野生型DPP Ⅳ真核表达质粒的构建和鉴定

目的 构建野生型DPP Ⅳ真核表达质粒.方法 将野生型DPP Ⅳ基因定向克隆到真核表达质粒pcDNA3.1（＋）,构建成重组质粒pcDNA3 DPP Ⅳ;然后用限制性内切酶消化和DNA序列测定鉴定.结果 经酶切和DNA序列测定鉴定证实重组质粒构建正确.结论 真核表达质粒pcDNA3DPP Ⅳ构建成功,为进一步研究DPP Ⅳ基因在卵巢癌细胞中的表达和生物学作用奠定了基础.     

重组端粒酶pEGFP-hTRT质粒的构建

目的 构建具有绿色荧光蛋白报道(GFP)基因的端粒酶真核质粒载体，为转染细胞、延长细胞寿命提供基础。方法 酶切含人端粒酶逆转录酶(hTRT)基因的pGRNl45质粒获取hTRT片段，插入经酶切及磷酸化处理的GFP载体pEGFP—C1，形成8．1kb质粒，经HindⅢ、NotI酶切电泳筛选、鉴定并测序。结果 经酶切电泳分析得到3．4kb及4．7kb大小的两片段；测序结果显示接头两端序列正确。结论 重组竭粒酶pEGFP—hTRT质粒的成功构建，可用于细胞转染，对进一步研究组织工程种子细胞的衰老问题具有重要意义。     

携带SKP2基因的shRNA表达质粒的构建与鉴定

目的:构建含人SKP2基因不同位点的一系列shRNA真核表达质粒，并进行酶切鉴定、测序。方法:设计合成3对SKP2基因干扰寡核苷酸序列，形成双链后将其依次连入带有U6启动子的pSIREN-RetroQ载体，构建成能产生SKP2短发卡RNA的质粒。结果:构建的核苷酸序列经鉴定构建成功，能成功的克隆入带有pSIKEN RetroQ的载体中。结论:成功构建并鉴定了针对人SKP2基因3个不同位点的shRNA的真核表达质粒，为SKP2为靶点的肿瘤基因治疗研究奠定了基础。     

血管内皮生长因子和Fas配体共表达质粒的构建及其在细胞中的表达

目的 构建血管内皮生长因子(VEGF)和Fas配体(FasL)共表达质粒，并鉴定其在细胞中的表达情况。方法 根据入VEGFl65和FasL的cDNA序列分别设计、合成引物，经扩增、连接、酶切、插入等得到重组表达质粒pCI-VEGFl65和pCI-FasL。再以此为基础构建得到编码FasL和VEGFl65的共表达质粒pCI-FasL-IRES-VEGFl65(简称pCI-FIV)。用脂质体将各表达质粒(2μg)转染NIH3T3细胞，用流式细胞术、ELISA和Western-blot检测其FasL和VEGFl65表达情况。结果 细胞裂解液的Western-blot检测表明，重组质粒pCI-VEGFl65和pCI-FIV能表达VEGFl65。分子量与预期kD一致。细胞培养上清的ELISA检测表明，pCl-VEGFl65和pCI-FIV均能分泌性表达vEGFl65。流式细胞仪检测表明，质粒pCI-FasL、pCI-FIV稳定转染的NIH3T3细胞表面的绿色荧光阳性率分别为98．0％和96．5％，而空载体转染细胞的阳性率为3．2％。ELISA检测结果显示，pCI-FasL、pCI-FIV转染NIH3T3细胞培养上清中均存在可溶性FasL。结论 成功构建的FasL和VEGFl65共表达质粒可成功转染细胞并能分泌性表达VEGFl65，同时可表达膜结合形式的FasL和可溶性FasL，为将来血管内膜增生的基因治疗奠定了基础。     

表达CTGF shRNA的pBSHH1质粒载体的构建和鉴定

目的构建表达CTGFshRNA的pBSHH1重组真核表达载体,为获得最佳CTGF基因的siRNA序列和RNAi治疗肾小管间质纤维化提供实验基础。方法从CTGF基因中筛选出4个符合RNAi条件的片段,分别设计4对寡核苷酸,退火后形成双链,两端带有BglII和HindⅢ酶切位点,将上述4对寡核苷酸依次连入BglⅡ和HindⅢ双酶切后线形化的pBSHH1载体,构建成能在细胞内产生CTGFshRNA的质粒,依次命名为pBSHH1-T-1、2、3、4。酶切鉴定,测序证实。结果pBSHH1-T-1、2、3、4经限制性内切酶HindⅢ和EcoRI酶切,电泳后显示连接了双链DNA的280bp条带,进一步测序并证实重组质粒连接正确。结论成功构建了四个能在细胞内表达CTGFshRNA的pBSHH1质粒载体,为获得最佳的CTGF基因的siR-NA序列和进一步RNAi治疗肾小管间质纤维化奠定了基础。     

