免疫基因CD1d和绿色荧光蛋白融合基因慢病毒载体的构建

目的:构建人免疫基因CD1d与绿色荧光蛋白(GFP)融合基因慢病毒载体。方法:实时定量聚合酶链反应(RT-PCR)方法扩增获得CD1d的全外显子片段,使之克隆到带GFP荧光报告基因慢病毒表达载体质粒中,慢病毒包装质粒和穿梭质粒转染293T细胞,包装成功后收集上清,浓缩,鉴定。取浓缩纯化后的病毒上清感染293T细胞,荧光显微镜观察荧光表达。结果:电泳鉴定结果与目的基因表达条带完全吻合,克隆测序结果与NCBI收录的CD1d基因序列完全一致。重组慢病毒质粒可高效转染293T细胞,荧光显微镜下可观察到大量绿色荧光。结论:成功构建了CD1d与GFP融合基因慢病毒表达载体,为进一步研究CD1d基因的相关功能提供了适合的稳定转染载体。     

NEP1-40基因慢病毒载体构建及鉴定

目的构建NEP1-40(Nogo extra cellular peptide residues 1-40)基因慢病毒表达载体,为后续转染目的细胞奠定基础,并实现在细胞中高效、稳定表达。方法从含有NEP1-40基因的cDNA文库中,利用PCR方法钓取NEP1-40基因编码区片段。将目的基因与酶切线性化的载体pGC-FU进行定向连接,其产物转化细菌感受态细胞。对长出的克隆先进行菌落PCR鉴定,再对PCR鉴定阳性的克隆进行测序和比对分析,比对正确的克隆即为构建成功的目的质粒。将构建成功的目的质粒和两种辅助包装质粒共转染293T细胞,包装成慢病毒,荧光显微镜下观察慢病毒转染293T细胞后荧光表达情况,采用Western blot检测NEP1-40及绿色荧光蛋白融合蛋白表达情况。结果 PCR产物经电泳分析表明成功获取NEP1-40基因cDNA克隆,测序提示慢病毒转染质粒连接构建正确;荧光表达检测显示293T细胞中产生慢病毒颗粒;Western blot显示NEP1-40在细胞内稳定表达。结论成功构建NEP140基因慢病毒表达载体,为后续转染目的细胞后从分子水平探讨NEP1-40基因功能奠定了实验基础。     

人PPFP基因的重组慢病毒载体的构建和表达

目的 构建含人PAX8/PPARγ/融合基因(PPFP)基因重组慢病毒载体并检测其表达性能.方法 从已构建好的含PPFP的质粒克降模板PEGFP-C-PPFP中,利用聚合酶链反应(PCR)方法钓取目的 基因PPFP,将该基因克隆到慢病毒载体表达质粒pGC-FU(含Flag基因)中,得到重组的pGC-FU-PPFP,通过PCR、酶切、测序和分析比对验证PPFP基因后,将pGC-FU-PPFP质粒和包装质粒pHelper1.0、pHelper2.0共同转染人胚胎肾上皮细胞株293T细胞,获得携带PPFP基因和Flag基因的重组慢病毒,收集并浓缩病毒上清液,测定重组病毒的滴度.通过Western blot鉴定PPFP-Flag融合蛋白在靶细胞内的表达进一步验证目的 基因在靶细胞中的表达.结果 经PCR扩增获得2591 bp的目的 基因片段,构建的重组质粒经PCR、酶切及测序和分析比对鉴定正确;该质粒与包装质粒共转染293T细胞获取的慢病毒滴度达3.5×10~7转导单位TU/ml;感染的293T细胞,Western blot结果显示条带大小为90 KDr,可判断目的 基因PPFP在293T细胞中表达.结论 成功构建PPFP基因慢病毒载体质粒pGC-FU-PPFP,并建立慢病毒过表达系统.     

