人血白蛋白对近端肾小管上皮细胞ACE2表达的影响

目的： 研究人血白蛋白对人近端肾小管上皮细胞（HK-2）血管紧张素转换酶2（ACE2）及血管紧张素转换酶（ACE）表达的影响，探讨白蛋白对肾脏损害的机制。方法: 不同浓度人血白蛋白（0、1、5、10、15 g/L）分别加入到培养的人近端肾小管上皮细胞培养48 h，用RT-PCR法和Western blotting法分别检测HK-2细胞ACE2和ACE mRNA和蛋白表达。结果: 正常培养状态下HK-2细胞（空白对照组）存在ACE2 mRNA和蛋白表达，加入不同浓度（5-15 g/L）的人血白蛋白剂量依赖抑制HK-2细胞ACE2 mRNA和蛋白表达（P<0.01）。正常培养状态下HK-2细胞ACE mRNA和蛋白表达水平较低，随着加入白蛋白浓度的增加其表达水平逐渐升高，10 g/L白蛋白显著促进了HK-2细胞ACE mRNA和蛋白表达（P<0.05）。结论: 在体外培养的HK-2细胞存在ACE及ACE2 mRNA和蛋白表达，人血白蛋白可抑制其ACE2表达而促进ACE表达,这可能是白蛋白促肾小管间质损伤及肾小球硬化、间质纤维化的机制之一。     

核心蛋白聚糖对TGF阻诱导的人肾小管上皮细胞产生胶原的影响

目的：探讨核心蛋白聚糖对转化生长因子β1（TGFβ1）诱导的人近端肾小管上皮细胞（HK-2）I、Ⅲ型胶原表达的影响。方法：将体外培养的HK-2细胞分为：（1）阴性对照组；（2）10μg／L TGFβ1组；（3）TGFβ1（10μg/L）＋（10μg/L）核心蛋白聚糖组；（4）TGFβ1（10μg／L）＋（100μg/L）核心蛋白聚糖组。倒置显微镜下观察加入刺激因子48h后肾小管上皮细胞的细胞形态学改变；应用逆转录-聚合酶链反应（RT-PCR）观察不同浓度的核心蛋白聚糖对HK-2细胞I、Ⅲ型胶原表达变化的影响。结果：加入刺激因子48h后，（1）组细胞形态与正常HK-2细胞形态基本一致，大部分仍为椭圆形；（2）组细胞形态发生明显的变化，大部分细胞由椭圆形拉长为长梭形；（3）和（4）组，梭形样细胞明显减少，尤其是（4）组梭形样细胞减少更为明显。（2）组HK-2细胞I型胶原mRNA表达上升到（1）组的27.86倍，Ⅲ型胶原mRNA的表达上升到（1）组的21.83倍。（3）和（4）组与（2）组相比，I型胶原mRNA的表达分别下降了36.39％、53.36％，Ⅲ型胶原mRNA的表达分别下降了26.35％、47.96％（P〈0.05），但仍未下降到正常水平。结论：核心蛋白聚糖能抑制TGFβ1诱导的人近端肾小管上皮细胞I、Ⅲ型胶原的表达，可能是核心蛋白聚糖抑制肾间质纤维化的原因之一。     

IL-18对HK-2细胞E-钙黏蛋白表达的作用及其可能的胞内信号途径

目的:探讨白细胞介素-18(IL-18)是否通过核因子-κB(NF-κB)细胞内信号转导途径诱导近端肾小管上皮细胞转分化.方法:实验分单纯IL-18刺激组和SN50预孵育组, 单纯IL-18 刺激组采用终浓度分别为0、 1、 10、 100 μg/L的IL-18处理人肾小管上皮细胞株(HK-2细胞)72 h, SN50预孵育组在此基础上预先应用终浓度为100 mg/L的NF-κB特异性抑制剂 SN50预处理细胞0.5 h.然后应用免疫细胞化学法检测HK-2细胞E-cadherin的表达百分数;采用RT-PCR法检测HK-2细胞E-cadherin mRNA的表达.结果:NF-κB特异性抑制剂SN50可拮抗IL-18对HK-2细胞E-cadherin mRNA和蛋白表达的抑制作用.结论:IL-18可通过核因子-κB(NF-κB)细胞内信号转导途径诱导近端肾小管上皮细胞转分化.     