大鼠半胱氨酸蛋白水解酶-3基因真核表达质粒和RNA干扰质粒的构建及鉴定

目的 构建SD大鼠半胱氨酸蛋白水解酶(Caspase)-3的真核表达质粒和干扰质粒,探究干扰质粒对Caspase-3表达的干预效应。方法 从SD大鼠软骨终板细胞中获得模板cDNA并扩增,约834 bp。克隆至载体pEGFP-N1,获得重组质粒pEGFP-N1-Caspase-3。针对Caspase-3设计4对RNAi靶点序列,克隆至载体pcDNA6.2。成功构建pcDNA6.2-Caspase-3-1、pcDNA6.2-Caspase-3-2、pcDNA6.2-Caspase-3-3、pcDNA6.2-Caspase-3-4,构建对照质粒pcDNA6.2-miRNA。将5个干扰质粒分别与pEGFP-N1-Caspase-3(用量比为7:1)共转染至293T细胞,qPCR检测转染48h后对Caspase-3表达的干预效应。结果 通过菌落聚合酶链反应(PCR)、酶切及测序表明pEGFP-N1-Caspase-3和干扰质粒构建成功;共转293T细胞后,qPCR示pcDNA6.2-Caspase-3-2、pcDNA6.2-Caspase-3-3干预组的Caspase-3的表达高于对照组,分别为33％和8％,而pcDNA6.2-Caspase-3-1、pcDNA6.2-Caspase-3-4干预组的Caspase-3的表达与对照组比较明显减少,抑制效率分别为24％和67％ (P ＜0.05)。结论 成功构建了Caspase-3的表达质粒和干扰质粒,并证实pcDNA6.2-Caspase-3-4对Caspase-3的表达具有明显的抑制效应。     

人睾丸前列腺素D合成酶重组表达质粒的构建与鉴定

目的 :构建高效表达人睾丸前列腺素D合成酶 (htL PGDS)的重组表达质粒。　方法 :以经测序证实为人L PGDS的人睾丸L PGDScDNA为模板进行PCR扩增 ,得到编码L PGDS的基因片段 ,用限制性内切酶BamHⅠ和EcoRⅠ进行酶切后 ,连接到经相同内切酶处理的原核表达载体pGEX 2T中。重组质粒pGEX 2T/htL PGDS被进一步转化感受态大肠杆菌JM10 3 ,转化物接种到含氨苄青霉素的LB平板 ,37℃培养 12～ 16h后 ,挑取氨苄青霉素抗性菌落 ,并接种到含氨苄青霉素的LB液体培养基中 ,37℃、16 0r/min培养 12～ 16h后 ,提取质粒DNA供PCR和双酶切鉴定。　结果 :共筛选出氨苄青霉素抗性菌落 10 9个 ,经PCR和双酶切鉴定出 10个重组质粒pGEX 2T/htL PGDS。结论 :重组表达质粒pGEX 2T/htL PGDS的构建及正确鉴定 ,为以后的重组抗原的表达、纯化及单克隆抗体的制备奠定了基础。     

基因1b型不同准种株HCV核心蛋白原核表达质粒pTrc—CKS构建及诱导表达

目的 为研究与不同准种HCV 核心蛋白(Core)相互作用的细胞蛋白质组,构建并表达基因1b型的不同准种Core的原核表达质粒pTrc-CKS.方法 用聚合酶链反应(PCR)扩增并获得等长度片段的基因1b型的不同准种株丙型肝炎病毒(HCV)Core基因,氨基酸(aa)长度分别为癌中心株(T):1～172 aa、癌旁株(NT):1～172 aa及C191(HCV-J6):1～172 aa.扩增产物用Bam HⅠ及Eco RⅠ双酶切后插入到原核表达质粒pTrc-CKS中.阳性克隆转化到大肠埃希菌Top 10F'中,异丙基-β-D-S-代半乳糖苷(IPTG)诱导表达获得融合蛋白CKS-Core-His,经Ni2+10F'柱纯化并经Western blot验证.结果 PCR及双酶切验证表明3个基因为1b型的不同准种Core基因成功构建到原核质粒pTrc-CKS中,体外诱导并获得了相应的融合蛋白.结论 构建不同准种Core基因的原核表达质粒获得成功,体外诱导表达并纯化获得了CKS-Core-His融合蛋白,为后续研究与Core相互作用的细胞蛋白质组奠定了基础.     

