应用抑制性消减杂交技术筛选XTP3的反式激活基因

目的应用抑制性消减杂交技术构建乙型肝炎病毒X蛋白反式激活基因XTP3的差异表达的cDNA消减库,克隆XTP3反式激活相关基因。方法以XTP3表达质粒pcDNA3．1(-)XTP转染HepG2细胞,以空载体pcDNA3．1(-)为对照;制备转染后的细胞裂解液,提取mRNA并逆转录为cDNA,经Rsa I酶切后,将实验组cDNA分成两组,分别与两种不同的接头衔接,再与对照组cDNA进行两次消减杂交及两次抑制性PCR,将产物与T／A载体连接,构建cDNA消减库,并转染大肠杆菌进行库扩增,随机挑选克隆PCR扩增后进行测序及同源性分析。结果库扩增后得到30个白色克隆,经菌落PCR分析,得到23个200～1000bp插入片段。对所得片段测序,并进行同源性分析,共得到20种已知基因序列和2种未知功能基因序列,可能是XTP3反式激活靶基因。结论成功构建了乙型肝炎病毒xTP3反式激活基因差异表达的cDNA消减库,为今后进一步分析、研究病毒蛋白的致病机制奠定了基础。     

丙型肝炎病毒非结构蛋白NS5A反式激活基因的克隆化研究

应用抑制性消减杂交技术构建丙型肝炎病毒非结构蛋白5A（HCV NS5A）反式激活基因差异表达的cDNA消减文库，克隆HCV NS5A蛋白反式激活相关基因。以HCV NS5A表达质粒pcDNA3.1(－）-NS5A转染HepG2细胞，以空载体pcDNA3.1(－）为对照，制备转染后的细胞裂解液，提取mRNA并逆转录为cDNA，经RsaI酶切后，将实验组cDNA分成两组，分别与两种不同的接头衔接，再与对照组cDNA进行消减杂交及两次抑制性PCR，将产物与T／A载体连接，构建cDNA消减文库，并转染大肠杆菌进行文库扩增，随机挑选克隆PCR扩增后进行测序及同源性分析。文库扩增后得到121个阳性克隆，经菌落PCR分析，得到115个200－1000bp的插入片段，对其中的90个片段测序，并进行同源性分析，显示31种在基因编码蛋白和15种未知功能基因序列，包括一些与细胞周期、细胞凋亡、信号传导及肿瘤发生等细胞生长调节密切相关的蛋白编码基因，可能是NS5A反式激活靶基因。结果提示，成功构建了HCV NS5A反式激活基因差异表达的cDNA消减文库，该文库的建立为进一步阐明HCV NS5A反式调节的靶基因及致肝细胞癌发生的分子生物学机制提供了理论依据。     

肝细胞内人类次要组织相容性抗原-HA8蛋白反式激活基因的筛选

目的应用抑制性消减杂交(SSH)技术及生物信息学技术筛选肝细胞内人类次要组织相容性抗原-HA8(HLA-HA8)的反式激活基因。方法以HLA-HA8基因表达质粒pcDNA3.1(-)-HLA-HA8和空载体pcDNA3.1(-)转染HepG2细胞,提取mRNA并反转录合成双链cDNA(dscDNA),分别标记为Tester和Driver;经RsaI酶切后,将Tester cDNA分成两组,分别与两种不同的接头adapter 1和adapter 2衔接,再与Driver cDNA进行两次消减杂交及两次抑制性聚合酶链反应,将产物与pGEM-T easy载体连接,构建cDNA消减文库,并转染大肠埃希菌进行文库扩增,随机挑选克隆PCR扩增后进行测序及同源性分析。结果成功构建HLA-HA8反式激活基因差异表达cDNA消减文库。扩增后得到101个阳性克隆,菌落PCR分析均得到200~1000bp的插入片段。随机挑选其中28个阳性片段测序,同源分析结果显示,共获得16种编码基因,其中4个功能未知。结论 HLA-HA8基因反式调节基因与细胞结构和生长、物质及能量代谢、物质转运和信号转导密切相关,为HLA-HA8的功能以及HBV感染慢性化机制研究提供了新的思路。     

