共查询到20条相似文献,搜索用时 15 毫秒
1.
用部分补平法克隆乙型肝炎病毒preS/S基因 总被引:1,自引:1,他引:1
目的 探讨利用Klenow大片段对DNA末端作部分补平而使非匹配粘端形成匹配粘端的可行性。方法 用BamHI、XbalI消解载体pcDNA3,用BglII、HindIII从含乙型肝炎病毒全基因组质粒中切取HBVpreS/S基因片段。pcDNA3的XbalI及preS/S基因的HindIII切口端经Klenow大片段作部分补平后形成二碱基的互补粘端。连接修饰后的preS/S基因片段与pcDNA3并转化后筛选阳性克隆。结果 限制性内切酶分析显示perS/S基因被定向克隆于载体pcDNA3的预定位点。结论 部分补平法是连接非匹配DNA粘性末端的较好选择。 相似文献
2.
利用CD23cDNA全基因克隆pUCD976,分别以限制性内切酶EcoRI和XbaI酶切该重组质粒DNA,回收1.0kb的CD23cDNA全基因、HindⅢ酶切后回收3’端607bp的结合区段基因以及EcoRⅠ和HindⅡ酶切回收5’端403bp的调控区段基因。将各回收片段先以Klenow酶补平后,插入已补平的pZIP逆转录病毒载体BamHⅠ单切点,利用地高辛素标记的CD23cDNA全基因探针,以斑点核酸杂交筛选逆转录病毒重组体,结合用限制性内切酶BamHI和/或BglⅡ酶切鉴定插入方向,最终获得正、反向插入的CD23全基因-逆转录病毒重组体各2个,反向插入3’端和5’端部分基因片段的重组体分别为4个和1个。为进行CD23反义RNA的研究和真核表达CD23提供了可靠的物质基础。 相似文献
3.
pCDM8-GFP报告载体的构建及鉴定 总被引:3,自引:0,他引:3
1 实验资料 pDM 8 PBLcDNA文库由Jackson博士惠赠 ,pEGFP N3真核表达载体购自Clontech公司 .NotI、HindⅢ和T4DNA连接酶购自大连宝生物公司 .COS7细胞为本室冻存。pCDM8 GFP载体的构建方法参照文献 .提取 pCDM8 X(X表示载体中插入的未知cDNA片段 )和 pEGFP N3质粒 ,分别用NotI和HindⅢ进行双酶切 ,回收酶切片段 ,用T4连接酶进行连接 ,转化感受态宿主菌。挑单菌落培养 ,提取质粒用NotI和HindⅢ双酶切进行阳性克隆鉴定 .提取重组pCDM8 GFP载… 相似文献
4.
目的 扩增Epstein-Barr病毒(EBV)DNA多聚酶基因,构建高效表达载体。方法 根据EBV全基因序列,在EBV DNA多聚酶基因的3’、5’端设计一对附加EcoRⅠ和HindⅢ酶切位点的特异性引物,以B95-8细胞DNA为模板,采用改良PCR方法扩增出EBV DNA多聚酶基因(3044bp)。用EcoRⅠ和HindⅢ酶切该基因片断并克隆有达载体pMAL-p2,采用蓝白斑试验筛先阳性菌落。 相似文献
5.
柯萨奇B组病毒3型VP1基因疫苗免疫效果的研究 总被引:1,自引:0,他引:1
目的 为研制防治病毒性心肌炎的基因疫苗打下基础。 方法 以带有CVB3P1、P2区核酸序列的pGEM质粒为模板,用PCR方法克隆CVB3VP1基因cDNA,插入真核表达载体pcDNA3中的HindⅢ和XbaI位点之间,构建成重组质粒。经大量扩增纯化后,肌肉注射免疫BALB/c小鼠3次,用CVB3毒株攻击小鼠,取血及脾细胞检测其免疫效果。 结果 小鼠经3次免疫后,虽未测出明显免疫应答指标,但诱导了T 相似文献
6.
目的进一步研究bcr/abl融合基因在慢性粒细胞白血病(CML)中作用以及探索CML基因治疗的可能性。方法利用DNA重组技术将所设计、合成的针对bcr/abl融合转录本b3a2断裂点“锤头型”核酶的基因用HIndⅢ、pstⅠ酶切后克隆到pBluescriptⅡSK±质粒相应酶切位点获得pBRZ重组子。测定RZ基因序列与设计的一致。用BamHI和XhoI从pBRZ上切下RZ基因,定向克隆到逆转录病毒载体PLXSN,得到携带RZ基因的重组逆转录病毒载体PLRZXSN。通过脂质体介导的DNA转染法,将PLRZXSN导入慢性粒细胞白血病细胞株K562细胞,通过克隆分析法、RT-PCR、流式细胞仪、DNA电泳及电镜观察等方法检测核酶对K562细胞的影响。结果(1)核酶转染48h后,K562细胞克隆抑制率达85%;(2)核酶转染72h后K562细胞P210bcr—abl蛋白表达率比未转染组低52%;(3)核酶转染48h后,K562细胞bcr/ablmRNA表达水平比未转染组低73%;(4)核酶处理的K562细胞发生凋亡,表现为核酶转染K562细胞72h后,用流式细胞仪可检测到明显凋亡峰,凋亡率为37.1%,而空载体及脂 相似文献
7.
