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使用人粘附分子—2启动子的衰变加速因子重组基因表达载体的构建及意义 总被引:1,自引:1,他引:0
目的:构建含人粘附分子-2(ICAM-2)启动子的人衰变因子(DAF)重组基因的真核细胞表达载体,运用于转基因动物克服异种器官排斥的研究。方法:双酶切本室巳构建质粒pGEM-7Zf-DAF,得到含人ICAM-2启动子及DAFcDNA序列的插入片段(3.7Kb);双酶切pcDNA3真核表达载体,得到不含病毒启动子、含筛选基因Neo的一段DNA作为载体序列(4.4Kb);两段DNA进行连接反应后转化细菌;阳性转化菌落质粒抽提及酶切鉴定。根据人的ICAM-2启动子、DAFcDNA序列,设计引物行PCR特异扩增检验。结果:特异性3组酶切重组表达载体,产生符合设计的相应条带;PCR扩增出特异的318bp及1.7Kb的DNA片段,符合设计要求。结论:含人ICAM-2启动子的DAF重组基因表达载体获得成功。 相似文献
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目的:构建人类8型疱疹病毒(HHV-8)K8.1基因原核表达重组质粒,获得HHV-8外壳蛋白重组融合蛋白,为制备检测抗原建立平台。方法:根据基因库K8.1全长基因序列和pET41a载体的多克隆位点设计引物,分别在引物两端添加特异酶切位点,以pGEM-Teasy/K8.1质粒为模板,PCR扩增K8.1基因全长序列,克隆入原核表达载体pET-41a,构建原核表达质粒pET41a-K8.1;转化大肠杆菌DH5α,经酶切、测序鉴定其插入序列的正确性。结果:酶切鉴定表明在约500bp处可见酶切片段,测序结果表明构建的pET41a-K8.1原核表达质粒连接正确,插入的K8.1基因片断为494bp。结论:成功构建了pET41a-K8.1原核表达质粒,为获得重组融合HHV-8外壳蛋白建立了平台。 相似文献
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目的:构建人补体衰变加速因子(Decayacceleratingfactor,DAF)、补体膜辅助调节蛋白(membranecofactorprotein,MCP)、CD59的真核表达载体pSecTag2/HygroB-DAF、pSecTag2/HygroB-MCP、pSecTag2/HygroB-CD59。方法:应用PCR方法,从DAF-pGEM-TEasyVector、MCP-pGEM-TEasyVector和CD59-pGEM-TEasyVector分别克隆所需的DNA片段,经限制性内切酶BglandXhol消化后,插入到具有相应酶切位点的真核表达载体pSecTag2/HygroB中,分别构建人DAF、MCP、CD59真核表达质粒,并进行酶切鉴定及DNA序列测定分析。结果:DAF基因大小为1049bp,MCP基因大小为1065bp,CD59基因大小为312bp,与genbank中记载的人DAF、MCP和CD59cDNA序列结果基本相同。结论:成功构建DAF、MCP和CD59真核表达质粒,为今后进一步探讨及研究转基因肝脏奠定了基础。 相似文献
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目的 构建重组原核表达质粒获得HPV18 L1活性蛋白,为进一步研制HPV18基因工程疫苗打下基础。方法 以重组质粒pBR322-HPV18为模板,利用PCR方法扩增HPV18 L1DNA片段,将HPV18 L1DNA与pUC19质粒重组构建pUC19-HPV18 L1重组质粒。用酶切电泳验证重组结果的正确性;并通过测序检查质粒重组后序列有无变化。再利用pQE32质粒做表达载体构建pQE32-HPV18 L1重组质粒,并用酶切电泳验证。结果 PCR扩增DNA片段约为1.7Kb,与预期结果相同。pUC19-HPV18 L1克隆重组质粒酶切后显示4.39Kb,酶切图谱与预期相同。测序验证插入片段全序列无改变。pQE32-HPV18 L1表达重组质粒酶切后显示其大小约5.16Kb,酶切图谱亦与预期相同。结论 pQE32-HPV18 L1表达重组质粒构建成功。 相似文献
