实时荧光PCR检测肠产毒性大肠埃希菌耐热肠毒素基因

目的：建立实时荧光PCR的方法检测肠产毒性大肠埃希菌（ETEC）耐热肠毒素（ST Ia和ST Ib）基因。方法：设计引物和探针,优化实时荧光PCR检测STIa和STIb基因的反应条件。检测ST阳性或阴性的20株大肠埃希菌和2株霍乱弧菌以评估方法的特异性。对90份腹泻病人肛拭子标本,经BP增菌4 h后以煮沸法提取DNA模板,直接检测STIa和STIb基因,阳性标本以普通PCR检测ST基因进行复核,并从阳性的初始肛拭子标本中分离鉴定携带ST的菌株。结果：实时荧光PCR具有较高的特异性。90份腹泻病人标本中,9份标本ST Ib基因阳性（10.0%）,2份标本为ST Ia基因阳性（2.2%）;阳性标本以普通PCR复核,符合率为100%。在9份STIb基因阳性和2份ST Ia基因阳性的初始肛拭子标本中,分别有8份和2份分离到STIb基因阳性的ETEC和STIa阳性的ETEC。结论：建立的实时荧光PCR方法,可用于ETEC菌株ST毒力基因鉴定和临床腹泻粪便标本的直接快速筛检。     

实时荧光定量PCR快速检测大肠埃希菌的方法研究

目的基于TaqMan探针建立产肠毒素大肠埃希菌实时荧光定量PCR检测方法。方法针对编码大肠埃希菌耐热肠毒素STI、不耐热性肠毒素LTI基因片段设计引物、探针,采用外标法,绘制标准曲线,进行荧光定量PCR检测。结果引物、探针特异性良好,该方法的灵敏度可达到每反应1DNA拷贝,特异性强,检测范围在100～107拷贝每反应,重复性及稳定性好,整个过程只需要2h。结论该方法能快速、灵敏、特异检出产肠毒素大肠埃希菌。     

一起产肠毒素大肠埃希菌食物中毒调查

本文报告一起由产肠毒素大肠埃希菌引起的食物中毒,发病率为29.5%,经流行病学调查和实验室检测,证实中毒者和袋装鲜牛奶检出同一种产肠毒素大肠埃希菌,现报告如下.     

1起由肠产肠毒素大肠埃希菌引起的食物中毒

20 0 1年 9月 2 0日 ,奉贤区某学校发生 1起食物中毒 ,根据流行病学调查和细菌检验结果 ,确认本次食物中毒由肠产肠毒素大肠埃希菌 (ＥＴＥＣ)Ｏ78:Ｋ80 所致。现将结果报告如下。1　流行病学调查某学校食堂共有 661名学生就餐 ,首例患者发病时间为 9月 18日 7时 ,末例患者为 9月 2 0日 14时30分 ,共有 2 8人发病 ,2 3名患者在校医务室就诊 ,有 5名患者前往区中心医院就诊 ,主要症状 :恶心、呕吐、腹痛、腹泻 (水样便 ,多数为 2次 /ｄ)。2　细菌学检验2 1　材料与方法2 1 1　样品来源　由奉贤区卫生监督所采样。采集患者肛拭 31份 ,厨师肛…     

双重实时荧光PCR检测肠产毒大肠埃希菌肠毒素基因方法的建立

目的:建立一种快速、准确、灵敏的检测肠产毒大肠埃希菌肠毒素基因方法。方法:于GenBank中查找ETEC肠毒素基因lt和st序列并进行比对后设计引物及TaqMan-MGB探针。对引物、探针、Mg2+、TaqDNA聚合酶及dNTPs浓度进行优化,并对方法的灵敏度、特异性、重复性进行分析。结果:建立了双重实时荧光PCR法检测ETEC肠毒素基因lt和st方法。结论:建立了一种灵敏、特异的检测ETEC肠毒素基因的方法。该法在疾病控制相关和临床实验室中具有广泛的实际应用价值。     

一起产肠毒素大肠埃希氏菌引起的食物中毒

1事件经过2012年5月23日,明光市古沛镇卫生院上午8点至9点陆续有15名患者前往治疗,患者的症状主要为恶心、呕吐、腹痛、腹泻为主要症状的肠道不适反应,无其他伴随症状。接诊医生初步诊断为急性肠炎,对症给予抗感染及补液治疗后症状明显改善,效果明显,无留观病例和住院病例,无死亡病例。     

