降血压肽Val-Leu-Pro-Val-Pro在Caco-2细胞模型中的吸收机制

目的研究降血压肽Val-Leu-Pro-Val-Pro(VLPVP)在Caco-2细胞模型中的吸收机制。方法用体外培养的Caco-2细胞单层模型,考察时间、pH值、药物浓度、吸收抑制剂及促进剂对VLPVP吸收的影响。用HPLC法检测VLPVP的浓度。结果VLPVP在pH7.4时转运量最大,且与浓度和时间呈正相关。肽转运载体竞争性抑制剂Gly-Pro、arphamenine A和细胞内吞抑制剂氧化苯胂对VLPVP的转运没有显著的抑制作用,而旁路转运促进剂去氧胆酸钠、多药耐药蛋白抑制剂MK-571和能量抑制剂叠氮化钠对VLPVP从AP侧至BL侧的转运有非常显著的促进作用,而叠氮化钠和MK-571对VLPVP从BL侧至AP侧的转运无显著影响。结论VLPVP以旁路转运为主要方式被小肠上皮细胞吸收,并受到多药耐药蛋白MRP2强烈的外排作用。     

矢车菊素-3-葡萄糖苷在Caco-2细胞模型的吸收机制研究

目的研究花色苷矢车菊素-3-葡萄糖苷(Cy-3-G)在Caco-2细胞模型的吸收机制。方法建立Caco-2单层细胞模型,观察Cy-3-G的转运情况。加入不同浓度的维拉帕米(P-gp抑制剂)、MK571(MRP2抑制剂)、根皮苷(SGLT1抑制剂)及根皮素(GLUT2抑制剂),观察P-gp、MRP2、SGLT1及GLUT2等转运蛋白在Cy-3-G肠道吸收中的作用。结果 Cy-3-G在Caco-2细胞模型的吸收率随着时间延长逐渐升高,2 h时吸收率在0.76%~2.41%之间,但随着花色苷浓度的升高而降低。维拉帕米和MK571对Cy-3-G在Caco-2细胞模型的吸收无影响(P>0.05),根皮苷和根皮素可显著抑制Cy-3-G的吸收(P<0.05)。结论 P-gp和MRP2对Cy-3-G在肠道的吸收无影响,SGLT1和GLUT2均参与了Cy-3-G在小肠的吸收。[营养学报,2013,35(2):191-194,198]     

姜黄素抑制Caco-2细胞胆固醇吸收的作用及机制研究

目的探讨姜黄素对Caco-2细胞胆固醇吸收的影响以及可能机制。方法建立Caco-2细胞单层模型,分别用25、50、100μmol/L姜黄素或胆固醇吸收转运蛋白尼曼-匹克C1型类似蛋白1(NPC1L1)的抑制剂依折麦布孵育细胞24h或2h后,再用[14C]-胆固醇微胶溶液孵育细胞2h。用液闪计数仪检测细胞胆固醇吸收量,荧光定量PCR和Western blot检测NPC1L1的基因和蛋白表达量。结果 Caco-2细胞[14C]-胆固醇吸收可被依折麦布呈浓度依赖性地抑制,表明本研究建立的单层Caco-2细胞模型的胆固醇吸收是由NPC1L1所介导的。姜黄素能有效的下调NPC1L1的基因及蛋白表达水平,降低Caco-2细胞胆固醇吸收,100μmol/L姜黄素可引起40%胆固醇吸收下降。结论姜黄素能够降低Caco-2细胞胆固醇吸收,这可能与其抑制NPC1L1表达有关。     

耐STI571的K562细胞株的建立及生物学特性考察

目的：建立1株耐STI571的K562细胞,并对其生物学特性进行研究分析,探讨耐药机理。方法：通过递增STI571药物浓度的方法,成功建立1株耐STI571人白血病细胞株K562/R,并采用RT-PCR、Western-blot、免疫组化、基因测序等生物学手段对其进行耐药机理进行分析。结果：K562/R细胞株在STI571浓度高达1μmol/L水平,仍能稳定生长,繁殖旺盛。K562/R细胞株耐STI57程度较亲代K562细胞多达235倍,该耐药细胞株对HHT﹑VCR﹑DNR具有不同程度的交叉耐药性,与亲代K562细胞比较差异有统计学意义（P〈0.05）。与亲代敏感株K562细胞相比,其BCR-ABL基因表达上调,BCR-ABL蛋白及其激酶过度表达。结论：成功建立耐STI571人白血病细胞株K562/R,并对其生物学特性的研究,为STI571耐药机制的进一步深入研究和抗耐药抑制剂的筛选提供了有效的平台。     