应用抑制性消减杂交技术克隆丙型肝炎病毒核心蛋白反式激活基因

应用抑制性消减杂技术构建丙型肝炎病毒（HCV）核心蛋白反式激活基因差异表达的cDNA消减文库,克隆HCV核心蛋白反式激活相关基因。以HCV核心表达质粒pcDNA3.1(-)-core转染HepG2细胞,以空载体pcDNA3.1(-)为对照,制备转染后的细胞裂解液,从中提取mRNA并逆转录为cDNA,经Rsa I酶切后将实验组cDNA分成2组,分别与2种不同的接头衔接,再与对照组cDNA进行2次消减杂交及2次抑制性PCR,将产物与T/A载体连接,构建cDNA消减文库,并转染大肠杆菌进行文库扩增,随机挑选克隆PCR扩增后进行测序及同源性分析。结果显示,成功构建人HCV核心蛋白反式激活基因差异表达的cDNA消减文库。文库扩增后得到233个白色克隆,进行菌落PCR分析,其中213个均得到100～1000bp插入片段。挑取63个插入片段测序分析,其中6个cDNA片段为未知序列,通过生物信息学分析获得其全长序列,已被GenBank收录。提示6个新的cDNA全长序列,可能是HCV核心蛋白反式激活靶基因。     

应用抑制性消减杂交技术筛选HBeAg结合蛋白1反式激活基因

目的筛选与克隆HBeAg结合蛋白1(HBEBP1)新基因的反式激活基因,了解其可能存在的调节功能线索。方法应用抑制性消减杂交(SSH)技术及生物信息学(bioinformatics)技术筛选并克隆HBEBP1反式激活的新型靶基因。以HBEBP1表达质粒pcDNA3．1(-)-HBEBP1转染HepG2细胞,以空载体pcDNA3．1(-)为平行对照,制备转染后的细胞裂解液,提取mRNA并逆转录为cDNA,经RsaⅠ酶切后,将实验组cDNA分成两组,分别与2种不同的接头衔接,再与对照组cDNA进行2次消减杂交及2次抑制性聚合酶链反应(PCR),将产物与T／A载体连接,构建cDNA消减库,并转染大肠杆菌进行库扩增,随机挑选克隆PCR扩增后进行测序及同源性分析。结果成功构建人HBEBP1反式激活基因差异表达的cDNA消减库。库扩增后得到85个阳性克隆,进行菌落PCR分析,均得到200～1000bp插入片段。对26个插入片段测序,并通过生物信息学分析获得其全长基因序列,结果共获得15种编码基因,包括14种已知基因和1种未知基因。结论筛选到的cDNA全长序列,包括一些与细胞生长调节、信号转导、肿瘤免疫发生及细胞凋亡密切相关的蛋白编码基因,推测了HBEBP1可能存在的调控机制的线索。     

应用抑制性消减杂交技术筛选膦甲酸钠免疫调节基因

目的 应用抑制性消减杂交(SSH)技术构建膦甲酸钠(PFA)处理的人T淋巴细胞Jurkat差异表达基因的cDNA消减文库,筛选并克隆PFA免疫调节相关基因,阐明PFA免疫调节的分子生物学机制。方法 以PFA处理Jurkat细胞,同时以生理盐水处理的相同细胞作为对照;24h后制备细胞裂解液,提取mRNA并逆转录为cDNA,经Rsa1酶切后,将实验组cDNA分成两组．分别与两种不同的接头衔接,再与对照组cDNA进行2次消减杂交及2次抑制性多聚酶链反应(PCR)扩增,将产物与T／A载体连接,构建cDNA消减文库,并转染大肠杆菌进行文库扩增,随机挑选克隆PCR扩增后进行测序及同源性分析。结果 成功构建了PFA处理淋巴细胞差异表达基因的cDNA消减文库。文库扩增后得到46个阳性克隆,进行菌落PCR分析,均得到200～1000bp插入片段。挑取含有插入片段的14个克隆进行测序,并通过生物信息学分析获得11种已知基因序列和3个未知基因。结论 应用SSH技术成功构建了PFA处理的淋巴细胞差异表达基因的cDNA消减文库,为进一步阐明PFA的免疫调节机制及深入了解PFA防治病毒性肝炎的药理作用机制提供了依据。     