产肠毒素大肠埃希菌PCR检验方案的优化

目的 分析产肠毒素大肠埃希菌stp毒力突变基因序列,及时优化监测方案,对食品中的产肠毒素大肠埃希菌进行有效的监测。方法 利用生物信息软件对测序结果进行比对,分析变异位点。通过评估不同引物探针检测方案对性能的影响,确定最优的解决方案。结果 通过基因序列测定,发现stp基因监测方案中上游引物第15号位置和16号位置发生了突变,NCBI中stp基因序列共63条,这条stp上游引物方案经过序列分析发现第15号位的T突变成A的共有12条,占比19%。第16号位的C突变成A的有11条,占比17%。优化后的stp检测方案能够正确扩增,除检出目标菌特异性条带无非特异条带产生,灵敏度达到0.05 ng/μl。结论 优化后的检测方案准确度高,特异性好、灵敏度好,并且不干扰其他毒力基因的检测性能,满足食品中对产肠毒素大肠埃希菌的检测要求。     

实时定量PCR检测大肠埃希菌在LB培养基和血中对抗生素的药物敏感性

目的 建立以实时定量PCR快速检测大肠埃希菌在LB液体培养基和健康人全血中对抗生素药物敏感性的方法。方法 临床血培养获得大肠埃希菌株，以常规纸片法检测其对抗生素的药物敏感性。分别在LB液体培养基和健康人新鲜全血中加入该大肠埃希菌至终浓度为0．5麦氏单位，采用不加抗生素的标本作为生长对照组，加入耐受或敏感的抗生素的标本作为耐受药物组或敏感药物组，37℃震荡培养，分别提取0、1、2、3、4小时的基因组DNA，以大肠埃希菌特异β-右旋半乳糖苷酶基因的引物和TaqMan探针，对标本进行实时定量PCR检测。结果 实时定量PCR方法有较好的重复性（CT值变异系数0．26％～1．56％）和精确度（大肠埃希菌DNA提取效率在LB培养基中为43．6％，在血中为26．7％），标准曲线线性关系好（R^2≥0．998）。培养1～3小时后，耐受药物组与生长对照组的大肠埃希菌DNA拷贝数均呈对数增长，在LB液体培养基中增至约19～120倍，在新鲜全血中增至约6～11倍；敏感药物组大肠埃希菌DNA拷贝数呈减少趋势，在LB液体培养基中减至0．22～0．12倍，在新鲜全血中为1．29～0．14倍。上述药敏结果与常规纸片法一致。结论 采用实时定量PCR检测大肠埃希菌在LB液体培养基和健康人全血中对抗生素的药物敏感性，结果与常规纸片法一致，但更快速。     

食品中致泻性大肠埃希菌PCR确认试验检测的探讨

目的 建议修订GB 4789.6—2016《食品安全国家标准食品微生物学致泻大肠埃希氏菌检验》PCR确认试验中,大肠埃希菌ATCC25922不宜作为检测肠道集聚性大肠埃希菌(EAEC)毒力基因的阴性对照菌株。方法 参照GB 4789.6—2016,采用市面在售的2种不同品牌规格致泻性大肠埃希菌核酸检测试剂盒进行PCR确认试验。结果 阴性对照菌株大肠埃希菌ATCC25922在2种不同品牌规格致泻性大肠埃希菌核酸检测试剂中均检测出pic基因,存在PCR确认实验过程中阴性对照失控现象。结论 PCR确认试验中大肠埃希菌ATCC25922作为阴性对照菌参与检测EAEC毒力基因,会影响试验结果的判读,建议采用等效标准菌株(如ATCC8739)作为阴性对照菌株参与试验。     

致泻大肠埃希菌Real-time PCR检测案例分析

目的 通过应用不同检测原理试剂盒对同一可疑菌株进行多重实时荧光PCR检测,阐明合理选用分子生物学检测技术在目标菌检测工作中的应用价值.方法 对粪便中分离培养的同一株可疑菌落进行双体系及三体系的多重实时荧光PCR扩增反应,并通过上级疾病预防控制中心病原实验室的验证试验结果,对两种反应试剂的检测结果进行评价.结果 双体系多...     

