RT—PCR扩增A组轮状病毒VP7片段及其扩增产物的克隆

选用与Ａ组人类轮状病毒（ｈｕｍａｎｒｏｔａｖｉｎｅｓｖｉｒｕｓ，ＨＲＶ）编码ＶＰ７两端的保守序列互补的引物，采用ＲＴ－ＰＣＲ技术得到其全长ｃＤＮＡ，用平端连接克隆法将该片段连接于ｐｕｃ１９质粒中，然后转染ＪＭ１０３大肠杆菌，为进一步研究轮状病毒的变异、重组、毒力、分子流行病及重要抗原核苷酸序列和有效疫苗研制尊定基础     

应用RT—PCR法快速检测柯萨奇病毒基因

柯萨奇Ｂ组病毒（ＣｏｘｓａｃｋｉｅＢｖｉｒｕｓｅｓ，ＣＢＶ）属于小ＲＮＡ病毒科，肠道病毒属。是人类病毒性心肌炎的主要病原体，亦可引起无菌性脑膜炎、发热、肺炎、疲劳综合征等疾病〔１〕，愈来愈受到人们重视。ＣＢＶ感染的诊断一般采用ＥＬＩＳＡ和中和抗体法检...     

图象分析仪在定量RT—PCR方法中的应用

ＲＴ－ＰＣＲ结合图像分析技术进行微量核酸样品的相对定量和绝对定量，具有较高的灵敏度和精确度，通过非竞争ＰＣＲ求微量样品的相对量，竞争ＰＣＲ求样品的绝对含量。因此，ＲＴ－ＰＣＲ结合图像分析技术适合于ｍＲＮＡ水平上基因表达的分析。     

实时定量RT—PCR技术检测白血病融合基因的临床应用价值

目的评估实时定量RT—PCR技术检测白血病融合基因在辅助白血病临床诊断和药物疗效判定方面的价值。方法56例慢性粒细胞白血病（CML）患者，其中男性31例，女性25例，中位年龄54（18～80）岁；9例急性早幼粒细胞白血病（APL）患者，其中男性4例，女性5例，中位年龄47（2～64）岁。另有22例非CML或APL患者（男性12例,女性10例，年龄6～55岁）。应用实时定量RT—PCR技术检测临床患者骨髓或外周血单个核细胞中白血病融合基因M—bcr／abl或PMIdRARα的表达，结合临床资料进行分析。结果①56例CML患者的M-bcr／abl融合基因检测阳性率为96．4％（54／56）；9例APL患者的PMIdRARa融合基因检测阳性率为77．8％（7／9）。②5例CML患者应用甲磺酸-伊马替尼治疗后定量检测M—bcr／abl融合基因的拷贝数较治疗前明显降低或转阴（4／5），伊马替尼治疗CML效果优于应用羟基脲和干扰素治疗的患者。结论实时定量RT—PCR技术操作简便，检测白血病融合基因的准确性高。在辅助临床诊断和白血病患者药物疗效判定方面都有较大的应用价值。     

应用原位PCR和原位杂交技术检测宫颈癌及癌前病变组织中HPV DNA

人乳头瘤病毒 (ＨＰＶ)感染与宫颈癌的关系已获公认。仍有许多学者采用原位杂交 (ＩＳＨ) ,斑点杂交和ＰＣＲ技术对其进行深入研究〔1,2〕。我们采用原位ＰＣＲ和ＩＳＨ技术对宫颈癌及宫颈上皮内瘤变 (ＣＩＮ)组织中的ＨＰＶＤＮＡ进行对比检测 ,探讨ＩＳＰＣＲ技术检测石蜡切片中ＨＰＶＤＮＡ的敏感性。1　材料和方法1.1　材料　收集解放军 145医院和第四军医大学西京医院病理科活检及手术切除的宫颈癌标本 6 6例 ,其中Ⅰ级鳞癌16例 ,Ⅱ级 36例 ,Ⅲ级 14例 ,ＣＩＮ2 5例 (ＣＩＮ110例 ,ＣＩＮ2 9例 ,ＣＩＮ3 6例 ) ,慢性宫颈炎 10例 ,标本…     

间接法原位PCR检测喉鳞癌组织HPV感染

建立稳定的原位ＰＣＲ方法，并探讨ＨＰＶ感染与喉鳞癌发生的关系。方法采用免疫组化、原位杂变、ＰＣＲ和间接原位ＰＣＲ技术，检测了５０例喉鳞癌中的ＨＰＶ感染情况。结果免疫组化衣壳抗原阳性者６例（１２％），原位杂交阳性者１３例（２６％），ＰＣＲ阳性者１０例（２０％），原位ＰＣＲ阳性者１７例（３４％），综合上述方法的检出率为４２％（２１例）。结论ＨＰＶ感染与喉癌有着明显的关系，间接原位ＰＣＲ在检测ＨＰＶ感染     

PCR—RFLP检测胰腺癌石蜡组织中K—ras基因点突变

ＰＣＲ－ＲＦＬＰ检测胰腺癌石蜡组织中Ｋ－ｒａｓ基因点突变肖尚喜１曹立宇２张军１方有兵１＊本课题由安徽省卫生厅医学科研基金资助（９４－０４）作者单位：１安徽医科大学第一附属医院检验科，合肥２３００２２２安徽医科大学病理学教研室，合肥２３００３２作者简介...     

