人白细胞介素—2基因真核表达载体pDORIL—2的构建

构建逆转录病毒载体介导的人白细胞介素－２（ＩＬ－２）基因真核细胞表达载体。方法：合成带有和表达载体克隆位点相匹配酶切位点的聚合酶链式反应（ＰＣＲ）引物，用ＰＣＲ方法从质粒ｐＨＩＧ５３中扩增出人的ＩＬ－２ｃＤＮＡ，将其定向克隆入表达载体ｐＤＯＲ－ｎｅｏ。结果：ＰＣＲ扩增出的ＩＬ－２ｃＤＮＡ片段约４７５ｂｐ，酶切鉴定该片段已被克隆入ｐＤＯＲ－ｎｅｏ的多克隆位点，构建成人ＩＬ－２基因真核表达载体ｐＤＯＲ     

人白细胞介素－2基因真核表达载体pDORIL－2的构建

目的：构建逆转录病毒载体介导的人白细胞介素－２（ＩＬ－２）基因真核细胞表达载体．方法：合成带有和表达载体克隆位点相匹配酶切位点的聚合酶链式反应（ＰＣＲ）引物，用ＰＣＲ方法从质粒ｐＨＩＧ５３中扩增出人的ＩＬ－２ｃＤＮＡ，将其定向克隆人表达载体ｐＤＯＲ－ｎｅｏ．结果：ＰＣＲ扩增出的ＩＬ－２ｃＤＮＡ片段约４７５ｂｐ，酶切鉴定该片段已被克隆人ｐＤＯＲ－ｎｅｏ的多克隆位点，构建成人ＩＬ－２基因真核表达载体ｐＤＯＲＩＬ－２．结论：用ＰＣＲ扩增目的基因片断，有快速、获得量大、可改变酶切位点等优点；ｐＤＯＲＩＬ－２的构建成功，为开展基因治疗的研究打下了基础。     

正、反义hTERT基因真核表达载体的构建与鉴定

目的构建正、反义hTERT基因真核表达载体,为进一步研究端粒酶的活性调节与恶性肿瘤基因治疗作准备。方法根据已发表在Genebank的hTERT cDNA序列,设计并合成了1对两端带特定限制性酶切位点引物,提取子宫颈癌HeLa细胞株总RNA,进行RT-PCR,并将扩增产物TA首先克隆至pGEMR-T载体,然后双酶切pGEM-T载体回收目的片段再克隆至真核表达质粒pcDNA3.1(±)中,并对重组体进行酶切鉴定和测序分析。结果PCR扩增片段与预期结果相符,双酶切证实构建的正、反义hTERT基因真核表达载体克隆成功,插入片段测序结果与Genebank的hTERT cDNA的部分序列完全一致。结论成功地构建了正、反义hTERT基因真核表达载体,为下一步研究端粒酶的活性调节与恶性肿瘤基因治疗打下了实验基础。     

人膀胱逼尿肌中肾上腺素能β3受体基因的克隆及其载体的构建

目的: 克隆人膀胱逼尿肌中肾上腺素能β3受体基因全长,并构建其反义真核表达载体. 方法:采用RT-PCR法从人膀胱逼尿肌中扩增出β3-AR的全长cDNA序列,上游引物5′端加有BamHI及ClaI酶切位点,下游引物加有HindIII酶切位点,将该片段插入pUC18载体中,摇菌扩增后,用ClaI和HindIII切下目的基因,然后将目的片段反向插入逆转录病毒表达载体pLNCX上. 最后对产生的重组子进行琼脂糖凝胶电泳和测序鉴定. 结果:经琼脂糖凝胶鉴定,所克隆的目的基因大约为1.2 kb,并成功地连接到逆转录病毒载体pLNCX上,经测序证明,插入的目的片段其碱基序列与Genbank上报道的完全一致,且插入载体的方向完全正确. 结论:成功克隆了人逼尿肌中肾上腺素能β3受体基因的全长cDNA序列和构建了其反义真核表达载体.     

人肺腺癌细胞单羧酸转运泵基因的克隆及基因序列分析

目的 克隆人肺腺癌细胞单羧酸转运泵基因编码序列并对此序列作同源性分析。方法 通过ＲＴ－ＰＣＲ方法克隆人肺腺癌Ａ５４９细胞单羧酸转运泵基因ｄＤＮＡ编码序列,应用ＰＣＲ、四色荧光、双脱氧终止法测序;通过Ｇｅｅｂａｎｋ数据库应用分析软件对克隆基因序列进行同源性分析。结果 应用ＲＴ－ＰＣＲ方法克隆出人肺癌细胞的单羧酸转运泵基因;肺癌民人心肌细胞单羧酸转运泵基因第一亚型的ｃＤＮＡ编码序列具有主度同源性。结论     