应用抑制性消减杂交技术研究甘草甜素免疫调节靶基因

目的应用抑制性消减杂交(SSH)技术构建甘草甜素刺激的人T淋巴细胞Jurkat差异表达基因的cDNA消减文库，筛选并克隆甘草甜素免疫调节靶基因，阐明甘草甜素免疫调节的分子生物学机制。方法以甘草甜素刺激Jurkat细胞，同时以生理盐水刺激的相同细胞作为对照；24h后提取mRNA并逆转录为cDNA，进行抑制性消减杂交分析并构建cDNA消减文库，随机挑选文库克隆，PCR扩增后进行测序及同源性分析。结果文库扩增后得到28个阳性克隆，进行菌落PCR分析，均得到200～1000bp插入片段。挑取含有插入片段的22个克隆进行测序，并通过生物信息学分析获得11种已知蛋白基因编码序列。主要包括IL-12、IL-18、胸腺素等免疫调节基因。结论应用SSH技术成功构建了甘草甜素处理的淋巴细胞差异表达基因的cDNA消减文库。为进一步阐明甘草甜素的免疫调节机制及深入了解甘草甜素用于防治病毒性肝炎的药理作用机制提供了依据。     

乙型肝炎病毒X蛋白反式激活基因XTP4的克隆化研究

目的 筛选并克隆乙型肝炎病毒X蛋白(HBxAg)反式激活新型靶基因。方法 以HBxAg表达质粒pcDNA3．1(-)-X转染HepG2细胞,以空载体pcDNA3．1(-)为平行对照,提取mRNA并进行抑制性消减杂交分析,应用生物信息学方法对所获基因片段序列进行分析发现,其中之一为新型基因片段,与GenBank(中注册的已知功能基因序列没有同源性。通过序列同源性搜索、比对和电子拼接,根据基因起始密码子的Kozak规则和终止密码子下游保守的多聚腺苷酸信号序列,确定新型基因序列。从转染了pcDNA3．1(-)-X的HepG2细胞提取总RNA,以逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)技术扩增,获得阳性克隆之后,进行鉴定并对克隆的基因及其编码产物的序列进行分析。结果 该新基因的编码序列全长为348个核苷酸(nt),编码产物由116个氨基酸残基(aa)组成,并测序证实,命名为XTP4,在Gen-Bank中注册,注册号为AF490253。结论 通过分子生物学技术与生物信息学技术的结合,发现并鉴定、克隆HBxAg反式激活作用的新型靶基因XTP4,为进一步研究HBxAg反式激活作用的分子生物学机制和探索新型治疗技术奠定基础。     

三氧化二砷体外诱导人HepG2细胞铁蛋白基因表达的研究

目的 了解低剂量三氧化二砷诱导的HepG2细胞的差异表达基因，揭示慢性砷中毒对肝细胞损伤的作用机制。方法 在体外用三氧化二砷(Sμmol／L)处理HepG细胞，同时以PBS处理的相同细胞系作为对照；24h后制备细胞裂解液，提取mRNA并逆转录为cDNA，经RsaⅠ酶切后，将实验组cDNA分成2组，分别与2种不同的接头衔接，再与对照组cDNA进行2次消减杂交及2次抑制性聚合酶链反应(PCR)，将产物与T／A载体连接，构建cDNA消减文库，并转染大肠杆菌JM109进行文库扩增，随机挑选克隆PCR扩增后进行测序及同源性分析。结果 成功构建三氧化二砷处理HepG2细胞差异表达基因的cDNA消减文库。文库扩增后得到：109个白色克隆，进行菌落PCR分析，均得到200～1000bp插入片段。挑取含有插入片段的36个克隆进行测序，通过生物信息学分析发现铁蛋白重链和轻链在三氧化二砷诱导的肝HepG2细胞正向消减cDNA文库中显著上调，共有8个阳性克隆子。结论 低剂量三氧化二砷刺激细胞后可诱导铁蛋白的表达上调，暗示铁蛋白在砷诱导的肝细胞损伤中起作用。     