原发性肝癌中 HBV X、S、Pre-S、C 基因片段整合与 ras、myc 癌基因表达的关系 总被引:2,自引:1,他引:1
用地高辛标记的HBV基因组探针检测了66例肝细胞性肝癌(HCC)中HBV的存在状态,从中筛选出32例仅有HBVDNA整合的HCC作为研究对象,进一步检测了HBVX基因、S基因、Pre-S、C基因DNA片段的整合情况,并探讨了HBV4种基因亚片段整合与ras、myc癌基因表达的关系。结果显示,HBVX、S、Pre-S和C基因片段的整合率分别为87.5%(28/32)、62.5%(20/32)、62.5%(20/32)和25.0%(8/32)。p21ras、p62myc在HCC中的表达率分别为50.0%(20/40)、81.2%(26/32)。通过对HCC中4种HBV基因片段整合与p21ras、p62myc表达之间关系的研究,显示p62myc的表达与HBVX、Pre-S基因整合关系密切,p21ras的表达则主要与HBVX基因整合有关(P<0.05)。提示HBVX、Pre-SDNA片段在宿主细胞染色体上的整合可能直接或通过其蛋白启动myc和(或)ras癌基因的表达。 相似文献
8.
用PCR技术克隆hIL-12p35和p40两个亚基的cDNA,经酶切反应和琼脂电泳,获得的p35和p40基因的大小分别为0.77kb和1.1kb,SK质粒酶切后和p35,p40片段分别进行连接,形成SK^+-p35和SK^+-p40重组质粒,再经酶切反应,p35,p40片段先后连接至p2Bac质粒中,形成同时含有hIL-12两个亚基因的重组质粒p2Bac-hIL-12p35p40,SK^+-p35 相似文献
9.
10.
采用PCR方法,从HPV16型野毒株质粒中分离出HPV16L1(55597151bp)、HPV16E7C(682855bp)基因片段,采用PCR产物的TA克隆法,将L1、E7C分别插入pGEMTEasy载体,构建克隆载体pTAL1、pTAE7C。BamHⅠ、HindⅢ酶切pTAE7C,Bg1Ⅱ、ClaⅠ酶切pTAL1,回收L1、E7C片段,利用BamHⅠ、Bg1Ⅱ酶切产生相同粘末端的特点,产生L1E7C重组基因片段,将其克隆入质粒pBlueScriptsk,构建了pBSL1E7C重组克隆质粒,HindⅢ、XhoⅠ酶切pBSL1E7C,释放L1E7C基因片段,定向重组入pCA14腺病毒载体,成功构建真核表达载体HPV16L1E7C重组腺病毒载体:pCA14L1E7C,为研制HPV16L1E7C重组Ad5载体疫苗和HPV16L1E7C嵌合蛋白疫苗打下基础 相似文献
11.
目的:选择适当的载体,启动Ca^2+依赖分泌型磷脂酶A2(sPLA2)cDNA的表达,为进一步研究各种因素对该酶活性的影响奠定基础。方法:首先从sPLA2-pGEM7重组体(这一重组体不能在转染的真核细胞中表达)获得人sPLA2cDNA,克隆该片断进入中间载体BSSK(使sPLA2cDNA两端出现XbaI、Hind3酶切位点),选择antisense sPLA2-BSSK重组体进行扩增,双酶消化上 相似文献
12.
饰胶蛋白(Decorin)基因的cDNA克隆与表达 总被引:5,自引:0,他引:5
目的 通过基因克隆技术获得饰胶蛋白基因cDNA克隆并表达。为研究饰胶蛋白的生物学功能及应用打基础。方法 应用PCR技术从T细胞cDNA文库获得饰胶蛋白全长基因cDNA片段。并克隆到pUC19载体中,采用Sanger双脱氧末端终止法测定全部cDNA序列,将测序正确的饰胶蛋白cDNA序列插入pGEX-4T-1表达载体中,经BamHI和EcoRI双酶切后1.2%凝胶电泳鉴定,IPTG诱导表达产物经SDS-PAGE分析。结果 克隆的饰胶蛋白cDNA序列与GenBank中AF138300记载的序列完全一致,所表达的融合蛋白质分子量与理论计算值(65.6KD)也一致并为可溶性蛋白。结论 本研究成功地克隆了饰胶蛋白基因和表达了GST-Decorin融合蛋白。 相似文献
13.