多重实时荧光PCR检测三种致泻性大肠埃希菌和志贺菌方法的建立

目的:建立一种多重实时荧光PCR同时检测EPEC、EIEC、EHEC三种致泻性大肠埃希菌和志贺菌的方法。方法:于GenBank数据库中查找三种致泻性大肠埃希菌及志贺菌毒力基因stx1、stx2、eaeA及ipaH基因序列并使用软件进行比对后设计四套引物及探针,建立四重实时荧光PCR检测EPEC、EIEC、EHEC和志贺菌的方法,并对方法反应体系及反应条件进行优化,对方法的特异性、敏感性及重复性进行分析。结果:显示该方法具有检测灵敏度高、特异性强,结果与细菌培养结果完全一致,均为100%。结论:四重实时荧光PCR检测体系可同时检测EPEC、EIEC、EHEC和志贺菌,具有快速、特异性强、灵敏度高等特点,可广泛应用于临床检验、卫生检验、食品检验等领域,对快速有效的实施针对治疗,预防食物中毒,保障公众健康具有重大意义。     

大肠埃希菌O157:H7的实时荧光PCR检测方法研究

目的建立一种敏感、特异、快速的大肠埃希菌O157:H7的检测方法,应用于突发公共卫生事件及食源性致病菌流行病学调查的检测。方法根据GenBank大肠埃希菌O157:H7rfbE基因序列,设计引物和TaqMan探针,对实时荧光PCR反应条件进行优化,建立实时荧光PCR检测大肠埃希菌O157:H7的反应体系,并对该法的特异性、敏感性和重复性进行评价。结果大肠埃希菌O157:H7菌株的检测结果均为阳性,而所有其它菌株检测结果均为阴性;该方法检测的灵敏度可达1×102cfu/ml。模拟污染的猪肉、羊肉、鸡肉、生食蔬菜样品,均可检出1×104cfu/ml的细菌。从细菌核酸提取至完成检测约需3 h。结论建立的实时荧光PCR检测方法具有灵敏度高、特异性强、快速等优点,可用于大肠埃希菌O157:H7食物中毒的快速诊断和食品微生物检测,为食源性疾病的分子流行病学调查提供新的检测手段。     

外科发热患者静脉血中大肠埃希菌DNA实时定量PCR检测与体征及血细胞计数的相关性

目的 定量检测外科发热患者静脉血中大肠埃希菌DNA含量，研究其与体征及皿细胞计数之间的相关性，并比较不同检测方法对血中大肠埃希菌的阳性检出率的差异。方法 以实时定量PCR（RQ-PCR）定量检测40份健康人静脉血标本，确定临床阳性检测限。31例发热患者共72份血标本同时进行常规细菌培养及大肠埃希菌DNA定量检测，比较两种检测方法对血中大肠埃希菌的阳性检出率的差异，两个取血时间点间大肠埃希菌DNA含量的变化，并计算大肠埃希菌DNA含量与体温、心率、白细胞计数、中性粒细胞及淋巴细胞百分比之间的相关性。结果 RQ-PCR定量检测大肠埃希菌DNA阳性率为52．78％（38／72），显著高于细菌培养阳性率2．78％（2／72）（P=0．000）。同一患者两个时间点血标本检测结果显示，静脉血中大肠埃希菌DNA在2～6小时内的升降变化达10～20倍。血中大肠埃希菌DNA含量与体温和心率之间均显著相关（P=0．000），相关程度中度密切（，值分别为0．565和0．546），与白细胞计数、中性粒细胞及淋巴细胞百分比之间无显著相关关系。结论 RQ-PCR检测外科发热患者静脉血中大肠埃希菌阳性率远高于血培养。血中大肠埃希菌DNA拷贝数变化速度较快。血细胞计数不能很好反映血中大肠埃希菌的含量，而体温心率的影响因素较多，因此RQ-PCR能更及时准确反映大肠埃希菌血症的严重程度，有助于对肠屏障损伤导致肠道细菌移位的动态程度或后果进行评估。     

双重TaqMan实时荧光PCR检测肠出血性大肠埃希菌可行性研究

目的 对肠出血性大肠埃希菌(EHEC)双重TaqMan实时荧光PCR方法应用于实际的可行性进行分析.方法 分别用传统培养方法、普通PCR方法、双重TaqMan实时荧光PCR方法对模拟样品进行检测,比较3种方法灵敏度;检测295份临床腹泻患者标本,比较三种方法检出率.结果 双重TaqMan实时荧光PCR方法的EHEC检出限为102 ～ 108cfu/ml,明显优于传统培养方法(检出限为103 ～ 108cfu/ml)和普通PCR方法(检出限为103～107 cfu/ml),且检出率为0.34％.结论 双重TaqMan实时荧光PCR方法可快速、灵敏、特异的检出肠出血性大肠埃希菌.     