核心蛋白聚糖对TGFβ1诱导的人肾小管上皮细胞产生胶原的影响

目的:探讨核心蛋白聚糖对转化生长因子β1(TGFβ1)诱导的人近端肾小管上皮细胞(HK-2)Ⅰ、Ⅲ型胶原表达的影响。方法:将体外培养的HK-2细胞分为:(1)阴性对照组;(2)10μg/LTGFβ1组;(3)TGFβ1(10μg/L) (10μg/L)核心蛋白聚糖组;(4)TGFβ1(10μg/L) (100μg/L)核心蛋白聚糖组。倒置显微镜下观察加入刺激因子48h后肾小管上皮细胞的细胞形态学改变;应用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)观察不同浓度的核心蛋白聚糖对HK-2细胞Ⅰ、Ⅲ型胶原表达变化的影响。结果:加入刺激因子48h后,(1)组细胞形态与正常HK-2细胞形态基本一致,大部分仍为椭圆形;(2)组细胞形态发生明显的变化,大部分细胞由椭圆形拉长为长梭形;(3)和(4)组,梭形样细胞明显减少,尤其是(4)组梭形样细胞减少更为明显。(2)组HK-2细胞Ⅰ型胶原mRNA表达上升到(1)组的27.86倍,Ⅲ型胶原mRNA的表达上升到(1)组的21.83倍。(3)和(4)组与(2)组相比,Ⅰ型胶原mRNA的表达分别下降了36.39%、53.36%,Ⅲ型胶原mRNA的表达分别下降了26.35%、47.96%(P<0.05),但仍未下降到正常水平。结论:核心蛋白聚糖能抑制TGFβ1诱导的人近端肾小管上皮细胞Ⅰ、Ⅲ型胶原的表达,可能是核心蛋白聚糖抑制肾间质纤维化的原因之一。     

15d-PGJ2对肾小管上皮细胞CD40及RANTES表达的影响

目的：观察过氧化物酶体增殖物激活受体γ（PPARγ）激动剂15d-PGJ2对干扰素-γ（IFN-γ）和肿瘤坏死因子α（TNF-α）诱导的人近端肾小管上皮细胞（HK-2）CD40和RANTES表达的影响。方法：体外培养人近端肾小管上皮细胞株，分组如下：（1）正常对照组；（2）IFN-γ（50μg／ml）组；（3）TNF-α（10ng／ml）组；（4）IFN-γ（50μg/ml）＋TNF—α（10ng／ml）组；（5）IFN-γ（50μg／ml）＋TNF-α（10ng／ml）分别加1、3、5μmol／L15d-PGJ2组；（6）IFN-γ＋TNF-α．刺激＋15d-PGJ2（5μmol／L）＋GW9662（PPARγ特异拮抗剂）1μmol／L组。GW9662和15d-PGJ2分别在IFN-γ和TNF-α刺激前3和2小时加入。分别采用RT-PCR、流式细胞仪（FACS）和酶联免疫法（ELISA）检测CD40和RANTES基因和蛋白的表达水平。结果：正常HK-2细胞中，CD40、RANTES有基础水平表达。IFN-γ能显著上调HK-2细胞CD40蛋白的表达；TNF-α单独刺激对CD40表达无显著影响，但能增强IFN-γ的刺激效应。IFN-γ＋TNF-α显著增加HK-2细胞RANTES的表达和分泌。15d—PGJ2呈剂量依赖式在基因和蛋白水平显著抑制IFN-γ＋TNF-α．诱导的CIMO和RANTES的表达。加入PPARγ特异拈抗剂GW9662后，能够部分逆转15d-PGJ，对CIMO和RANTES表达的抑制效应，但并不能完全阻断其作用。结论：15d-PGJ2部分通过PPARγ介导的信号途径参与抑制IFN-γ＋TNF-α．诱导的人近端肾小管上皮细胞CD40和RANTES的表达，从而在肾脏局部发挥免疫调节和抗炎作用。     

脂多糖对人近端肾小管上皮细胞IL-18及其受体复合物表达的影响

观察脂多糖(LPS)对体外培养人近端肾小管上皮细胞IL-18及其受体表达的影响,以初步探讨IL-18在肾小管-间质炎症损伤过程中的作用。以不同浓度LPS(0.01、0.1、1、5、10μg/ml)处理人近端肾小管上皮细胞株(HK-2)24 h、36 h及48 h,然后应用RT-PCR及ELISA测定IL-18及其受体α链(IL-18Rα)和β链(IL-18Rβ)mRNA及蛋白的表达水平变化。静息培养的HK-2细胞表达IL-18 m RNA和蛋白、IL-18Rα和IL-18Rβm RNA,LPS促进HK-2细胞IL-18 mRNA和蛋白的表达及IL-18Rα和IL-18RβmRNA的表达,并呈剂量和时间依赖趋势。肾小管上皮细胞可能既是IL-18的产生者,又是IL-18的靶细胞之一,炎症状态下肾小管上皮细胞通过IL-18自分泌方式参与肾小管-间质的炎症损伤过程。     