大鼠胃黏膜细胞EGFR通过ERK-1/2信号传导通路激活AP-1

目的 探讨大鼠胃黏膜细胞EGFR活化AP—1的信号传导通路。方法 用EGFR配体TGF—α刺激分离的大鼠胃黏膜细胞。Western blot和EMSA方法检测ERK—1／2信号传导通路的活化程度。结果 1nmol／L TGF—α刺激胃黏膜细胞30min不仅显著诱导AP—1的活性，而且明显激活MEK和ERK—1／2；EGFR特异性抑制剂PD153035或MEK特异性抑制剂PD98059能完全阻断TGF—α诱导的胃黏膜细胞AP—1活化。结论 大鼠胃黏膜细胞EGFR通过ERK—1／2信号传导通路激活AP—1。     

多药耐药及相关蛋白基因抗砷作用

目的 研究多药耐药基因(MDRI)、多药耐药相关蛋白基因(MRP1)在长期砷暴露的细胞获得对砷的耐受过程中的作用,为抗砷机制的研究提供基础依据.方法 采用抑制剂维拉帕米(Verapamil)、MK571,在单一水平和联合水平上阻断MDR1和MRP1基因发挥作用,通过四甲基偶氮噻唑蓝(MTT)法检测细胞的生存率及半数致死量(IC50);通过原子荧光法(AFS)分别检测给予Vempamil、MK571的实验组和对照组在不同时间点抗砷细胞内砷的含量.结果 在2,4,8,16,32,64 μmol/L砷浓度下,给予抑制剂的抗砷细胞生存率分别为(73.5±0.02)%,(54.6±0.07)%,(44.2±0.05)%,(20.5±0.09)%,(13.5±0.1)%,(7.6±0.05)%,明显低于同步对照组的生存率(93.5±0.05)%,(71.5±0.02)%,(49.2±0.03)%,(38.8±0.08)%,(37.6±0.06)%,(19.5±0.04)%.Verapamil作用下IC50为8.8 μmol/L,MK571作用下IC50为6.22 μmol/L;同时给于2种抑制剂时,逆转作用更为明显,IC50为5.23μmol/L;MK571作用下,抗砷细胞内砷含量增加明显,至10 h时砷含量达到最大值1.62 ng,明显高出Verapmil组和对照组,差异有统计学意义(P<0.05).结论 MDR1、MRP1基因在抗砷细胞获得耐药性过程中起重要作用.     

p53及p21^wafl蛋白表达与人舌癌细胞多药耐药性的关系

目的 探讨p53及p21^wafl蛋白表达与人舌癌细胞系Tca8113多药耐药性（MDR）的关系。方法 采用脂质体介导的转染技术，将野生型p53（wt-p53）基因导入人舌癌耐药细胞系Tca8113／BLM；分子信标（Molecular Beacon）法检测人舌癌细胞系Tca8113及其耐药细胞系Tca8113／BLM中p53基因的mRNA水平；Western blot检测亲本、耐药细胞和转染细胞中p53、p21^wafl、P-gp和MRP蛋白的表达变化；MTT法检测不同细胞的药物敏感性，流式细胞仪检测细胞周期的改变，激光共聚焦显微镜观察细胞凋亡。结果 在人舌癌耐药细胞系Tca8113／BLM中p53基因的表达明显下调，并且未检测到p21^wafl蛋白的表达；转染了wt—p53的耐药细胞Tca8113／BLM／p53中p53和p21^wafl蛋白表达均显著上调，而P-gP和MRP的蛋白表达则明显下调，其对药物BLM的敏感性增加10．1倍（P〈0．01）；转染细胞的周期也发生改变，G2期细胞增加，G1和S期细胞减少，转染细胞明显出现凋亡。结论 人舌癌耐药细胞系Tca8113／BLM多药耐药性的产生，可能通过p53和p21^wafl的表达下调使得多药耐药性相关蛋白P—gp和MRP表达上调来实现。     

