NS3TP2蛋白基因的表达载体构建及在酵母中的表达

目的为探讨丙型肝炎病毒(HCV)非结构蛋白3(NS3)反式调节靶基因编码产物NS3TP2蛋白的功能,在真核生物酵母细胞中表达NS3TP2蛋白基因。方法用多聚酶链反应(PCR)的方法扩增NS3TP2基因,克隆到pGEM-T载体中,双酶切后回收连接到酵母表达质粒pGBKT7中表达。提取酵母蛋白质,进行十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)和Western免疫印迹分析。结果成功构建NS3TP2蛋白基因酵母表达载体,Western免疫印迹显示了NS3TP2蛋白在酵母细胞中的表达。结论NS3TP2蛋白在酵母中表达成功。     

环氧化酶-2与单核-内皮细胞黏附性的相关研究

目的探讨环氧化酶-2（cyclooxygenase-2,COX-2）表达水平同单核-内皮细胞黏附性的关系及其相关机制。方法采用细胞计数法检测单核-内皮细胞的黏附性;实时荧光定量PCR检测内皮细胞COX-2mRNA表达量;Westernblot检测内皮细胞COX-2蛋白表达量;ELISA检测内皮细胞前列腺素E2（ProstaglandinE2,PGE2）水平。结果内皮细胞COX-2mRNA及蛋白表达量在炎症因子TNF—α、IL-1β刺激后显著上调,并随时间变化（P〈0．05）;内皮细胞COX-2蛋白表达量增加与PGE。水平及单核-内皮细胞的黏附性成正相关;使用COX-2特异性抑制剂NS398预孵育后,内皮细胞PGE2表达水平降低（P〈0．05）,单核一内皮细胞的黏附性受到显著抑制（P〈0．01）。结论内皮细胞COX-2mRNA及蛋白表达量在炎症因子TNF-α、IL-1β刺激后明显上调,其表达增加后可能通过催化花生四烯酸代谢成PGE2,使单核一内皮细胞的黏附性增强,从而影响动脉粥样硬化性疾病的进程。     

动脉内皮细胞中TIE2启动CREG真核表达质粒pTIE2-CREG-EGFP-N1的表达

背景:血管内皮发生的分子机制是细胞及基因替代治疗的首要前提.目的:构建一种通过血管内皮细胞特异蛋白TIE2 启动子来启动表达的E1A 激活基因阻遏子(cellular repressor of E1A-stimulated genes,CREG) 和增强绿色荧光蛋白(enhanced green fluorescence protein,EGFP) 融合的真核表达质粒.方法:根据GenBank 中公布的TIE2 基因的启动子序列,人工合成TIE2 启动子DNA 序列,经AseⅠ和NheⅠ双酶切后,亚克隆入表达质粒pEGFP-N1 中构建pTIE2-EGFP-N1.同时,用BamHⅠ和EcoRⅠ双酶切pcDNA3.1 myc-His/hCREG质粒得到CREG 基因,亚克隆入质粒pTIE2-EGFP-N1 中构建pTIE2-CREG-EGFP-N1,酶切鉴定.应用脂质体法将该质粒转染至体外培养的小鼠动脉内皮细胞,荧光显微镜下观察EGFP的表达;Western blot 检测CREG 蛋白的表达.结果与结论:经酶切鉴定证实实验构建的pTIE2-CREG-EGFP-N1 质粒正确;体外转染48 h,荧光显微镜下可见EGFP的表达,Western blot 检测到CREG 蛋白的表达.说明实验成功构建了pTIE2-CREG-EGFP-N1 重组质粒,其可携带目的基因在小鼠动脉内皮细胞中有效表达.     

