用部分补平法克隆乙型肝炎病毒preS／S基因

目的 探讨利用Ｋｌｅｎｏｗ大片段对ＤＮＡ末端作部分补平而使非匹配粘端形成匹配粘端的可行性。方法 用ＢａｍＨＩ、ＸｂａｌＩ消解载体ｐｃＤＮＡ３,用ＢｇｌＩＩ、ＨｉｎｄＩＩＩ从含乙型肝炎病毒全基因组质粒中切取ＨＢＶｐｒｅＳ／Ｓ基因片段。ｐｃＤＮＡ３的ＸｂａｌＩ及ｐｒｅＳ／Ｓ基因的ＨｉｎｄＩＩＩ切口端经Ｋｌｅｎｏｗ大片段作部分补平后形成二碱基的互补粘端。连接修饰后的ｐｒｅＳ／Ｓ基因片段与ｐｃＤＮＡ３并转化后筛选阳性克隆。结果 限制性内切酶分析显示ｐｅｒＳ／Ｓ基因被定向克隆于载体ｐｃＤＮＡ３的预定位点。结论 部分补平法是连接非匹配ＤＮＡ粘性末端的较好选择。     

构建人CD23及其反义RNA的逆转录病毒表达重组体

利用ＣＤ２３ｃＤＮＡ全基因克隆ｐＵＣＤ９７６，分别以限制性内切酶ＥｃｏＲＩ和ＸｂａＩ酶切该重组质粒ＤＮＡ，回收１．０ｋｂ的ＣＤ２３ｃＤＮＡ全基因、ＨｉｎｄⅢ酶切后回收３’端６０７ｂｐ的结合区段基因以及ＥｃｏＲⅠ和ＨｉｎｄⅡ酶切回收５’端４０３ｂｐ的调控区段基因。将各回收片段先以Ｋｌｅｎｏｗ酶补平后，插入已补平的ｐＺＩＰ逆转录病毒载体ＢａｍＨⅠ单切点，利用地高辛素标记的ＣＤ２３ｃＤＮＡ全基因探针，以斑点核酸杂交筛选逆转录病毒重组体，结合用限制性内切酶ＢａｍＨＩ和／或ＢｇｌⅡ酶切鉴定插入方向，最终获得正、反向插入的ＣＤ２３全基因－逆转录病毒重组体各２个，反向插入３’端和５’端部分基因片段的重组体分别为４个和１个。为进行ＣＤ２３反义ＲＮＡ的研究和真核表达ＣＤ２３提供了可靠的物质基础。     

pCDM8-GFP报告载体的构建及鉴定

1　实验资料　ｐＤＭ 8 ＰＢＬｃＤＮＡ文库由Ｊａｃｋｓｏｎ博士惠赠 ,ｐＥＧＦＰ Ｎ3真核表达载体购自Ｃｌｏｎｔｅｃｈ公司 .ＮｏｔＩ、ＨｉｎｄⅢ和Ｔ4ＤＮＡ连接酶购自大连宝生物公司 .ＣＯＳ7细胞为本室冻存。ｐＣＤＭ8 ＧＦＰ载体的构建方法参照文献 .提取 ｐＣＤＭ8 Ｘ(Ｘ表示载体中插入的未知ｃＤＮＡ片段 )和 ｐＥＧＦＰ Ｎ3质粒 ,分别用ＮｏｔＩ和ＨｉｎｄⅢ进行双酶切 ,回收酶切片段 ,用Ｔ4连接酶进行连接 ,转化感受态宿主菌。挑单菌落培养 ,提取质粒用ＮｏｔＩ和ＨｉｎｄⅢ双酶切进行阳性克隆鉴定 .提取重组ｐＣＤＭ8 ＧＦＰ载…     

Epstein—Barr病毒DNA多聚酶基因扩增和表达载体构建

目的 扩增Ｅｐｓｔｅｉｎ－Ｂａｒｒ病毒（ＥＢＶ）ＤＮＡ多聚酶基因，构建高效表达载体。方法 根据ＥＢＶ全基因序列，在ＥＢＶ ＤＮＡ多聚酶基因的３’、５’端设计一对附加ＥｃｏＲⅠ和ＨｉｎｄⅢ酶切位点的特异性引物，以Ｂ９５－８细胞ＤＮＡ为模板，采用改良ＰＣＲ方法扩增出ＥＢＶ ＤＮＡ多聚酶基因（３０４４ｂｐ）。用ＥｃｏＲⅠ和ＨｉｎｄⅢ酶切该基因片断并克隆有达载体ｐＭＡＬ－ｐ２，采用蓝白斑试验筛先阳性菌落。     