大肠埃希菌耐药性检测及临床意义

目的：了解本院大肠埃希菌产超光谱β-丙酰胺酶（ESBLs）发生率,为临床治疗感染性疾病选用抗菌药物提供依据.方法：按照《全国临床检验操作规程》第3版,手工方法进行菌株分离,K-B纸片扩散法药敏试验,依据2009年CLSL标准判读药敏结果.结果：本院从临床标本分离的11株大肠埃希菌中,产ESBLs大肠埃希菌占54.55%,并且对常用抗菌药物产生多重耐药.结论：大肠埃希菌耐药比较严重,临床科室应与实验室积极配合提高病原菌检测标本送检率,尽早及时检测出病原菌及耐药性,指导临床合理用药,控制细菌耐药性产生及流行.     

致腹泻大肠埃希菌引起急性肠道感染调查分析

目的为检测急性肠道感染性腹泻中大肠埃希菌并了解其在人群中的分布状况。方法于2004年5～10月收集了我中心肠道门诊急性感染性腹泻病人543份粪便标本进行分离培养、生化鉴定和血清凝集实验以检测致腹泻大肠埃希菌，并用10种抗生素检测该菌的药物敏感性。结果致腹泻大肠埃希菌是急性肠道感染的主要病原之一。结论重视大肠埃希菌的检测，有利于早期作出明确的病原学诊断。     

大肠埃希菌的耐药性分析

革兰阴性菌已成为近年医院感染的主要细菌 ,据我院近两年对细菌的监测 ,革兰阴性杆菌占我院常见菌的 4 9.7%。大肠埃希菌排在我院常见菌的首位 ,分析其耐药情况 ,对临床治疗具有一定的指导意义。1　资料与方法　　我院临床科室送检的各类标本分离出病原菌 312株 ,其中大肠埃希菌 6 4株 ,占 2 0 .5 % ,1999年分离出细菌 32 6株 ,其中大肠埃希菌 77株 ,占 2 3.6 %。采用美国 B- D公司生产的90 5 0型微生物增长分析器和半自动细菌鉴定仪进行。2　结　果　　大肠埃希菌对青霉素类药物产生较强的耐药性 ,对氨基糖苷类抗生素尚有较好的敏感性。对…     

冷饮中1株产毒大肠埃希氏菌的检定及相关实验

产毒大肠埃希氏菌（简称ＥＴＥＣ）是引起急性腹泻的主要病原菌之一，国内外对其研究甚多，由于该菌可通过食物链得以广泛传播，冷饮类食品若被其污染，危害甚大。为此，我们于１９９８年８～１０月对市售冷饮类食品（棒冰、冰淇淋等）进行抽样调查，结果从冰淇淋中检出１株血清型为Ｏ６Ｋ１５（Ｌ）的ＥＴＥＣ。鉴于从冷饮中检出ＥＴＥＣ的报道甚少，因此我们对其进行了系统生化鉴定及相关实验研究。１　材料与方法１－１　菌株来源　从本县市售冷饮冰淇淋中检获。血清型为ＥＴＥＣＯ６Ｋ１５（Ｌ）。１－２　菌株分离与鉴定　按食品微生物…     

E-test法检测大肠埃希菌、肺炎克雷伯菌超广谱β-内酰胺酶

目的 研究临床分离的大肠埃希菌、肺炎克雷伯菌,对第三代头孢菌素和氨曲南的耐药性及其产超广谱β－内酰胺酶的测定。方法 应用纸片扩散法检测从临床标本中分离的１０７株大肠埃希菌和７８株肺克雷伯菌的耐药性,并对可颖菌株用Ｅ－ｔｅｓｔ法进行超广谱β－内酰胺酶的测定。结果 大肠埃希菌对５种抗生不的耐药率;氨曲南为２．８％;头孢曲松为７．５％;头孢噻肟为８．４％,头孢他啶为９．３％;头孢哌酶为１５．０％。产酶株