缺氧-复氧诱导HK-2细胞黏附窒息新生儿中性粒细胞的作用机制

目的：探讨在缺氧／复氧（hypoxia／reoxygenalion，H／R）情况下，人近曲肾小管上皮细胞（HK-2）对窒息新生儿中性粒细胞黏附作用的影响及其胞内信号传导机制。方法：以人近曲肾小管上皮细胞（HK-2）为研究对象，实验共分为6个组：缺氧4、12、24h组和缺氧24h后复氧4、12、24h组，每个实验组均设立空白对照组和吡咯烷二硫氨基甲酸（PDTC）干预组。采用液体石蜡覆盖法造成缺氧环境，分别对上述各组用生化法检测培养上清中乳酸脱氢酶（LDH）含量、测细胞悬液中髓过氧化物酶（MPO）活性，判断肾小管上皮细胞介导窒息新生儿中性粒细胞的黏附能力；免疫组化法检测HK-2细胞ICAM-1的表达。结果：与对照组相比，HK-2细胞经过缺氧／复氧处理后，LDH含量升高，MPO活性增加，细胞膜表面的ICAM-1表达明显增高，在缺氧24h达高峰，具有统计学意义（P＜0．05），而PDTC干预组上述指标，无统计学意义（P＞0．05）。结论：缺氧／复氧可刺激人近曲肾小管上皮细胞诱导窒息新生儿中性粒细胞黏附作用，其胞内信号机制可能涉及到NF—KB活化，进而诱导小管上皮细胞表面ICAM-1表达和合成增多。     

极低密度脂蛋白对HK-2细胞hUAT基因表达的影响

 目的 观察不同浓度极低密度脂蛋白（VLDL）是否调节肾小管上皮细胞（HK-2细胞）人尿酸盐转运子（hUAT）mRNA的表达。方法 根据培养液中所含VLDL浓度的不同，将HK-2细胞分为：①仅使用DMEM/F-12组（对照组）；②DMEM/F-12+ 50 μg/ml VLDL组（V1组）；③DMEM/F-12+100 μg/ml VLDL组（V2组）；④DMEM/F-12+200 μg/ml VLDL组（V3组）；⑤DMEM/F-12+400 μg/ml VLDL组（V4组）。每组均培养 6瓶细胞。上述细胞在不同培养液中分别培养48 h。采用实时荧光定量PCR检测HK-2细胞中hUAT mRNA的相对表达量（2^ΔΔCt法）。结果 所有标本均能检测到hUAT mRNA的表达，但V1～V4组hUAT mRNA表达水平均明显低于对照组，其中，VLDL最低浓度（50 μg/ml）组hUAT mRNA表达水平为对照组的64%，VLDL最高浓度（400 μg/ml）组hUAT mRNA表达水平仅为对照组的24%。结论 VLDL下调hUAT mRNA表达，VLDL的这种作用可能与脂代谢紊乱易合并高尿酸血症有关。     

P13K/Akt信号通路在白蛋白诱导肾小管上皮细胞转化生长因子β1表达中的作用

目的 研究白蛋白对人肾小管上皮细胞(HK-2)分泌转化生长因子β1(TGF-β1)的影响,以及P13K/Akt信号通路在这一过程中的作用.方法 体外培养HK-2细胞,分为对照组、白蛋白(BSA)组和白蛋白加抑制剂(BSA+Ly294002)组.分别于培养12、24、48 h后,用MTT法检测HK-2细胞的增殖;RT-PCR检测HK-2细胞TGF-β1 mRNA的表达;Western印迹测定HK-2细胞TGF-β1和磷酸化的PI3K(p-PI3K)、Akt(p-Akt)蛋白分泌.结果 白蛋白可明显诱导HK-2细胞增殖(P<0.05),诱导后12 hBSA组与对照组比较,TGF-β1 mRNA表达明显上调(0.472±0.025比0.233±0.021,P<0.05);TGF-β1蛋白明显上调(296±20.1比100±13.2,P<0.05);p-PI3K、p-Akt蛋白表达显著增加(P<0.05).加Ly294002 12 h时HK-2增殖受抑制;48 h时TGF-β1 mRNA、蛋白和p-PI3K、P-Akt蛋白的表达也受到抑制(均为P<0.05).结论 白蛋白通过活化PI3-K/Akt信号转导通路诱导肾小管上皮细胞产生TGF-β1.     