柯萨奇B组病毒3型VP1基因疫苗免疫效果的研究

目的 为研制防治病毒性心肌炎的基因疫苗打下基础。 方法 以带有ＣＶＢ３Ｐ１、Ｐ２区核酸序列的ｐＧＥＭ质粒为模板，用ＰＣＲ方法克隆ＣＶＢ３ＶＰ１基因ｃＤＮＡ，插入真核表达载体ｐｃＤＮＡ３中的ＨｉｎｄⅢ和ＸｂａＩ位点之间，构建成重组质粒。经大量扩增纯化后，肌肉注射免疫ＢＡＬＢ／ｃ小鼠３次，用ＣＶＢ３毒株攻击小鼠，取血及脾细胞检测其免疫效果。 结果 小鼠经３次免疫后，虽未测出明显免疫应答指标，但诱导了Ｔ     

切割bcr/abl核酶的逆转录病毒载体的构建及其对K562细胞的影响

目的进一步研究ｂｃｒ／ａｂｌ融合基因在慢性粒细胞白血病（ＣＭＬ）中作用以及探索ＣＭＬ基因治疗的可能性。方法利用ＤＮＡ重组技术将所设计、合成的针对ｂｃｒ／ａｂｌ融合转录本ｂ３ａ２断裂点“锤头型”核酶的基因用ＨＩｎｄⅢ、ｐｓｔⅠ酶切后克隆到ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔⅡＳＫ±质粒相应酶切位点获得ｐＢＲＺ重组子。测定ＲＺ基因序列与设计的一致。用ＢａｍＨＩ和ＸｈｏＩ从ｐＢＲＺ上切下ＲＺ基因，定向克隆到逆转录病毒载体ＰＬＸＳＮ，得到携带ＲＺ基因的重组逆转录病毒载体ＰＬＲＺＸＳＮ。通过脂质体介导的ＤＮＡ转染法，将ＰＬＲＺＸＳＮ导入慢性粒细胞白血病细胞株Ｋ５６２细胞，通过克隆分析法、ＲＴ－ＰＣＲ、流式细胞仪、ＤＮＡ电泳及电镜观察等方法检测核酶对Ｋ５６２细胞的影响。结果（１）核酶转染４８ｈ后，Ｋ５６２细胞克隆抑制率达８５％；（２）核酶转染７２ｈ后Ｋ５６２细胞Ｐ２１０ｂｃｒ—ａｂｌ蛋白表达率比未转染组低５２％；（３）核酶转染４８ｈ后，Ｋ５６２细胞ｂｃｒ／ａｂｌｍＲＮＡ表达水平比未转染组低７３％；（４）核酶处理的Ｋ５６２细胞发生凋亡，表现为核酶转染Ｋ５６２细胞７２ｈ后，用流式细胞仪可检测到明显凋亡峰，凋亡率为３７．１％，而空载体及脂     

原发性肝癌中 HBV X、S、Pre-S、C 基因片段整合与 ras、myc 癌基因表达的关系

用地高辛标记的ＨＢＶ基因组探针检测了６６例肝细胞性肝癌（ＨＣＣ）中ＨＢＶ的存在状态，从中筛选出３２例仅有ＨＢＶＤＮＡ整合的ＨＣＣ作为研究对象，进一步检测了ＨＢＶＸ基因、Ｓ基因、Ｐｒｅ－Ｓ、Ｃ基因ＤＮＡ片段的整合情况，并探讨了ＨＢＶ４种基因亚片段整合与ｒａｓ、ｍｙｃ癌基因表达的关系。结果显示，ＨＢＶＸ、Ｓ、Ｐｒｅ－Ｓ和Ｃ基因片段的整合率分别为８７．５％（２８／３２）、６２．５％（２０／３２）、６２．５％（２０／３２）和２５．０％（８／３２）。ｐ２１ｒａｓ、ｐ６２ｍｙｃ在ＨＣＣ中的表达率分别为５０．０％（２０／４０）、８１．２％（２６／３２）。通过对ＨＣＣ中４种ＨＢＶ基因片段整合与ｐ２１ｒａｓ、ｐ６２ｍｙｃ表达之间关系的研究，显示ｐ６２ｍｙｃ的表达与ＨＢＶＸ、Ｐｒｅ－Ｓ基因整合关系密切，ｐ２１ｒａｓ的表达则主要与ＨＢＶＸ基因整合有关（Ｐ＜０．０５）。提示ＨＢＶＸ、Ｐｒｅ－ＳＤＮＡ片段在宿主细胞染色体上的整合可能直接或通过其蛋白启动ｍｙｃ和（或）ｒａｓ癌基因的表达。     