人p27和p15基因表达重组体的构建

周期素依赖性激酶抑制蛋白（ｃｙｃｌｉｎ－ｄｅｐｅｎｄｅｎｔｋｉｎａｓｅｉｎｈｉｂｉｔｏｒｐｒｏ－ｔｅｉｎ，ＣＫＩ），如ｐ２７和ｐ１５基因是抑癌基因的候选基因。作者通过ＰＣＲ方法获得含人ｐ２７全部编码区域的ｐ２７ｃＤＮＡ片段，并用ＰＣＲ产物ＴＡ克隆法，将其构建在真核表达载体ｐＣＲＴＭ３中；用常规酶学方法，通过ＥｃｏＲＩ和ＸｈｏＩ双酶切位点，将人ｐ１５ｃＤＮＡ片段克隆入ｐＣＲＴＭ３载体。重组体的鉴定通过限制酶图谱分析进行。人ｐ２７和ｐ１５基因真核表达重组体的构建为进一步研究其功能打下基础。     

人TLR4及MD2基因反义真核表达载体的构建

目的构建人TLR4及MD2基因反义真核表达载体,为研究其在肺炎症反应中的作用奠定基础.方法通过PCR技术扩增出TLR4及MD2基因片段,然后分别反向插入真核表达载体pEFBOS的多克隆位点,最后对产生的重组子进行酶切和测序鉴定.结果扩增出的TLR4目的片段为2.6 kb,MD2为0.5 kb,并成功地连接到pEFBOS载体上,DNA测序结果也显示插入片段为目的片段.结论成功构建人TLR4及MD2基因反义真核表达载体.     

人抗乙肝表面抗原抗体Fab片段/αA-干扰素融合蛋白原核表达载体的构建

目的：为深入开展乙型肝炎的生物导向治疗，我们构建了人抗乙肝表面抗原（ＨＢｓＡｇ）抗体Ｆａｂ片段／αＡ－干扰素（ＩＦＮ－αＡ）融合蛋白原核表达载体ｐＨＳ／ＩＦＮ－α。方法：采用ＰＣＲ方法，将ＩＦＮ－αＡＤＮＡ两端引入酶切位点及５端引入－Ｌｉｎｋｅｒ，重组入抗ＨＢｓＡｇ抗体Ｆａｂ表达载体ｐＨＳ相应酶切位点，酶切鉴定并筛选出阳性克隆ｐＨＳ／ＩＦＮ－αＡ，并对插入基因片段测序。结果：重组阳性克隆经酶切鉴定证实重组片段已正确插入载体相应酶位点，片段与ＰＣＲ扩增片段大小相同，硷基序列正确。结论：ｐＨＳ／ＩＦＮ－αＡ的成功构建，为人抗ＨＢｓＡｇ抗体Ｆａｂ片段／αＡ－干扰素融合蛋白在大肠杆菌的表达打下基础     

尿激酶受体反义RNA表达质粒的构建

目的 构建能在哺乳动物细胞中表达尿激酶受体（ｕＰＡＲ）反义ＲＮＡ的表达质粒ｐＵＲＡＳ。方法 采用ＲＴ－ＰＣＲ方法扩增并克隆尿激酶受体（ｕＰＡＲ）ｃＤＮＡ５’端－４６￣４５４ｂｐ一段为５００ｂｐ的顺序，利用ＤＮＡ重组技术将该片段反向插入表达载体ｐｃＤＮＡ３的ＣＭＶ启动子下游。结果 限制性内切酶分析和ＤＮＡ顺序分析证实ＲＴ－ＰＣＲ获得ｕＰＡＲ ｃＤＮＡ片段与文献报道相吻合；重组质粒ｐＵＲＡＳ转染肺癌细     

肝素酶反义RNA真核表达载体的构建及鉴定

目的 构建肝素酶（heparanase，Hpa）反义RNA真核表达载体。方法 提取胃癌组织总RNA，按照GenBank中检索出的Hpa基因cDNA序列，设计并合成反义Hpa基因片段的引物，进行RT-PCR，并将扩增产物克隆至DGEMT载体，PCR鉴定及测序证实后，双酶切pGEM-T-antiHpa重组体回收目的片段，再将其反向亚克隆到真核表达质粒pcDNA3．1中，并对阳性克隆进行酶切鉴定和测序分析。结果 PCR扩增出的反义片段与预期长度相符。构建的Hpa反义RNA表达质粒pcDNA3．1-antiHpa，分别作PCR及双酶切（BamHⅠ和HindⅢ）鉴定，证实其中有目的片段完整插入，插入片段测序结果与反义Hpa序列设计完全一致。结论 成功构建了Hpa反义RNA真核表达载体pcDNA3．1-antiHpa，此结果为进一步研究Hpa蛋白分子的生物学功能和以Hpa为靶点的恶性肿瘤的基因治疗研究奠定了基础。