Caco-2细胞模型的建立及其在真菌毒素吸收率研究中的应用

目的构建Caco-2单层细胞转运5种毒素的吸收率模型并验证。方法以Caco-2细胞系为工具,以脱氧雪腐镰刀菌烯醇(DON)、黄曲霉毒素B1(AFB1)、AFB2、黄曲霉毒素G1(AFG1)和AFG2为研究对象,通过对转运介质溶液中毒素的初始浓度、温度、p H值、抑制剂存在与否等实验条件的优化,构建Caco-2细胞转运DON和4种黄曲霉毒素的生理模型并进行验证。结果 DON、AFB1、AFB2、AFG1及AFG2透过Caco-2单层细胞的量和表观渗透系数(Papp)随着体系溶液中p H的升高有下降趋势。AFB1在p H 7.4~7.5溶液中的Papp值最高,AFB2、AFG1、AFG2及DON在p H 7.0~7.1溶液中的Papp值最高。随着体系温度的升高,DON、AFB1、AFB2、AFG1及AFG2的透膜能力均有所增加。无论体系中AFB1、AFG1及AFG2浓度低或高,均在60 min时透过率达到平台期并维持稳定;而AFB2及DON从高浓度到低浓度均在120 min时透过率达到平台期并维持稳定。结论所建5种毒素Caco-2单层细胞模型灵敏、稳定、可靠、有效。     

肠上皮细胞二肽转运载体的生物学功能及研究进展

蛋白质在体内主要是以二肽 (dipeptide)形式被吸收 ,其转运和摄取过程依赖肠上皮细胞刷状缘的二肽载体(dipeptidetransporter ,PepT1)。PepT1相对分子质量为 12 70 0 0 ,共有 70 8个氨基酸残基 ,12个跨膜域 ,PepT1不但可转运二肽和三肽 ,而且对一些重要的类二肽药物 (如 β 内酰胺类抗生素和血管紧张素转换酶抑制剂等 )也可通过PepT1吸收。因此 ,二肽载体在蛋白质的吸收、临床营养支持和药物吸收方面具有十分重要的生物学功能。Caco 2细胞是人结肠癌上皮细胞 ,其结构和生化作用都类似于人小肠上皮细胞 ,PepT1在Caco 2细胞上常规表达 ,常采用该细胞模型研究PepT1的生物学功能     

GLUT2在小肠糖吸收中的作用

近年来的研究发现小肠葡萄糖的吸收包括两大部分;当小肠肠腔葡萄糖浓度低于血糖浓度时,由钠-葡萄糖协同转运蛋白1(SGLT1)介导的经典的主动吸收途径完成转运,当肠腔葡萄糖浓度高于SGLT1的糖转运饱和度时,葡萄糖转运蛋白2(GLUT2)在小肠一过性插入顶膜导致的易化扩散中起到了主导作用.由于具有低亲和力,高容量的特点,GLUT2确保了细胞内外葡萄糖的双向扩散.此外,GLUT2还参与了果糖和半乳糖的转运.生理状态下,小肠GLUT2主要存在于基底膜,饮食、激素、能量代谢等因素的影响可使其一过性易位至顶膜参与糖转运.病理状态下顶膜GLUT2永久性的插入,引起糖吸收增加,最终导致肥胖、胰岛素抵抗及糖尿病.     

水通道蛋白调节的研究进展

水通道蛋白是特异性跨膜转运水的蛋白家族 ,能显著增加细胞膜水通透性 ,参与水的分泌、吸收及细胞内外水的平衡。迄今为止 ,在哺乳动物细胞膜上已发现 11种水通道蛋白 ,这些水通道蛋白分别介导不同类型细胞膜的跨膜水转运 ,使水代谢的研究进入了一个新的领域。     