含人IL—12基因的重组质闰p2Bac—hIL—12p35p40的构建

用ＰＣＲ技术克隆ｈＩＬ－１２ｐ３５和ｐ４０两个亚基的ｃＤＮＡ，经酶切反应和琼脂电泳，获得的ｐ３５和ｐ４０基因的大小分别为０．７７ｋｂ和１．１ｋｂ，ＳＫ质粒酶切后和ｐ３５，ｐ４０片段分别进行连接，形成ＳＫ＾＋－ｐ３５和ＳＫ＾＋－ｐ４０重组质粒，再经酶切反应，ｐ３５，ｐ４０片段先后连接至ｐ２Ｂａｃ质粒中，形成同时含有ｈＩＬ－１２两个亚基因的重组质粒ｐ２Ｂａｃ－ｈＩＬ－１２ｐ３５ｐ４０，ＳＫ＾＋－ｐ３５     

锤头状核酶对不同长度mdrl mRNA的体外切割

目的：探讨膀胱癌多药耐药性逆转的新方法。方法：应用计算机地ｍｄｒｌ ｍＲＮＡ二级结构进行模拟，设计针对ｍｄｒｌ ｍＲＮＡ１９５９位ＧＵＣ的“锤头状”（Ｈａｍｍｅｒｈｅａｄ）核酶（Ｒｉｂｏｚｙｍｅ１，ＲＺ１）基因，定点克隆于质粒ｐＧＥＭＥＸ－１的ＢａｍＨ Ｉ和ＥｃｏＲ Ｉ位点上；将ｍｄｒｌ ｃＤＮＡ ８６４ ｂｐ的片段亚克隆于ｐＧＥＭＥＸ－１的ＨｉｎｄⅢ和ＥｃｏＲＩ位点上，ｍｄｒｌ ｃＤＮＡ １３８     

人乳头瘤病毒HPV16L1-E7C重组腺病毒载体的构建

采用ＰＣＲ方法,从ＨＰＶ１６型野毒株质粒中分离出ＨＰＶ１６Ｌ１（５５５９７１５１ｂｐ）、ＨＰＶ１６Ｅ７Ｃ（６８２８５５ｂｐ）基因片段,采用ＰＣＲ产物的ＴＡ克隆法,将Ｌ１、Ｅ７Ｃ分别插入ｐＧＥＭＴＥａｓｙ载体,构建克隆载体ｐＴＡＬ１、ｐＴＡＥ７Ｃ。ＢａｍＨⅠ、ＨｉｎｄⅢ酶切ｐＴＡＥ７Ｃ,Ｂｇ１Ⅱ、ＣｌａⅠ酶切ｐＴＡＬ１,回收Ｌ１、Ｅ７Ｃ片段,利用ＢａｍＨⅠ、Ｂｇ１Ⅱ酶切产生相同粘末端的特点,产生Ｌ１Ｅ７Ｃ重组基因片段,将其克隆入质粒ｐＢｌｕｅＳｃｒｉｐｔｓｋ,构建了ｐＢＳＬ１Ｅ７Ｃ重组克隆质粒,ＨｉｎｄⅢ、ＸｈｏⅠ酶切ｐＢＳＬ１Ｅ７Ｃ,释放Ｌ１Ｅ７Ｃ基因片段,定向重组入ｐＣＡ１４腺病毒载体,成功构建真核表达载体ＨＰＶ１６Ｌ１Ｅ７Ｃ重组腺病毒载体：ｐＣＡ１４Ｌ１Ｅ７Ｃ,为研制ＨＰＶ１６Ｌ１Ｅ７Ｃ重组Ａｄ５载体疫苗和ＨＰＶ１６Ｌ１Ｅ７Ｃ嵌合蛋白疫苗打下基础     

sPLA2cDNA表达载体的选择和亚克隆

目的：选择适当的载体，启动Ｃａ＾２＋依赖分泌型磷脂酶Ａ２（ｓＰＬＡ２）ｃＤＮＡ的表达，为进一步研究各种因素对该酶活性的影响奠定基础。方法：首先从ｓＰＬＡ２－ｐＧＥＭ７重组体（这一重组体不能在转染的真核细胞中表达）获得人ｓＰＬＡ２ｃＤＮＡ，克隆该片断进入中间载体ＢＳＳＫ（使ｓＰＬＡ２ｃＤＮＡ两端出现ＸｂａＩ、Ｈｉｎｄ３酶切位点），选择ａｎｔｉｓｅｎｓｅ ｓＰＬＡ２－ＢＳＳＫ重组体进行扩增，双酶消化上     