动脉内皮细胞中TIE2启动CREG真核表达质粒pTIE2-CREG-EGFP-N1的表达

背景：血管内皮发生的分子机制是细胞及基因替代治疗的首要前提。目的：构建一种通过血管内皮细胞特异蛋白TIE2启动子来启动表达的E1A激活基因阻遏子（cellular repressor of E1A-stimulated genes,CREG）和增强绿色荧光蛋白（enhanced green fluorescence protein,EGFP）融合的真核表达质粒。方法：根据GenBank中公布的TIE2基因的启动子序列,人工合成TIE2启动子DNA序列,经AseⅠ和NheⅠ双酶切后,亚克隆入表达质粒pEGFP-N1中构建pTIE2-EGFP-N1。同时,用BamHⅠ和EcoRⅠ双酶切pcDNA3.1myc-His/hCREG质粒得到CREG基因,亚克隆入质粒pTIE2-EGFP-N1中构建pTIE2-CREG-EGFP-N1,酶切鉴定。应用脂质体法将该质粒转染至体外培养的小鼠动脉内皮细胞,荧光显微镜下观察EGFP的表达;Western blot检测CREG蛋白的表达。结果与结论：经酶切鉴定证实实验构建的pTIE2-CREG-EGFP-N1质粒正确;体外转染48h,荧光显微镜下可见EGFP的表达,Western blot检测到CREG蛋白的表达。说明实验成功构建了pTIE2-CREG-EGFP-N1重组质粒,其可携带目的基因在小鼠动脉内皮细胞中有效表达。     

生物素化HCV多抗原表位融合基因的克隆及可溶性表达

为了建立丙型肝炎病毒抗体(HCV-Ab)的双抗原夹心ELISA检测方法．克隆表达带有生物素标签的Hcv多种抗原优势表位融合蛋白，选取HCV各抗原如Core，NS3，NS4，NS5和E的优势抗原表位片段编码序列．克隆重组为融合基因，插入Pinpoint^TM Xa-1 T载体中诱导表达，并用Western blot进行抗原性及标签生物素活性鉴定；表达抗原经Promega SoftLink Soft Release Avidin Resin系统亲和层析纯化后包被酶联板，用抗HCV单片段抗体阳性血清对表达融合蛋白各区的抗原性作间接ELISA法鉴定。结果显示：成功构建了带有生物素标签的HCV多抗原表位融合基因表达载体，该载体可在JM109(DE3)中可溶性表达目的蛋白，表达产物携带生物素标签，融合的各片段区均具有良好的抗原性。结论：所构建融合抗原可可溶性表达，可以用作双抗原夹心ELISA的酶标抗原．所含生物素标签也可用作酶联检测的生物素一亲和素信号放大系统。     

转染丙型肝炎病毒非结构蛋白NS4B对p53表达的影响

目的探讨丙型肝炎病毒非结构蛋白NS4B对肝细胞内p53表达的影响,以及在肝癌发生中的作用与机制。方法设置空白对照组、空白载体组、转染NS4B组、转染p53组、共转染NS4B及p53组。使用脂质体介导转染法,转染丙型肝炎病毒非结构蛋白重组质粒PCXN2-NS4B及突变型p53基因重组质粒pC53-CX22AN3进入Chang肝细胞内,并用G418筛选获得稳定表达细胞。采用免疫细胞化学法检测p53表达率。结果空白对照组无p53表达,空白载体组及转染NS4B组呈弱阳性表达,转染p53组及共转染组呈阳性表达;转染p53组、共转染组分别与空白对照组、空白载体组及转染NS4B组比较,差异均有统计学意义（P〈0.05）。结论 NS4B可能抑制p53表达,也可能阻止其进入细胞核,但NS4B与突变型p53关系不明确。NS4B导致肝细胞异常增生,诱导肝癌发生可能不依赖p53的异常表达及突变。     