槲皮素及其糖苷衍生物在Caco-2单层细胞上的吸收特征

目的探讨槲皮素及其糖苷衍生物在人小肠吸收模型Caco-2细胞单层上的吸收特征。方法采用Caco-2单层细胞模型,研究槲皮素、槲皮苷、异槲皮苷的肠道吸收特征,以LC-MS法测定槲皮素、槲皮苷、异槲皮苷、异鼠李亭。结果槲皮素及其糖苷衍生物孵育30～150min后,均能在透过侧检测到槲皮素、槲皮苷和异槲皮苷以及槲皮素的甲基化代谢产物之一异鼠李亭;透过的槲皮素及其代谢产物异鼠李亭含量在150min孵育时间内呈先升后降的趋势特征;而槲皮苷和异槲皮苷的透过量则随孵育时间呈持续升高的趋势,在孵育后期可检测到微量异鼠李亭。结论槲皮素、槲皮苷和异槲皮苷可以完整的分子形式被Caco-2细胞单层吸收,其吸收特征有显著差异,并在吸收过程中伴有广泛的代谢转化。[营养学报,2012,34(4):358-361,367]     

痰瘀同治方药对Caco-2单层细胞胆汁酸吸收的抑制作用及机制研究

目的探究复方中药对人结肠腺癌Caco-2细胞胆汁酸吸收的抑制作用及机制。方法Transwell细胞小室接种Caco-2细胞,培养21 d以建立单层细胞模型,随机分为空白对照组、胆汁酸刺激组及复方中药+胆汁酸组,其中选取了4种胆汁酸,分别为胆酸(CA)、脱氧胆酸(DCA)、甘氨胆酸(GCA)以及牛磺胆酸(TCA)。观察各组胆汁酸跨膜转运量、相关基因mRNA及蛋白表达水平的变化。结果与相应的胆汁酸刺激组相比,复方中药干预可显著降低胆酸(CA)、甘氨胆酸(GCA)以及牛磺胆酸(TCA)在Transwell细胞小室下室中的浓度,差异有统计学意义(P 0.05),但对DCA无明显作用(P 0.05)。同时,复方中药可对抗CA、GCA以及TCA导致的Caco-2细胞顶端钠依赖性胆汁酸转运体(ASBT)、有机溶质转运体β(OSTβ) m RNA及蛋白表达水平的升高,差异有统计学意义(P 0.05),但对回肠胆汁酸结合蛋白(IBABP)的m RNA表达无显著影响(P 0.05);对脱氧胆酸(DCA)刺激所引起的ASBT和OSTβm RNA及蛋白表达水平的改变无显著影响(P 0.05),但可对抗IBABP mRNA表达水平的下降,差异有统计学意义(P 0.05)。复方中药干预可对抗GCA以及TCA所导致的OSTαm RNA表达水平的升高,差异有统计学意义(P 0.01),但对CA、DCA无显著影响(P 0.05)。结论复方中药可有效抑制肠道上皮细胞对胆汁酸的吸收,其作用可能主要是通过下调ASBT和OSTβ基因m RNA及蛋白的表达来实现,可能是复方中药抑制胆汁酸吸收的潜在作用靶点。     

防己诺林碱联用紫杉醇对耐药卵巢癌SKOV3/ADM细胞作用机制的初步研究

目的评价防己诺林碱调控紫杉醇对耐药卵巢癌SKOV 3/ADM细胞多药耐药的作用。方法采用MTT法和细胞摄取研究防己诺林碱调控紫杉醇对SKOV 3/ADM细胞多药耐药的作用。结果细胞生长抑制试验表明,紫杉醇对SKOV 3/ADM细胞耐药明显。0.5、1和5μg·mL~(-1)浓度的防己诺林碱分别与紫杉醇联用后,紫杉醇对细胞的半数抑制浓度(IC_(50))降为(0.542±0.117)、(0.924±0.153)和(1.931±0.375)μg·mL~(-1),耐药逆转倍数If分别为16.1、9.4和4.5倍,与单用紫杉醇相比差异有统计学意义(P0.05)。细胞摄取试验研究表明,联用防己诺林碱浓度达到0.5μg·mL~(-1)及以上时,能够显著增加紫杉醇的细胞摄取(P0.05)。结论防己诺林碱是潜在的逆转紫杉醇对SKOV 3/ADM细胞多药耐药候选活性化合物。     