饰胶蛋白（Decorin）基因的cDNA克隆与表达

目的 通过基因克隆技术获得饰胶蛋白基因ｃＤＮＡ克隆并表达。为研究饰胶蛋白的生物学功能及应用打基础。方法 应用ＰＣＲ技术从Ｔ细胞ｃＤＮＡ文库获得饰胶蛋白全长基因ｃＤＮＡ片段。并克隆到ｐＵＣ１９载体中,采用Ｓａｎｇｅｒ双脱氧末端终止法测定全部ｃＤＮＡ序列,将测序正确的饰胶蛋白ｃＤＮＡ序列插入ｐＧＥＸ－４Ｔ－１表达载体中,经ＢａｍＨＩ和ＥｃｏＲＩ双酶切后１．２％凝胶电泳鉴定,ＩＰＴＧ诱导表达产物经ＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析。结果 克隆的饰胶蛋白ｃＤＮＡ序列与ＧｅｎＢａｎｋ中ＡＦ１３８３００记载的序列完全一致,所表达的融合蛋白质分子量与理论计算值（６５．６ＫＤ）也一致并为可溶性蛋白。结论 本研究成功地克隆了饰胶蛋白基因和表达了ＧＳＴ－Ｄｅｃｏｒｉｎ融合蛋白。     

安徽人FⅧ基因内及其旁侧RFLPs的研究

研究若干不相关安徽个人体的四个凝血因子Ⅷ（ＦⅧ）基因内限制性片段长度多态性（ＲＦＬＰｓ）（ＢｃｌⅠ、ＨⅢ、ＸｂａⅠ、ＭｓｐⅠ）及四个基因旁侧的ＲＦＬＰｓ（ＢｓｔｘⅠ、ＰｓｔⅠ、ＭｓｐⅠ、和ＡｃｃⅠ）。ＢｃｌⅠ／ＨｉｎｄⅢ、ＸｂａⅠ、ＭｓｐⅠ基因内多态位点的杂合子频率分别为０．２３、０．４２、０．４９６。在接近内含子２２处，发现了两个额外的ＸｂａⅠ多态位点。在基因旁侧，应用ＢｓｔｘⅠ和ＰｓｔⅠ发现安     

t－PA cDNA基因在CHO细胞中的稳定表达

建立稳定表达人组织型纤溶酶原激活剂（ｔｉｓｓｕｅ－ｔｙｐｅｐｌａｓｍｉｎｏｇｅｎａｃｔｉｖａｔｏｒ，ｔ－ＰＡ）的细胞株。将ｔ－ｐＡｃＤＮＡ连接在真核表达载体ｐｃＤＮＡ３的ＨｉｎｄⅢ位点，构建成重组质粒ｐｃＤＮＡ３ｔＰＡ，用磷酸钙介导的贴壁细胞转染法导入哺乳动物中国仓鼠卵巢（ＣＨＯ）细胞中，Ｇ４１８筛选培养后形成阳性克隆。结果：培养液中重组ｔ－ｐＡ（Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔｔ－ｐＡ，ｒｔ－ｐＡ）活性＞６０００ＩＵ／１０６细胞ｄ－１．Ｎｏｒｔｈｅｒｎ杂交证实ｔ－ＰＡｃＤＮＡ基因的转录。高表达细胞连续传代１０次后，培液中ｒｔ－ｐＡ活性未见明显变化。结论：转染ｔ－ＰＡｃＤＮＡ基因的ＣＨＯ细胞已形成稳定的工程细胞。     

T载体克隆乙肝病毒preS2＋S基因的实验研究

将商品化真核表达载体ｐｃＤＮＡ３改造成Ｔ载体ｐｃＤＮＡ３－Ｔ，燕运用ｐｃＤＮＡ３－Ｔ直接克隆也由ＰＣＲ扩增的ａｄｗ２亚型乙肝病毒ｐｒｅＳ２与Ｓ基因；结果：ｐｃＤＮ３－Ｔ与ＰＣＲ产物的重组率高达７０％。提示：该方法具有简便，省时等特点。     