IL-18对肾小管上皮细胞表型转化的影响

目的：研究IL-18对体外培养肾小管上皮细胞表型转化的影响，以明确IL-18在慢性肾脏疾病中的可能作用机制。方法：应用体外细胞培养技术培养人肾小管上皮细胞侏（HK-2）。应用RT-PCR技术检测α-平滑肌肌动蛋白（α-SMA）、转化生长因子-β1（TGF-β1）mRNA水平，用免疫细胞化学方法（ICC）及Western blot技术分别检测IL-18对HK-2细胞表达仪-SMA蛋白的影响。结果：（1）IL-18可促进HK-2细胞表达α-SMA、TGF-β1 mRNA，且两者之间呈正相关（P〈0．05）。（2）IL-18增加α-SMA阳性HK-2细胞百分数（P〈0．05）。（3）IL-18使HK-2细胞α-SMA蛋白表达水平增加。结论：IL-18可剂量和时间依赖性地促进肾小管上皮细胞转分化为肌成纤维细胞，促进肾间质纤维化。     

Polarized M2c macrophages have a promoting effect on the epithelial-to-mesenchymal transition of human renal tubular epithelial cells

This study planned to explore the effects of M2c macrophages on epithelial-to-mesenchymal transition (EMT) of human renal proximal tubular epithelial cells (HK-2). Human monocytic leukaemia cells were induced by TPA and IL-10 to differentiate M2c macrophages. Subsequently HK-2 cells were co-cultured with the M2c macrophages in Transwell chamber. After 48?h of co-culturing the HK-2 cells were detected in the mRNA and protein expression of E-cadherin, α-SMA and vimentin with RT-PCR, immunofluorescence and Western blot respectively. Besides, the migration ability of the HK-2 cells was estimated with Transwell migration assay. ANOVA was used to compare the difference between groups and Student's t-test to conduct multiple comparisons of two groups. P?<?0.05 was considered statistically significant. The results showed that the mRNA and protein expression of α-SMA and vimentin of the HK-2 cells were increased but the E-cadherin decreased significantly after 48?h co-culturing with the M2c macrophages (P?<?0.05 or P?<?0.01). And the migration ability of HK-2 cells were also increased significantly (P?<?0.05). It may be concluded that polarized M2c macrophages may have a promoting effect on the EMT of HK-2 cells.     

激活法尼酯X受体上调核心蛋白聚糖表达对肾小管上皮细胞转分化的作用

目的研究激活法尼酯X受体(FXR)对核心蛋白聚糖(decorin)表达的变化及其对肾小管上皮细胞-间充质转分化的影响。方法 (1)采用不同浓度的FXR特异性激动剂CDCA及拮抗剂Guggulsterones处理肾小管上皮细胞(HK-2),观察decorin的mRNA和蛋白表达的变化;(2)将HK-2细胞分为对照组,TGF-β1诱导组(20 ng/ml),TGF-β1诱导加CDCA组(100μmol/L)和TGF-β1诱导加CDCA、Guggulsterones共处理组,48 h后观察各组细胞的形态变化,检测各组decorin、E-cadherin和α-SMA的mRNA和蛋白表达的情况。结果 (1)CDCA激活HK-2细胞FXR,decorin的mRNA和蛋白表达升高,且呈剂量依赖。在100μmol/L CDCA和不同浓度Guggulsterones共处理HK-2细胞,随着Guggulsterones浓度升高,decorin的mRNA和蛋白表达逐渐减低;(2)RT-PCR和Western blot显示,decorin在对照组、TGF-β1组无表达,在TGF-β1+CDCA组明显上调(与TGF-β1组比,P<0.05),在TGF-β1+CDCA+Guggulsterones组表达显著下降;E-cadherin在对照组高表达,在TGF-β1组显著下调,在TGF-β1+CDCA组显著上调(与TGF-β1组比,P<0.05),在TGF-β1+CDCA+Guggulsterones组表达显著下降;α-SMA在对照组无表达,在TGF-β1组显著上调,在TGF-β1+CDCA组显著下调(与TGF-β1组比,P<0.05),在TGF-β1+CDCA+Guggulsterones组表达显著上调。结论 CDCA激活肾小管上皮细胞FXR能够通过上调decorin的表达,从而抑制TGF-β1诱导的肾小管上皮细胞-间充质转分化。     