MDR1 shRNA表达质粒的构建

Q-ZsGreeen-A和pSIREN-RetroQ-ZsGreeen-B)经酶切与测序证实两段寡核苷酸片段成功插入到预计位点,序列完全一致,无任何碱基突变. 结论 MDR1 shRNA的表达载体pSIREN-RetroO-ZsGreeen-A和pSIREN-Ret-roQ-ZsGreeen-B成功构建,为进一步研究肿瘤多药耐药逆转奠定了实验基础.     

卡介苗穿梭表达质粒pMS肿瘤坏死因子的构建与鉴定

目的构建分泌性表达肿瘤坏死因子(TNF)-α的重组卡介苗。方法分别以卡介苗(BCG)和TNF-α cDNA为模板，通过PCR扩增得到117bp的BCG—Ag85B信号肽序列和702bp的TNF-α基因序列。将BCG—Ag85B信号肽序列插入大肠杆菌一卡介苗穿梭质粒pMV261，得到重组质粒pMS。再将TNF—α基因序列克隆至pMS中，得到重组质粒pMSTNF。结果质粒pMSTNF用双酶切和PCR扩增及测序鉴定证实，克隆基因BCG—Ag85B和TNF-α。正确插入载体pMV261。结论重组质粒pMSTNF可望在BCG中分泌性表达细胞因子TNF-α从而协同加强对肿瘤的杀伤作用，该质粒的成功构建为改造卡介苗、发展新型抗膀胱肿瘤疫苗提供了依据。     

大鼠诱导型一氧化氮合酶短发夹环RNA质粒的构建及鉴定

目的：构建编码诱导型一氧化氮合酶（iNOS）Jfl动子的shRNA质粒表达载体。为利用基因激活技术治疗勃起功能障碍的研究做准备。方法：根据大鼠iNOS启动子序列设计并合成shRNA寡核苷酸片段．退火形成双链并克隆进入载体pDC316-EGFP-U6，构建重组质粒，并进行PCR鉴定以及测序分析。结果：PCR鉴定以及测序证实重组质粒构建成功。结论：成功构建了靶向iNOS基因的shRNA质粒表达载体．为进一步探索勃起功能障碍基因治疗奠定了基础。     

风疹病毒E1特异肽段的重组质粒载体构建

目的:构建风疹病毒(RV)E1特异肽段的重组质粒载体,以期表达RVE1特异肽段的重组蛋白。方法:抽提RV减毒活疫苗Wistar RA27/3株的基因组RNA后逆转录,用PCR方法扩增E1特异肽段的基因片段;扩增产物经纯化后克隆至pGEX-2T质粒载体,挑取重组质粒阳性克隆进行双酶切鉴定和测序。结果:成功克隆出330bp左右的目的片段,重组质粒经测序后与预期序列一致。结论:RVE1特异肽段的基因片段的成功克隆及重组质粒的构建为进一步表达相应重组蛋白奠定了基础。     

乙型肝炎病毒相关性肝癌发生的分子机制研究进展

原发性肝癌是常见的恶性肿瘤之一,乙肝病毒（hepatitis B virus,HBV）感染是原发性肝癌发生和发展的最主要的危险因素之一,因此深入研究乙肝相关性肝癌的发病机制成为一项长期而艰巨的任务,为肝癌的预防及合理治疗提供依据。本文将近年来乙肝相关性肝癌的分子机制做如下综述。     