一种新的融合表达载体的构建

利用Ｌ－ａｎｓＢ基因片段构建了融合表达载体ｐＥＣ,其中Ｌ－ａｎｓＢ基因中编码唯一酸水解位点的序列已通过定点突变消除,并在它的３’端引入了新的酸水解位点编码序列和方便外源基因插入的克隆位点ＢａｍＨＩ和ＨｉｎｄⅢ,外源基因可从克隆位点ＢａｍＨＩ和ＨｉｎｄⅢ处插入ｐＥＣ中,表达的融合蛋白用酸水解法加工后仅被切割成一大一小两个片段,不会导致产物混杂,ｈＧＲＦ对它进行验 结果显示ｈＧＲＦ基因不仅能按正确的读     

t—PAcDNA基因在CHO细胞中的稳定表达

建立稳定有达人组织型纤维溶酶原激活剂珠细胞的株，将ｔ－ＰＡｃＤＮＡ连接在真核表达载体ｐｃＤＮＡ３的ＨｉｎｄⅢ位点，构建成重组质粒ｐｃＤＮＡ３ｔＰＡ，用磷酸钙介导的贴壁细胞转染法导入哺乳动物中国仓鼠卵巢细胞中，Ｇ４１８筛选培养后形成阳性克隆。     

从K562细胞中克隆新的锌指蛋白cDNA基因的初步研究

采用５＇加端ＰＣＲ从Ｋ５６２ｃＤＮＡ文库中扩增出含锌指结构域的ｃＤＮＡ基因片段，重组至ｐＧＥＭ７ＺＤＮＡ载体中。通过ＰＣＲ及Ｓｏｕｔｈｅｒｎ印迹杂交初步从Ｋ５６２ｃＤＮＡ文库中筛选出９个含锌指基因片段的重组克隆。经ＤＮＡ序列分析和基因库检索，发现有２个克隆的序列与巳知基因差异显著，有可能为新的锌指蛋白基因片段。     

人4-1BB-hIgG1Fc融合蛋白真核表达载体的构建

目的：构建人４１ＢＢ胞膜外区ｈＩｇＧ１Ｆｃ融合蛋白真核表达载体。方法：ＰＣＲ扩增人４１ＢＢ胞膜外区和ｈＩｇＧ１Ｆｃ基因片段，用ＨｉｎｄⅢ、ＰｓｔＩ酶切４１ＢＢ胞膜外区，ＰｓｔＩ　、ＥｃｏＲ　Ｉ　酶切ｈＩｇＧ１Ｆｃ　，ＨｉｎｄⅢ、ＥｃｏＲＩ　酶切ｐＣＤＮＡ３，纯化后的酶切产物经Ｔ４ＤＮＡ连接酶连接，转化大肠杆菌ＤＨ５α，氨苄青霉素筛选阳性克隆，ＰＣＲ及测序鉴定。结果：连接反应产物转化大肠杆菌ＤＨ５α，氨苄青霉素筛选出多个阳性克隆；分别以针对４１ＢＢ胞膜外区和ｈＩｇＧ１Ｆｃ的引物进行ＰＣＲ扩增，电泳后观察到一５５８ｂｐ、７０８ｂｐ的特异性条带，与４１ＢＢ胞膜外区和ｈＩｇＧ１Ｆｃ相符，提示构建成功。进一步测序分析证明克隆在ｐＣＤＮＡ３　质粒中的４１ＢＢ和ｈＩｇＧ１Ｆｃ序列和读码框架正确，无基因突变。结论：成功构建人４１ＢＢ胞膜外区ｈＩｇＧ１Ｆｃ融合蛋白真核表达载体，为表达４１ＢＢ融合蛋白奠定基础。     

人类白细胞介素2基因重组子cDNA功能片段的碱基序列分析

应用Ｓａｎｇｅｒ的双脱氧链终止法，对本室构建的人类白细胞介素２基因重组子ｐＲＥＴ－９０的４４０ｂｐｃＤＮＡ功能片段（ＮｃｏＩ克隆点的ＨｇｉＡＩ－ＤｒａＩ片段）进行ＤＮＡ碱基序列分析。结果表明：白细胞介素２ｃＤＮＡ功能片段按照正确的方向和翻译顺序连接在载体ｐＥＴ３ｄ的ＮｃｏＩ－ＢａｍＨＩ切点之间。