XTP3基因融合蛋白的表达纯化及多克隆抗体制备

目的构建稳定表达乙肝病毒XTP3蛋白的原核表达载体并在大肠埃希菌中诱导融合蛋白的表达,制备兔抗XTP3蛋白多克隆抗体并检测该抗体在乙肝肝癌、正常肝组织中的作用效果。方法PCR获得XTP3基因片段,插入至pET-32a( )中构建原核表达载体pET-32a( )-XTP3,测序正确后转化大肠埃希菌BL21,IPTG诱导表达。SDS-PAGE、Western blotting分析鉴定融合蛋白的表达。利用Ni 亲和柱对表达蛋白进行纯化及柱上复性。免疫新西兰兔,制备多克隆抗体并进行ELISA、Western blotting及免疫组化验证。结果成功构建pET-32a( )-XTP3表达载体并在大肠埃希菌中诱导出高水平表达的XTP3融合蛋白,目的蛋白分子量为52kD,SDS-PAGE分析表明为包涵体表达。经亲和树脂纯化后免疫新西兰兔,成功获得融合蛋白及兔抗XTP3多克隆抗体。ELISA检测证明多克隆抗体效价>1:128000。免疫组化证实本实验中XTP3多克隆抗体在肝癌组织中的表达呈明显的细胞膜阳性,特异性良好。结论成功表达、纯化了XTP3基因融合蛋白,获得高特异性、高效价兔抗XTP3多克隆抗体,为进一步研究XTP3蛋白的生物学特性奠定了基础。     

+10 Gz重复暴露大鼠脑差异表达基因cDNA文库的构建

目的构建＋10Gz重复暴露大鼠脑差异表达基因的消减cDNA文库。方法本实验用SD大鼠，分别提取暴露组与对照组的总RNA，并分离纯化mRNA，应用抑制性消减杂交技术分离＋10GI重复暴露大鼠脑差异表达基因eDNA片段并建立消减eDNA文库；利用PCR对随机挑选的75个白色菌落进行插入片段的验证，对其中70个克隆进行eDNA斑点杂交验证。结果所构建的eDNA文库扩增后包含约400个白色克隆和100个兰色克隆，随机挑选75个白色克隆入质粒载体后共获得70个阳性克隆。结论应用抑制性消减杂交技术成功构建了＋10Gz重复暴露大鼠脑差异表达基因消减eDNA文库，为进一步筛选和克隆脑损伤相关基因奠定了基础。     

丙型肝炎病毒核心蛋白反式激活基因TAHCCP1的克隆化研究

目的 筛选并克隆丙型肝炎病毒(HCV)核心蛋白(core)反式激活的新型靶基因。方法 以HCV核心蛋白表达质粒pcDNA3．1(-)-core转染HepG2细胞,以空载体pcDNA3．1(-)为平行对照,提取mRNA并进行抑制性消减杂交分析。分析筛选出来的基因,其中之一与GenBank中注册的已知功能基因序列没有同源性。通过序列同源性搜索比对及电子拼接,根据基因起始密码子的Kozak规则和终止密码子下游保守的多聚腺苷酸信号序列,确定新型基因序列。从转染pcDNA3．1(-)-core的HepG2细胞提取总RNA,以RT-PCR技术扩增获得该新基因的全长序列,并对克隆的基因及其编码产物的序列进行分析。结果该新基因的编码序列全长为2001nt,编码产物由667aa组成,并测序证实,命名为TAHCCP1,在GenBank中注册,注册号为AY038359。结论 发现并鉴定、克隆了HCV核心蛋白反式激活作用的新型靶基因TAHCCP1,为进一步研究HCV核心蛋白反式激活作用的分子生物学机制和探索新型治疗技术奠定了基础。     