炎症对脂肪酸负荷的肾细胞FAT/CD36表达的影响

目的: 观察炎症是否干扰脂肪酸负荷的肾细胞[人系膜细胞(HMCs)和肾小管上皮细胞HK-2]脂肪酸转运蛋白(FAT/CD36)的表达。方法: 分别给予不同浓度软脂酸(0 mmol/L、0.02 mmol/L、0.04 mmol/L、0.08 mmol/L、0.16 mmol/L、0.32 mmol/L)处理HMCs和HK-2细胞24 h。采用实时定量PCR和Western blotting方法检测细胞FAT/CD36的mRNA及蛋白的表达。进一步选取0.04 mmol/L软脂酸联合炎症因子(25 μg/L TNF-α或20 μg/L IL-6)处理肾细胞24 h后,观察炎症因子对肾细胞FAT/CD36 mRNA及蛋白表达的影响;油红O染色及酶比色法检测细胞甘油三酯(TG)水平;ELISA检测细胞游离脂肪酸(FFA)含量。结果: 软脂酸呈浓度依赖性上调HMCs和HK-2细胞FAT/CD36 mRNA和蛋白表达。炎症因子明显刺激脂肪酸负荷的肾细胞FAT/CD36 mRNA和蛋白表达进一步增加。油红O染色及胞内TG和FFA含量测定显示炎症因子促进肾细胞脂质积聚。结论: 炎症上调脂肪酸负荷的肾细胞FAT/CD36表达,加重胞内脂质积聚。     

干扰维生素D3上调蛋白1通过调控Shh影响高糖诱导的肾小管上皮细胞凋亡

目的:探讨维生素D3上调蛋白1(VDUP-1)对高糖诱导的肾小管上皮细胞凋亡的影响及机制。方法:人近端肾小管上皮HK-2细胞用高糖处理后,real-time PCR和Western blot检测细胞中VDUP-1的水平。HK-2细胞转染VDUP-1小干扰RNA,real-time PCR和Western blot检测抑制效果。高糖条件培养VDUP-1表达下调的HK-2细胞,流式细胞术检测细胞凋亡,试剂盒检测细胞中caspase-3和caspase-9的活性,ELISA法测定培养上清液中肿瘤坏死因子α(TNF-α)含量,Western blot检测细胞中音猬因子(Shh)信号通路关键蛋白Patched 1 (Ptch1)、Smoothened (Smo)、锌指蛋白Gli2和Shh的水平。用外源性Shh处理HK-2细胞,Western blot检测Ptch1、Smo和Gli2的水平。用外源性Shh处理VDUP-1表达下调的HK-2细胞,高糖处理后,流式细胞术检测细胞凋亡,试剂盒检测细胞中caspase-3和caspase-9的活性,ELISA法测定培养液上清中TNF-α含量。结果:高糖处理后,HK-2细胞中VDUP-1的mRNA和蛋白水平升高(P 0. 05)。转染VDUP-1小干扰RNA后,HK-2细胞中VDUP-1的mRNA和蛋白水平下降(P 0. 05)。与正常培养的细胞相比,高糖处理后HK-2细胞凋亡率显著升高,细胞中caspase-3和caspase-9活性明显升高,TNF-α含量亦明显升高(P 0. 05);下调VDUP-1表达后的HK-2细胞经高糖处理后细胞凋亡率显著降低,细胞中caspase-3和caspase-9活性也明显降低(P 0. 05)。高糖培养后细胞中Ptch1、Smo、Gli2和Shh的蛋白水平下降,而下调VDUP-1表达部分拮抗高糖对HK-2细胞中Ptch1、Smo、Gli2和Shh表达的影响。外源性Shh可以促进细胞中Ptch1、Smo和Gli2的表达,抑制高糖诱导的HK-2细胞凋亡和分泌TNF-α,与下调VDUP-1共同抑制高糖诱导的肾小管上皮细胞凋亡。结论:干扰VDUP-1表达可能通过激活Shh信号通路抑制高糖诱导的肾小管上皮细胞凋亡和分泌TNF-α。