异丙酚对脂多糖诱导肺泡巨噬细胞高迁移率族蛋白B1启动子转录活性的影响

目的 探讨异丙酚对脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)诱导肺泡巨噬细胞(alveolar maerophages,AM)高迁移率族蛋白B1(high mobility group box l protein,HMGB1)启动子转录激活的影响.方法 以基因重组技术将HMGB1启动子克隆入荧光素酶报告基因表达载体pGl3-Basic,得到重组质粒pGL3-HMGB1P,采用脂质体介导的转染技术将质粒转染AM细胞.根据转染质粒和施加刺激的不同分为以下各组:未转染组;转染pGL3-Basic组;转染pGL3-HMGB1P组;转染pGL3-HMGB1P+LPS(100 mg/L)刺激组;转染pGL3-HMGB1P+LPS(100 mg/L)+异丙酚(5 mg/L)处理组.通过检测荧光素酶活性米观察启动子活性变化,分别采用Western blot和RT-PCR方法检测细胞HMGB1蛋白和mRNA的表达.应用单因素方差分析进行不同组别问的比较.结果 酶切和测序结果证实重组体pGL3-HMGB1P构建止确,荧光素酶活性检测显永pGL3-HMGB1P在AM细胞中有效表达.与转染pGL3-HMGB1P组比较,转染pGL3-HMGB1P+LPS刺激组HMGB1启动子的转录活性(423±27),HMGB1蛋白(0.49±0.03)和mRNA(0.48±0.04)的表达均显著增加(P＜0.05);与转染pGL3-HMGB1P+LPS刺激组比较,转染pGL3-HMGB1P+LPS+异丙酚处理组HMGB1启动子的转录活性(207±13),HMGB1蛋白(0.17±0.02)和mRNA(0.13±0.02)的表达均显著降低(P＜0.05).结论 异丙酚在转录水平通过抑制LPS诱导HMGB1启动子的转录激活而影响HMGB1的表达.     

丙型肝炎病毒E1基因在COS-7中的表达

目的：了解丙型肝炎病毒（HCV）E1基因在真核细胞中的表达情况。方法：采用基因重组技术，构建含HCVE1基因的重组表达质粒pEE1/HisC-E1，经酶切和PCR鉴定后，用脂质体转染法将重组质粒导入COS-7进行表达，经蛋白印迹实验鉴定表达产物。结果：重组表达载体pEF1/HisC-E1在COS-7中获得表达，表达的E1糖蛋白约29kD，具有抗原性，结论：HCVE1基因在真核细胞高效表达，为进一步研究HCVE1糖蛋白的生物学特性奠定基础。     

丙型肝炎病毒非结构蛋白3的体外表达与纯化

目的构建丙型肝炎病毒非结构蛋白3(HCV NS3)表达质粒并在大肠杆菌中表达其全长蛋白。方法克隆HCV NS3的核酸序列3420-5312位点,插入pQE-11质粒的BamH1限制性酶切位点,将此重组质粒转入大肠杆菌表达,用Westernblot方法筛选阳性克隆,将含有额外拷贝的argU、ileY和leuW的tRNA基因的pACYA质粒引入HCV NS3表达系统以提高HCV NS3蛋白的表达量。收集培养扩增的大肠杆菌菌体,用卵白溶菌酶裂解,收集含有HCV NS3重组蛋白的不溶性包涵体,将包涵体充分洗涤后,溶于含10mmol/L二硫苏糖醇的缓冲液中。释放的可溶性蛋白用SDS-PAGE电泳分离、洗脱,用离心过滤方法浓缩,乙醇沉淀,重复洗涤去除内毒素。结果用此方法克隆的HCVNS3全长基因片段表达的重组蛋白分子量为69kD。含有额外拷贝的argU、ileY和leuW的tRNA基因的pACYA质粒引入HCV NS3表达系统后,HCV NS3蛋白的产出率可提高10倍以上。此方法生产的NS3纯化蛋白质产量,每升培养物为40mg。内毒素含量低于20EU/mg NS3蛋白。结论 HCV NS3与HCV的免疫逃逸及感染的慢性化有密切关系,是HCV的抗病毒治疗和疫苗研究的重要靶点,全长HCV NS3蛋白的体外合成为HCV研究提供了一个有用的工具。     

MTS1基因β启动子转录活性研究

目的 研究IMTSl基因β启动子在急性T淋巴细胞白血病细胞株中的转录激活情况，鉴定β启动子转录活性的功能片段区。方法 用DNA重组方法，构建MTS1基因口启动子3′端转录起始点相同，而5′端序列不同的7种pGL3重组质粒。用脂质体介导的基因瞬时转染法，将构建的重组质粒分别转染MTSl基因双等位缺失的Jurkat细胞株，检测pGL3重组质粒中荧光素酶报告基因的表达，观察β启动子在Jurkat细胞中的激活情况及其基础转录活性片段区。结果 成功构建了MTSI基因β启动子7种不同片段的重组质粒，它们在Jurkat细胞中均有转录活性，其中0．38kb Sac Ⅱ-Sac Ⅰ酶切片段是MTSl基因β启动子转录活性的基础片段。结论 IMTSlβ启动子可在Jurkat细胞中被激活。     