定量RT—PCR法检测乳腺癌前哨淋巴结CK19的研究

目的探讨定量RT—PCR法检测细胞角蛋白（CK19）在乳腺癌前哨淋巴结（SLN）中的表达，提高前哨淋巴结活检中微转移的检出率。方法采用常规病理检查法（HE染色）和定量RT—PCR法检测了40例乳腺癌患者SLN的CK19的表达量，同时选取10例来源于胃肠道的良性病变淋巴结作为定量RT—PCR检测的对照组。结果CK19在良性病变的淋巴结中没有表达。常规病理检查的敏感度为42．9％（9／21），假阴性为57．1％（12／21）．准确率为70．0％（28／40）。定量RT—PCR法检测出常规病理未检出的微小转移病例12例，敏感度为95．2％（20／21），假阴性为4．8％（1／21），准确率为97．5％（39／40）。结论前哨淋巴结活检可有效判断乳腺癌腋淋巴结转移状态，应用定量RT—PCR法检测CK19在SLN中的表达，可提高敏感度及准确率。     

定量测定IL—4和IFN—γmRNA的RT—竞争PCR法及其 …

目的 建立测定ＩＦＮ－γｍＲＮＡ和ＩＬ－ｍＲＮＡ和ＲＴ－竞争ＰＣＲ方法，探讨体外诱生条件并作临床初步应用。方法 用自行设计和制备的ＩＦＮ－γ ＣＤＮＡ和ＩＬ－４ ｅＤＮＡ竞争模板，作ＲＴ－竞争ＰＣＲ，对健康人经ＰＭＡ和ｃａｌｃｉｕｍ ｉｏｎｏｐｈｏｒｅ（钙离子载体）诱导的ＰＢＭＣ、１１例健康人和１３例哮喘患者ＰＢＭＣ作ＩＦＮ－γ ｍＲＮＡ和ＩＬ－４ ｍＲＮＡ定量测定。结果 在建立了准确的定量测定ｍ     

重组PCR构建bcr—abl mRNA竞争RT—PCR内标物

目的竞争ＰＣＲ可用于ｍＲＮＡ的定量测定，为了得到白血病中ｂｃｒ－ａｂｌｍＲＮＡ定量ＰＣＲ的竞争内标物。方法利用重组ＰＣＲ技术，实施对ｂ３ａ２型ｂｃｒ－ａｂｌｃＤＮＡ中一２７６ｂｐ片段的缺失法定点突变。结果经ＤＮＡ序列分析证实，重组后的ｃＤＮＡ片段与重组前相比，５′和３′端大部分序列相同，仅中间５５ｂｐ的部分序列缺失，同时引入１９ｂｐ外源ＤＮＡ片段，即净缺失３６ｂｐ，得到２４０ｂｐ的重组ＰＣＲ产物。较ｂ２ａ２型ｂｃｒ－ａｂｌｃＤＮＡ相应的２０１ｂｐ扩增片段长３９ｂｐ，使之适于作为ｂ３ａ２和ｂ２ａ２型两类ｂｃｒ－ａｂｌｍＲＮＡ定量ＰＣＲ的通用内标物。结论表明重组ＰＣＲ是一种获得靶基因的竞争性内标物的简便而可靠的方法     

副粘病毒Tianjin株RT—PCR检测方法的建立及初步应用

目的建立检测副粘病毒Tianjin株的RT-PCR方法,为临床标本的检测提供参考依据。方法根据副粘病毒Tianjin株F蛋白的基因序列,设计出一对特异性引物,以Tianjin株总RNA逆转录的cDNA为模板进行PCR扩增,然后对该方法的敏感性、特异性进行检测。并将该方法应用于临床84例下呼吸道感染患儿支气管肺泡灌洗液（BALF）标本的检测。结果通过此方法成功扩增出约500bp的预期条带。将Tianjin株鸡胚尿囊液（血凝效价为1：1280）稀释到320倍时仍可出现阳性条带,对新城疫病毒、甲型流感病毒鼠肺适应株、人副流感病毒Ⅰ型、柯萨奇病毒B3m株、单纯疱疹病毒Ⅰ型及鸡胚尿囊液的PCR检测结果均呈阴性。84例下呼吸道感染患儿BALF标本中,其中2例阳性,阳性率为2．38％,与本实验室建立的双抗体夹心ELISA法检测结果相接近。结论建立的副粘病毒Tianjin株RT—PCR检测方法是一种快速、灵敏、特异的方法,为患病儿童中Tianjin株感染情况的调查奠定了重要的基础。【     

