的细胞频数显著高于pcDNA3.1组(P<0.01)和PBS组(P<0.01)。各组肝、肾功能无显著差异。结论mAFP DNA疫苗构建成功,此疫苗能诱导AFP特异性的CTL增殖并诱导小鼠产生明显的抗肿瘤免疫力,对小鼠肝、肾功能不产生影响。