研究若干不相关安徽个人体的四个凝血因子Ⅷ(FⅧ)基因内限制性片段长度多态性(RFLPs)(BclⅠ、HⅢ、XbaⅠ、MspⅠ)及四个基因旁侧的RFLPs(BstxⅠ、PstⅠ、MspⅠ、和AccⅠ)。BclⅠ/HindⅢ、XbaⅠ、MspⅠ基因内多态位点的杂合子频率分别为0.23、0.42、0.496。在接近内含子22处,发现了两个额外的XbaⅠ多态位点。在基因旁侧,应用BstxⅠ和PstⅠ发现安 相似文献
14.
建立稳定表达人组织型纤溶酶原激活剂(tissue-typeplasminogenactivator,t-PA)的细胞株。将t-pAcDNA连接在真核表达载体pcDNA3的HindⅢ位点,构建成重组质粒pcDNA3tPA,用磷酸钙介导的贴壁细胞转染法导入哺乳动物中国仓鼠卵巢(CHO)细胞中,G418筛选培养后形成阳性克隆。结果:培养液中重组t-pA(Recombinantt-pA,rt-pA)活性>6000IU/106细胞d-1.Northern杂交证实t-PAcDNA基因的转录。高表达细胞连续传代10次后,培液中rt-pA活性未见明显变化。结论:转染t-PAcDNA基因的CHO细胞已形成稳定的工程细胞。 相似文献
15.
T载体克隆乙肝病毒preS2+S基因的实验研究 总被引:2,自引:0,他引:2
将商品化真核表达载体pcDNA3改造成T载体pcDNA3-T,燕运用pcDNA3-T直接克隆也由PCR扩增的adw2亚型乙肝病毒preS2与S基因;结果:pcDN3-T与PCR产物的重组率高达70%。提示:该方法具有简便,省时等特点。 相似文献
16.
一种新的融合表达载体的构建 总被引:1,自引:0,他引:1
利用L-ansB基因片段构建了融合表达载体pEC,其中L-ansB基因中编码唯一酸水解位点的序列已通过定点突变消除,并在它的3’端引入了新的酸水解位点编码序列和方便外源基因插入的克隆位点BamHI和HindⅢ,外源基因可从克隆位点BamHI和HindⅢ处插入pEC中,表达的融合蛋白用酸水解法加工后仅被切割成一大一小两个片段,不会导致产物混杂,hGRF对它进行验 结果显示hGRF基因不仅能按正确的读 相似文献
17.
建立稳定有达人组织型纤维溶酶原激活剂珠细胞的株,将t-PAcDNA连接在真核表达载体pcDNA3的HindⅢ位点,构建成重组质粒pcDNA3tPA,用磷酸钙介导的贴壁细胞转染法导入哺乳动物中国仓鼠卵巢细胞中,G418筛选培养后形成阳性克隆。 相似文献
18.
采用5'加端PCR从K562cDNA文库中扩增出含锌指结构域的cDNA基因片段,重组至pGEM7ZDNA载体中。通过PCR及Southern印迹杂交初步从K562cDNA文库中筛选出9个含锌指基因片段的重组克隆。经DNA序列分析和基因库检索,发现有2个克隆的序列与巳知基因差异显著,有可能为新的锌指蛋白基因片段。 相似文献
19.
目的:构建人41BB胞膜外区hIgG1Fc融合蛋白真核表达载体。方法:PCR扩增人41BB胞膜外区和hIgG1Fc基因片段,用HindⅢ、PstI酶切41BB胞膜外区,PstI 、EcoR I 酶切hIgG1Fc ,HindⅢ、EcoRI 酶切pCDNA3,纯化后的酶切产物经T4DNA连接酶连接,转化大肠杆菌DH5α,氨苄青霉素筛选阳性克隆,PCR及测序鉴定。结果:连接反应产物转化大肠杆菌DH5α,氨苄青霉素筛选出多个阳性克隆;分别以针对41BB胞膜外区和hIgG1Fc的引物进行PCR扩增,电泳后观察到一558bp、708bp的特异性条带,与41BB胞膜外区和hIgG1Fc相符,提示构建成功。进一步测序分析证明克隆在pCDNA3 质粒中的41BB和hIgG1Fc序列和读码框架正确,无基因突变。结论:成功构建人41BB胞膜外区hIgG1Fc融合蛋白真核表达载体,为表达41BB融合蛋白奠定基础。 相似文献
20.
应用Sanger的双脱氧链终止法,对本室构建的人类白细胞介素2基因重组子pRET-90的440bpcDNA功能片段(NcoI克隆点的HgiAI-DraI片段)进行DNA碱基序列分析。结果表明:白细胞介素2cDNA功能片段按照正确的方向和翻译顺序连接在载体pET3d的NcoI-BamHI切点之间。 相似文献