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目的:构建人补体衰变加速因子(DAF)真核表达载体pSecTag2/HygroB-DAF,并利用壳聚糖组装成纳米微粒复合体,转染小鼠NH/3T3成纤维细胞。方法:应用PCR方法,从DAF—pGEM—T Easy Vector克隆相关的DNA序列,插入具有相应酶切位点的真核表达载体pSecTag2/HygroB中,构建pSecTag2/HygroB—DAF真核表达质粒,并进行酶切鉴定及序列测定;利用壳聚糖包裹质粒,转染小鼠NIH/3T3细胞,并对转染细胞用抗DAF进行免疫组化染色。结果:DAF基因大小为1049bp,与基因序列数据库中记载的人DAF cDNA序列结果完全一致;利用壳聚糖-DAF纳米微粒转染NIH/3T3细胞24h后,免疫组化染色显示细胞质弥漫染色阳性。结论:成功构建了人DAF真核表达载体并通过壳聚糖介导转染NH/3T3细胞。 相似文献
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目的 同时克隆EcoRⅡ限制性内切酶基因和EcoRⅡ甲基化酶基因,初步探讨该限制-修饰系统的协同表达机制。方法 采用外切酶Ⅲ删除法构建单向缺失亚克隆,根据亚克隆的酶活性对上述两种基因进行初步定位,经核酸序列测定确定亚克隆的缺失部位,再以S1核酸酶保护分析法测定基因的转录起始点。 相似文献
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目的探讨克隆副溶血性弧菌(Vp)耐热直接溶血毒素基因的方法。方法用PCR技术扩增目的基因,双酶切载体 pUC19和目的基因 DNA,连接并转化大肠杆菌 JM109。对重组质粒进行 PCR鉴定、酶切鉴定和序列分析。结果凝胶电 泳显示,标准株Vpl4-90基因组DNA的PCR产物长约600 bp。阳性克隆的PCR产物也为一长约600 bp)的条带,经双 酶切可切出一约 600 bp的条带。 DNA 测序结果表明与 Genebank中的序列有 99.65%的同源性。结论利用该方法成功 克隆了目的基因,为制备用于现场检测的基因探针和Vp的保护性菌苗以及阐明Vp的致病机理奠定了基础。 相似文献
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球形幽门螺杆菌vacA基因的克隆及序列测定 总被引:2,自引:0,他引:2
目的:克隆球形幽门螺杆菌(HpC)vacA基因全长片段,并进行序列分析。方法:采用亚抑菌浓度的抗生素作用,使幽门螺杆菌(Hp)标准株NCTC11637发生球形变异,收集球形Hp。从HpC基因组DNA中特异扩增出vacA基因片段,扩增的目的片段经纯化回收后克隆到pMD-18T中,转化人大肠杆菌JM109。阳性重组质粒用PCR及双酶切鉴定,并进行序列测定。结果:从HpC基因组DNA中扩增出3888bp的vacA基因,构建重组质粒pMD-18T-vacA,酶切产物的大小与预期相符。测序结果显示,HpC与已公布的HpvacA基因序列的同源性达99.8%。结论:成功地对HpC vacA基因进行体外扩增及构建原核重组质粒pMD-18T-vacA,并经酶切及序列分析所验证,证明HpC含有完整的vacA基因,其可能与Hp的致病性有关。 相似文献
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目的 构建结核分支杆菌分泌蛋白Ag85B编码基因的DNA疫苗。方法 以结核分支杆菌H37Rv基因组为模板,PCR扩增Ag85B编码基因,用限制性内切酶消化后,插入真核表达载体pVaxl中,转化大肠杆菌DH5a,进行重组子筛选、鉴定。结果 以结核分支杆菌PCR扩增为阳性,经限制性内切酶消化后可见目的条带,所测定序列与报道的Ag85B序列一致。结论 成功地构建了结核分支杆菌Ag85B基因真核表达株。 相似文献
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目的 通过分子克隆表达人脂联素基因球型结构域(gAd),为进一步研究提供实验基础.方法 应用RT-PCR方法从人大网膜脂肪组织总RNA中扩增出gAd cDNA,克隆人载体pMD18-T,pET32a( )中,形成重组质粒gAd.pET32a( ).筛选出阳性克隆,通过限制性内切酶酶切、PCR和测序进行鉴定,并在体外进行小量表达.结果 从脂肪组织总RNA中扩增得到412 bp片段gAd基因,其cDNA序列与GenBank人gAd基因序列相同,并在体外表达得到相对分子质量为34000的重组蛋白.结论 成功构建了gAd基因原核表达质粒并实现体外的小量表达. 相似文献