韶关市农村留守儿童孤独感状况调查

目的了解广东省韶关市农村地区留守儿童孤独感现状及其影响因素。方法对韶关市某地区两所农村小学3～6年级学生中的489名留守儿童采用儿童孤独量表和自编调查表进行问卷调查。结果17．6％留守儿童存在孤独感，不同性别孤独感发生率无差异性，不同年龄及不同年级间孤独感发生率差异均有极显著性（P〈0.01）；随年级增加，孤独感发生率呈下降趋势（X^2趋势=5．970，P〈0.05）。留守儿童孤独感与健康状况、学习成绩、学习困难程度、父母教育方式、父母间关系和老师教育方式等因素显著相关（P〈0.01～0．05）。结论农村地区留守儿童中存在一定程度的孤独感问题，老师和家长应以正确的态度和方法对待留守儿童，以减少其孤独感的发生。     

产科新生儿不同部位经皮测黄报警预值的可靠性观察

目的对比观察产科新生儿不同部位经皮胆红素（TCB）报警预值的可靠性。方法132例产科新生儿采取随机数字分组法分为正常产组和剖宫产组各66例,新生儿均于产后第4天同一时间点应用KJ8000经皮测黄仪分别测量额、胸、腹、额胸、额胸腹TCB值,TCB〉12．9mg／dl者,取得亲属同意抽取静脉血检测血清胆红素（SB）,对比分析不同部位TCB及其与sB值的差异。结果两组分别有17例或21例达到TCB报警预值。两组TCB或sB相同方法及相同部位比较,差异无统计学意义（P〉0．05）;两组TCB不同部位对比,额部值最低、胸部值最高,且与其他部位同组对比差异均有统计学意义（P〈0．01）;两组sB值对比差异无统计学意义（t=1．53,P〉0．05）,与不同部位TCB对比均以胸部数值差异无统计学意义（P〉0．05）,而与其他部位TCB两组差异均有统计学意义（P〈0．01）。结论正常产与剖宫产新生儿术后sB对比差异无意义;TCB动态监测以胸部结果更接近SB。     

Determination of loss of quality of life

Physiatrists are a valuable resource in legal settings, where assessment of functional capacity to perform work and of future medical needs must be determined. Physiatrists help determine what future medical care is needed to restore and maintain an individual at the maximum level of life function. This article focuses on the use of a quality of life (QOL) rehabilitation model, rather than a medical model, for enhancing functional performance, modifying environments, and facilitating patient coping. We discuss use of the QOL model to describe and influence a patient's physical, psychological, cognitive, vocational/economic, and social/leisure domains.     

护士选择性应用静脉留置针现状分析

[目的]了解护士选择性应用留置针的现状以及主要影响因素,为指导临床留置针合理应用提供理论依据。[方法]采用自设问卷对138名护士留置针选择性使用情况及其影响因素进行调查。[结果]约1／4的护士并不知道应选择性使用留置针,近60％的护士在实际工作中选择留置针的意识较差;护士选择性应用留置针的决策受多因素影响;不同科室、职称及是否具有带教资格选择性应用留置针的影响因素不尽相同;绝大部分护士希望参加选择性应用留置针相关内容的培训。[结论]临床护士操作前考虑留置针选择的意识有待加强。建议实施有针对性的培训以提高护士选择性应用留置针的能力。     

血液透析患者家庭护理提供者的生活质量调查

目的:了解江汉油田血液透析(血液透析)患者家庭护理提供者(护理者)的生活质量。方法:对60例血液透析患者的家庭护理提供者进行一般情况和生活质量综合评定问卷(QOLI-74)调查,并进行相关性和多因素回归分析。结果:家庭护理提供者各维度的主观生活满意度与其客观指标相关,但也与其需求、年龄、文化程度、与患者的关系有关。结论:客观状态是影响主观生活满意度的重要因素,同时应考虑护理者的需求、年龄、文化程度、与患者的关系对护理者主观生活满意度的影响。