胞外钙调节成骨细胞和成骨前体细胞内甲状旁腺素相关肽表达

以往研究表明,甲状旁腺素相关肽在绝经后女性骨质疏松患者中骨的合成过程中发挥重要作用.在细胞水平上,甲状旁腺素相关肽能促进成骨细胞的募集并阻止成骨细胞和骨细胞的凋亡.在发挥骨吸收作用的破骨细胞周围,其钙离子浓度远大于血浆钙离子浓度.因此,在成骨细胞发挥再吸收活性的附近区域,其细胞外钙离子浓度可能有所升高.该研究意在估计细胞外钙对成骨细胞内甲状旁腺素相关肽表达的调节作用.成人间充质干细胞可以通过标准方法进行培养和分型.通过免疫放射分析测定释放到培养基里的甲状旁腺素相关肽,而通过实时PCR估计甲状旁腺素相关肽、骨钙素和Runx2 mRNA的表达水平.把钙离子浓度从1 mmol升高到5 mmol并持续24 h结果导致甲状旁腺素相关肽水平升高4～6倍.钙离子浓度的升高同样增加了甲状旁腺素相关肽mRNA的表达水平.钙对甲状旁腺素相关肽释放的刺激效应在提高钙离子浓度的60 min内出现.细胞外钙感应受体激动剂新霉素能够模拟钙离子的作用,但是MEK/MAPK抑制剂PD98059却能消除钙离子和新霉素产生的效应.高水平的细胞外钙能够提高成人间充质干细胞的矿化作用和骨钙素的表达水平,但是新霉素不能模拟产生该效应.研究结果表明,在成人间充质干细胞中,细胞外钙离子水平的升高能增加甲状旁腺素相关肽及其mRNA的表达.细胞外钙感应受体的激活能模拟钙对甲状旁腺素相关肽的效应,而抑制MAPK信号通路又可减少该效应的发生.     

铜对Caco-2细胞单层屏障功能的影响

目的研究铜对Caco2细胞单层细胞间通透性、P糖蛋白(Pgp)活性的影响。方法应用Caco2细胞单层模型,通过测定铜暴露后细胞单层的跨上皮细胞电阻(TEER)来反映通透性的改变;通过免疫荧光和荧光染色观察铜对紧密连接蛋白ZO1和F微丝的影响;通过测定细胞单层对罗丹明123的跨膜转运和细胞内罗丹明123的蓄积来反映P糖蛋白活性的改变。结果细胞单层顶面铜暴露(30～100μmol/L,Hanks缓冲溶液,0～3h)可导致TEER值呈浓度和时间依赖性降低,同时伴随着F微丝的解聚,但对紧密连接蛋白ZO1无显著影响;在不影响细胞活性和细胞单层通透性的剂量下,顶面铜暴露(300μmol/L,完全培养基,24h)后细胞单层对罗丹明123的表观通透系数(Papp)BL→AP从对照组的(737±020)10-6cm/s降低为(643±027)×10-6cm/s,PappAP→BL从对照组(123±005)×10-7cm/s增加为(341±008)×10-7cm/s,同时细胞内罗丹明-123的蓄积量从对照组的每膜(031±001)nmol增加为每膜(050±003)nmol。结论铜可显著增加Caco2细胞单层的通透性和抑制Pgp的活性,从而推测可能影响肠道上皮细胞的正常屏障功能。     

慢性砷暴露对人皮肤角质形成细胞药物转运相关蛋白mRNA表达和砷代谢的影响

目的探讨慢性砷暴露对人皮肤角质形成细胞(human keratinocytes,HaCaT)药物转运蛋白mRNA表达和砷代谢的影响。方法将HaCaT细胞随机分为慢性对照(不予以砷处理)组和慢性砷暴露(100 nmol/L亚砷酸钠染毒28周)组,培养于含10%胎牛血清和1%双抗的培养基中,收集处于对数生长期的细胞,采用实时荧光定量(real-time quantitative PCR)法检测细胞多药耐药相关蛋白mRNA的表达水平。将处于对数生长期的HaCaT对照细胞和慢性砷暴露细胞分别暴露于含终浓度为0(对照)、2.5、5、10、20、30、40、50、60、80、100、150μmol/L亚砷酸钠的培养基中孵育24 h,采用MTS法检测细胞活性。将慢性砷暴露组细胞和对照细胞予以10μmol/L亚砷酸钠处理24 h,采用氢化物发生-原子吸收分光光度法检测细胞砷蓄积和砷排放量。结果与对照细胞相比,慢性砷暴露HaCaT细胞多药耐药相关蛋白ABCC2和ABCC4 mRNA表达水平均升高,差异有统计学意义(P0.05);而ABCC1、ABCC3、ABCC5、ABCG1、ABCG2 mRNA的表达水平均无显著变化。与对照细胞相比,慢性砷暴露HaCaT经各浓度急性砷处理后细胞存活率均升高,差异有统计学意义(P0.05)。与对照细胞相比,10μmol/L亚砷酸钠染毒24 h后,慢性砷暴露细胞内的砷蓄积量降低,而砷排放量升高,差异均有统计学意义(P0.05)。结论慢性砷暴露的HaCaT细胞药物转运蛋白mRNA的表达升高,砷排出能力增强,对砷毒性产生耐受性。     