肝细胞肝癌靶向性r-Caspase-3重组腺病毒的构建与表达

目的 构建肝细胞肝癌特异性表达反向半胱氨酸蛋白酶3(r-Caspase-3)重组腺病毒,为肝细胞肝癌的基因治疗提供新策略.方法 构建甲胎蛋白(AFP)增强子和白蛋白 (ALB) 启动子腺病毒载体(pAdTrack-EAFP-PALB),然后将目的 基因r-Caspase-3亚克隆到载体pAdTrack-EAFP-PALB上, 获得重组腺病毒穿梭载体pAdTrack-EAFP-PALB /r-Caspase-3, 经PmeⅠ酶切线性化后与pAdEasy-1同源重组,获得重组腺病毒骨架pAdEasy-EAFP-PALB /r-Caspase-3; 鉴定正确的pAdEasy-EAFP-PALB /r-Caspase-3 经PacⅠ酶切线性化后脂质体转染AD293 细胞进行包装、扩增,获得病毒.绿色荧光蛋白(green fluorescent protein,GFP)监测病毒滴度和感染效率; RT-PCR和Western blot 法检测r-Caspase-3在HepG2细胞中的表达; SRB染色法评估重组腺病毒对HepG2细胞的抑制作用,初步观察HepG2细胞凋亡状况.结果 穿梭载体pAdTrack-EAFP-PALB/r-Caspase-3酶切、测序正确.穿梭载体、pAdEasy-1载体同源重组后PCR 及PacⅠ酶切鉴定结果表明pAdEasy-EAFP-PALB/r-Caspase-3 重组成功; 经PacⅠ酶切线性化后,pAdEasy-EAFP-PALB/r-Caspase-3 转染AD293 细胞即可观察到GFP 的表达; 回收病毒可重复感染AD293 细胞,RT-PCR和Western blot 均可检测到r-Caspase-3的表达,证实Ad-EAFP-PALB/r-Caspase-3病毒颗粒包装成功; SRB染色检测发现Ad-EAFP-PALB/r-Caspase-3具有凋亡诱导特异性.结论 靶向性Ad-EAFP-PALB/r-Caspase-3重组腺病毒构建成功,并具有凋亡诱导靶向性,为进一步研究靶向性r-Caspase-3基因治疗肝细胞肝癌及其生物学功能奠定了基础.     

ADV-tk重组腺病毒的构建及检测

目的应用基因重组技术,构建含胸苷激酶（tk）自杀基因的复制缺陷型腺病毒（ADV-tk）,为进一步研究tk自杀基因对肿瘤的抑制作用奠定基础。方法采用细胞内同源重组法构建携带tk基因的ADV-tk,经PCR鉴定正确后进行扩增、纯化和滴度测定。重组腺病毒ADV-tk体外转染人肝癌SMMC-7721细胞,RT-PCR检测tk基因的整合和表达。建立裸鼠人肝癌动物模型,腹腔注射ADV-tk,荧光显微技术观察ADV-tk基因在肝脏的转染情况和对肿瘤细胞的抑制作用。结果构建的重组腺病毒中带有tk基因,经扩增、纯化后测得重组腺病毒滴度为1.4×10^10pfu/ml。ADV-tk体外转染SMMC-7721细胞后,RT-PCR检测显示tk基因在细胞中整合并且有效表达。体内检测结果发现ADV-tk在肝脏有明显转染,肿瘤组织中凋亡细胞明显增多。结论本研究构建的携带tk基因的复制缺陷型腺病毒获得成功,可用于下一步研究。     

TG2和Mertk基因共沉默腺病毒干扰载体的构建及其基因沉默作用

目的构建转谷氨酰胺酶2（TG2）和Mer受体酪氨酸激酶（Mertk）基因共沉默腺病毒干扰载体,并检测其基因沉默作用。方法首先构建能干扰TG2和Mertk蛋白表达的质粒载体pSUPER/TG2及pSUPER/Mertk,再将其干扰序列和H1启动子序列切下并连接到pAdTrack上,构建成pAdTrack/TG2/Mertk载体。将其转入含有pAdEasy-1的BJ5183感受态细菌中,回收并酶切鉴定重组腺病毒载体。将阳性腺病毒载体感染HEK293细胞,收集病毒,反复扩增后测定病毒滴度。分别以pAdTrack/TG2/Mertk、pAdTrack/TG2、pAdTrack/Mertk及pAdTrack/绿色荧光蛋白（GFP）感染RAW264.7细胞,采用免疫印迹法检测其TG2蛋白和Mertk蛋白的表达水平。结果pAdTrack/TG2/Mertk载体的病毒滴度为6.13×1010GFU/mL。经酶切鉴定,pAdTrack/TG2/Mertk含有插入的2个启动子和2个干扰序列,载体构建成功。pAdTrack/TG2和pAdTrack/TG2/Mertk组TG2蛋白的表达水平比较差异无统计学意义（P〉0.05）,但均低于pAdTrack/GFP和pAdTrack/Mertk组（P〈0.01）,后两者比较差异无统计学意义（P〉0.05）。pAdTrack/Mertk和pAdTrack/TG2/Mertk组Mertk蛋白的表达水平比较差异无统计学意义（P〉0.05）,但均低于pAdTrack/GFP和pAdTrack/TG2组（P〈0.01）,后两者比较差异无统计学意义（P〉0.05）。结论 TG2和Mertk基因共沉默腺病毒干扰载体pAdTrack/TG2/Mertk构建成功,其能显著降低小鼠巨噬细胞样RAW246.7细胞中TG2蛋白和Mertk蛋白的表达水平。     