免疫—PCR法检测儿童中生长激素水平

目的：建立超灵敏度的免疫－PCR法检测尿中生长激素的水平。方法：在经戊二醛处理的PCR管中完成双抗炎心酶免疫反应，通过PCR扩增加接在抗原－抗体复合物上的DNA分子，琼脂糖电泳及扫描判断结果。结果：处理后的PCR管完全能够进行免疫反应，其灵敏度可达0．1pg/ml左右。琼脂糖电泳及扫描结果表明，30例正常青春发育期前儿童与10例经常规生长激素激发试验诊断为生长激素缺乏（growth hormone-deficient,GHD）的儿童，12h夜尿生长激素（GH）水平有明显差异。结论：此法的敏感度比酶标法高10^3-10^4倍，适于儿童尿中微量GH水平的检测。     

原位PCR技术检测石蜡包埋肝组织中HBV DNA

采用原位PCR技术对22例石蜡包埋肝组织中HBV DNA进行检测,并与提取组织DNA PCR技术及原位杂交技术进行比较。结果表明,22例标本经原位PCR检测有9例为阳性;经提取组织DNA PCR检测有7例阳性,两者敏感性相近,符合率达80％;经原位杂交检测有4例阳性,其敏感性只及原位PCR的44％。提示原位PCR是项快速、敏感及特异性较高的检测技术。     

用PCR—RFLP方法检测动脉硬化性脑梗死患者的载脂蛋白E基因多态性分布

目的 研究动脉硬化性脑梗死（ＡＣＩ）患者中的载脂蛋白Ｅ（ＡｐｏＥ）基因的分布。方法 利用聚合酶链式反应（ＰＣＲ）技术扩增ＡｐｏＥ基因含编码１１２位和１５８位氨基酸的片段，并用限制性片段长度多态性（ＲＦＬＰ）技术对ＡＣＩ患者和相应健康对照的ＡｐｏＥ基因进行分型，从而进行ＡＣＩ与ＡｐｏＥ等位基因多态性的关联分析。结果 ＡＣＩ患者中ＡｐｏＥ等位基因ε４占２８．３０％，明显高于正常人对照组的７．６４％，而等位基因ε３则占５７．５５％，低于正常人对照组的８４．１２％，均有极显著性差异（ｐ〈０．０１）。结论 ＰＣＲ－ＲＦＬＰ是一种快速有效的ＡｐｏＥ基因分型方法，ε４可能为ＡＣＩ的易感因子，而ε３则为保护因子。     

间接法原位PCR在cHL IgH基因重排研究中的应用

目的：探索在石蜡切片上进行间接法原位PCR的可行性及利用产物探针检测IgH克隆性基因重排的意义。方法：选取获得IgH克隆性基因重排的经典型霍奇金淋巴瘤（cHL），纯化产物合成探针，进行间接法原位PCR。结果：在H/RS细胞和周围背景细胞核内均发现棕褐色杂交颗粒，利用产物探针互测时也能出现杂交颗粒。结论：在石蜡切片上进行间接法原位PCR是可行和有效的，但产物探针的精确性仍有待进一步证实。     

A组轮状病毒一步法RT—PCR检测技术的建立和应用研究

目的 设计A组轮状病毒（RV）的特异性引物,应用Tth酶,建立一步法RT－PCR扩增方案,检测西安地区腹泻幼儿196份粪便标本,并与本室研制建立的反向间接血凝法（RPHA）,聚丙烯酰胺凝胶电泳,市售ELISA试剂盒平行检测对比分析。方法 设计并合成第九基因序列保守区互补的特异性引物,在经典法RT－PCR试验成功的基础上,建立合理的一步法RT－PCR＞要四种检测结果阳性率分别为33．16％,23．47％,21．94％和25％,X^2检验表明,RT－PCR最为敏感。结论 反转录和PCR由Tth酶一步完成,克服了经典法中AMV、RNasin等试剂昂贵,操作繁锁等缺点,很适合临检需要。     

应用PCR基因扩增法检测孕妇滋养细胞中沙眼衣原体感染

目的应用多聚酶链反应法(polymerase chain reaction,PCR)探讨孕妇滋养细胞中沙眼衣原体感染.方法与结果选择149例孕妇用宫颈内口冲洗法获取滋养细胞进行PCR检测沙眼衣原体感染,阳性率为30.2%,孕早、中、晚期阳性率分别为10.9%,32.7%,51.1%,P<0.05,有明显差异,然而,孕妇年龄、产次与沙眼衣原体感染,P>0.05,无明显差异.结论用PCR技术检测孕妇滋养细胞沙眼衣原体感染,具有特异性强,简便,快速等特点,结果显示,随着孕周增加其沙眼衣原体感染有明显增加趋势.