丙型肝炎病毒非结构蛋白NS5A反式激活基因NS5ATP3的克隆化研究

目的 筛选并克隆丙型肝炎病毒(HCV)非结构蛋白5A(NS5A)反式激活新型靶基因。方法 以HCV NSSA表达质粒pcDNA3．1(-)-NSSA转染HepG2细胞,以空载体pcDNA3．1(-)为平行对照,提取mRNA并进行抑制性消减杂交分析,应用生物信息学方法对所获基因片段序列进行分析发现,其中有新型基因片段,与GenBank中注册的已知功能基因序列没有同源性。通过序列同源性搜索、比对和电子拼接,根据基因起始密码子的Kozak规则和终止密码子下游保守的多聚腺苷酸信号序列,确定新型基因序列。从转染了pcDNA3．1(-)-NS5A的HepG2细胞提取总RNA,以逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)技术扩增,获得阳性克隆之后,进行鉴定并对克隆的基因及其编码产物的序列进行分析。结果 该新基因的编码序列全长为1572nt,编码产物由524aa组成,并测序证实,命名为NS5ATP3,在GentBank中注册,注册号为AF529364。结论 分子生物学技术与生物信息学技术相结合,发现并鉴定、克隆了HCV NSSA反式激活作用的新型靶基因NS5ATP3,为进一步研究HBxAg反式激活作用的分子生物学机制和探索新型治疗技术奠定基础。     

小鼠胚胎成纤维细胞差异表达基因的筛选

应用微阵列杂交法对培养前，后的小鼠胚胎成纤维细胞（MFF）mRNA进行检测，找到24类差异表达的基因，为进一步筛选MEF可能表达的新基因，对培养前（driver)，后（tester)的MEF mRNA进行抑制性消减杂交，产物与pGEM-T载体连接构建cDNA削减文库并转染JM109大肠杆菌。随机挑取阳性克隆，PCR扩增后对所得的差异表达基因进行测序及生物信息学分析。在随机挑取的145个克隆中，测得了128条EST序列，经生物信息学分析，它们代表了42类不同基因和3条新基因序列。结果表明，培养后MEF相对于培养前胚胎成纤维细胞确实存在差异表达基因群。提示，进一步的实验研究可能找出对ES细胞增殖分化有重要调控作用的基因或基因群。     

应用微阵列技术筛选HBV前-S1蛋白的反式调节基因谱

目的 阐明前-S1蛋白的表达对乙型肝炎病毒(HBV)感染肝细胞基因表达谱的影响。方法 以含有HBV全基因组的质粒G376-7(GenBank号：AF384371)作为模板,应用PCR扩增前-S1蛋白编码基因片段,以常规的分子生物学技术构建表达载体pcDNA3．1(-)-preS1,以脂质体转染肝母细胞瘤细胞系HepG2,提取总mRNA,逆转录为cDNA,与转染空白表达载体pcDNA3．1(-)的HepG2细胞进行DNA芯片分析并比较。结果 在1152个基因表达谱的筛选中,发现有30个基因表达水平显著上调,38个基因表达水平显著下调。结论 前-S1基因的表达对于肝细胞基因表达谱有显著影响。DNA芯片技术是分析反式调节靶基因的有效技术途径。     

BEP2D细胞恶性转化不同时期差异表达基因的筛选

目的 筛选并鉴定α粒子辐射诱发永生化人支气管上皮细胞(BEP2D)恶性转化不同时期差异表达的基因。方法 抑制消减杂交(SSH)，cDNA芯片。结果 利用SSH构建了BEP2D细胞3个恶性转化不同时期差异表达基因的文库。BEP2D细胞的文库有416个克隆，R15H20细胞的文库有301个克隆，R15H35细胞的文库有586个克隆，经cDNA Microarray验证发现：BEP2D细胞文库来源的芯片与3代细胞探针杂交后的阳性信号率为90．4％、21．6％和19．7％；R15H20细胞文库来源的芯片的阳性信号率为8．6％、93．8％和31．6％：R15H35细胞文库来源的芯片的阳性信号率为23．5％、18．2％和90．7％。结论 联合应用SSH和cDNA Microarray是筛选和鉴定不同样本中差异表达基因的快速和有效方法；经cDNA Microarray鉴定出的3个文库中差异表达的cDNA可能代表了α粒子诱发人支气管上皮细胞恶性转化相关的基因。