鱼藤酮对星形胶质细胞内游离钙浓度的影响及其机制

[目的]研究鱼藤酮引起的星形胶质细胞内游离钙浓度变化及其离子流动机制. [方法]以体外培养的大鼠中脑星形胶质细胞为研究对象,激光共聚焦结合Fluo-4荧光法动态测定细胞内游离钙浓度.[结果]鱼藤酮可浓度依赖性地引起星形胶质细胞内游离钙浓度升高.细胞内钙库释放抑制剂TMB-8、无钙缓冲液和钙通道阻滞剂MK-801、尼莫地平均可抑制鱼藤酮引起的细胞内钙浓度变化,但其抑制作用发挥的时间和程度均有显著不同. [结论]细胞内钙释放与细胞外钙内流共同参与了鱼藤酮引起的星形胶质细胞内游离钙浓度的升高,但细胞内钙释放发挥作用的时问稍迟,而鱼藤酮引起的细胞外钙内流主要由电压依赖武钙通道内流引起.     

通过K562细胞铁缺失刺激非转铁蛋白铁摄取

通过人类红白血病K562细胞检测铁缺失对从柠檬酸铁中摄取铁的影响。在成分明确的无铁培养基中预孵育24h后铁的摄入高于在含转铁蛋白培养基中孵育的2～3倍。将K562细胞在无铁培养基中预孵育再加有蛋白合成抑制剂-放线菌酮完全取消了对摄入铁的刺激。在无铁培养基中孵育导致二价金属载体1mRNA水平下降20%。十二指肠细胞色b、膜转铁蛋白和肠铁转运蛋白mRNA水平没有显著改变,也没有发现二价金属载体1、十二指肠细胞色b、膜转铁蛋白和肠铁转运蛋白蛋白水平改变。由此得出结论:铁缺失刺激K562细胞非转铁蛋白铁的摄入,并且这种刺激依赖于蛋白合成。     

胃癌患者营养状况与小肠二肽转运载体1蛋白表达的相关性

目的　研究不同营养状态胃癌患者的小肠二肽转运载体1(PEPT1)蛋白表达,探讨其可能的调控机制。方法　以60例胃癌患者为研究对象,根据营养风险筛查2002（NRS 2002）评分分为有营养风险组（NRS 2002评分≥3分,n=18）及无营养风险组（NRS 2002评分＜3分,n=42）。术中取小肠黏膜标本,Western blot法检测小肠PEPT1蛋白表达。酶联免疫吸附法检测两组胃癌患者血清肿瘤坏死因子（TNF）-α的浓度。对Caco-2细胞采用不同浓度TNF-α（20、50、100 μg/L）处理,于不同时点（24、48、72 h）采用Western blot法检测Caco-2细胞PEPT1蛋白表达水平。结果　有营养风险组小肠PEPT1表达和血清TNF-α浓度均显著高于无营养风险组（0.63比0.23,P=0.000; 0.23 μg/L比0.17 μg/L,P=0.001）。在Caco-2细胞模型中,不同浓度TNF-α（20、50、100 μg/L）处理24 h后的PEPT1表达显著高于空白组（0.68比0.54,P=0.005;0.72比0.54,P=0.001;0.78比0.54,P=0.000）;TNF-α 50 μg/L处理不同时间（24、48、72 h）的Caco-2细胞PEPT1表达显著高于空白组（0.57比0.52,P=0.004;0.75比0.52,P=0.000;0.77比0.52,P=0.000）。结论　有营养风险的胃癌患者小肠PEPT1蛋白表达增加,其机制可能与TNF-α调控作用有关。