可调控的鼠白细胞介素-12双亚基共表达质粒的构建及在体外表达

目的构建可经米非司酮（RU486）调控表达小鼠白细胞介素-12（mIL-12）单链融合基因的真核载体，并鉴定其调控表达效果。方法以GCp35Ep40PN质粒为模板，分别获取mIL-12 p40和p35亚基的基因，重叠PCR引入linker后，克隆人pCA14质粒，测序正确之后，装人可调控载体pRS-17而构建成真核表达质粒pRS-RUmIL-12。用Lipofectamine 2000将pRS-RUmIL-12质粒转染HEK293细胞，以不同剂量的RU486诱导其表达，然后用ELISA法检测其培养上清液中mIL-12蛋白的含量。结果所得mIL-12单链融合基因序列与设计一致。pRS-RumIL-12在体外转染HEK293细胞后，ELISA检测结果表明该系统具有良好的调控能力：无诱导剂RU486时，mIL-12蛋白表达量很低，而加入诱导剂RU486后，可以诱导mIL-12的表达，并在一定范围内mIL-12的蛋白表达量与诱导剂的浓度呈正相关。结论成功构建了可经RU486调控的mIL-12双亚基共表达的真核表达质粒，可用于进一步的基因调控和基因治疗研究。     

外源质粒DNA对小鼠肝脏基因表达谱的影响

研究了外源质粒DNA经胃肠道吸收可能对肝脏产生的作用机制。给Balb／c小鼠灌胃质粒pcDNA3 200μg，在灌胃后4h分离肝脏，提取肝脏的总RNA。利用寡核苷酸芯片对灌胃质粒pcDNA3后的Balb／c小鼠肝脏进行基因表达谱研究。结果发现17664个基因中，表达上调100条，表达下调41条。按基因功能分类，表达上调的基因可分为免疫应答基因、转录因子基因、信号转导基因、转运相关基因及代谢相关基因等；表达下调的基因主要为脂质代谢基因。灌胃外源质粒DNA后，肝脏组织主要表现为急性时相反应的加强、免疫反应的活化、细胞信号通路的活化以及脂质代谢途径的抑制。表明外源质粒DNA通过胃肠道途径可广泛调控肝脏的基因表达。     

大鼠脊髓损伤后诱导型一氧化氮合酶基因表达变化的实验研究

目的探讨大鼠脊髓损伤后诱导型一氧化氮合酶(iNOS)mRNA表达的变化规律.方法SD大鼠48只,随机分为8组,采用Allen's脊髓损伤打击模型,以逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)法测定伤段脊髓组织iNOS mRNA表达情况.结果iNOS mRNA在脊髓损伤前即有表达,损伤后早期无明显变化,伤后72h开始升高,1周时达到高峰.结论脊髓继发性损害的持续时间可能大于传统观念,针对继发性损害所作的治疗应持续至脊髓损伤后较长的一段时间.     

萤火虫荧光素酶报告基因重组逆转录病毒载体的构建及鉴定

目的构建含萤火虫荧光素酶报告基因的逆转录病毒载体,为进一步研究生物发光活体动物体内光学成像奠定基础。方法利用重组DNA技术,将荧光素酶报告基因载体pGL3-Basic双酶切得到的目的基因fluc+亚克隆至逆转录病毒载体pLXSN中,重组质粒pL(fluc)SN在脂质体介导下乒乓转染GP+E86和PA317包装细胞,G418筛选,直至出现抗性克隆。扩大培养,测定病毒滴度,并检测荧光素酶活性。结果经限制性酶切分析鉴定,载体插入基因大小、位置均正确,并用GP+E86和PA317细胞进行包装、病毒滴度测定、筛选,建立具有较高滴度的重组逆转录病毒fluc细胞系,该细胞可高效表达荧光素酶。结论成功构建了重组质粒pL(fluc)SN,为标识干细胞进行基础研究提供了一种检测方法和平台。