应用AdEasy腺病毒载体系统构建人骨形成蛋白2基因重组腺病毒

目的利用AdEasy腺病毒载体系统构建人骨形成蛋白2(BMP2)基因重组腺病毒并在293E细胞中扩增制备重组病毒。方法自人骨形成蛋白2真核表达载体pcDNA3-hBMP2中酶切出hBMP2基因，插入pAdtrackCMV中构建成腺病毒穿梭质粒pAdtrackCMV—hBMP2，经酶切线性化后，采用电穿孔转化到事先电转化腺病毒骨架质粒pAdEasy的BJ5183大肠杆菌电感受态细菌中，挑选同源重组质粒，酶切线性化重组质粒并转染293E细胞包装成重组病毒颗粒，荧光显微镜观察绿色荧光表达。重组病毒上清感染293细胞，荧光显微镜观察绿色荧光表达。结果经限制性内切酶检测和GFP表达证实成功地构建了携带hBMP2基因的重组腺病毒载体并制备出高滴度重组病毒。结论成功地构建了携带hBMP2基因的重组腺病毒载体，为进一步研究rBMP2基因治疗奠定了基础。     

前列腺特异性膜抗原基因复制缺陷型腺病毒载体的构建及表达

目的 构建携带前列腺特异性膜抗原(PSMA)基因的复制缺陷型腺病毒载体,并检测其在真核细胞中的表达.方法 利用质粒pET-30a-PSMA行PCR扩增、酶切获得PSMA cDNA片段,并插入腺病毒穿梭质粒pAdTrack-CMV的启动子下游,构建重组穿梭载体pAdTrack-CMV-PSMA,线性化后与骨架质粒pAdEasy-1在细菌BJ5183内同源重组得到腺病毒质粒pAd-PSMA,经293A细胞包装成复制缺陷型腺病毒Ad-PSMA.将Ad-PSMA体外感染DU145细胞,蛋白质印迹法检测目的基因表达.结果 构建了携带PSMA基因的复制缺陷型腺病毒,病毒滴度1.4×109 pfu/ml,能有效感染DU145细胞,转染率约95%,并经蛋白质印迹法检测到相对分子质量约100 000的目的蛋白PSMA在DU145中表达.结论 成功构建了表达PSMA基因的复制缺陷型腺病毒载体,为开展靶向PSMA的基因免疫治疗提供了实验基础.     

慢病毒介导的miPSC-EC YAP基因过表达及稳定感染细胞系的建立

目的建立稳定过表达Yes相关蛋白(YAP)的小鼠诱导性多能干细胞来源的内皮细胞(miP SC-EC)系,为miP SC-EC过表达YAP基因的体内外实验研究奠定基础。方法将模板质粒(p CMV-Flag-YAP2-5SA)改建成慢病毒表达质粒(p PGK-2Flag-YAP2-Puro);将慢病毒表达质粒与包装质粒组成共包装系统转染293FT细胞;包装慢病毒,收集病毒原液,超滤浓缩,测定滴度。诱导miP SC分化为EC,观察其形态特征,并行组织化学鉴定。包装好的慢病毒感染miP SC-EC,嘌呤霉素筛选稳定感染的细胞系miP SC-EC/YAP,并用RT-PCR及Western blot方法验证。结果慢病毒表达质粒(p PGK-2Flag-YAP2-Puro)构建成功,并成功包装YAP基因过表达慢病毒,滴度达到1.2×109 TU/ml。miP SC诱导分化所得细胞符合EC形态特征,几乎都表达EC标志CD31。转染YAP的miP SC-EC中YAP m RNA表达水平较未转染细胞明显升高,YAP蛋白高表达(未转染细胞中YAP蛋白几乎不表达)。结论成功构建YAP基因慢病毒过表达载体,诱导miP SC分化为EC,成功建立YAP基因稳定感染细胞系miP SC-EC/YAP。     

表达人骨形成蛋白4的非复制型腺病毒的构建与鉴定

目的构建含有人骨形成蛋白4（human bone morphogenetic protein4,hBMP-4）的非复制型腺病毒表达载体pAdE/hBMP-4并检测其表达。方法酶切质粒pCS2（＋）/hBMP-4获得目的基因片段,克隆至真核表达载体pcDNA3.1（＋）,再亚克隆至pShuttle-CMV,电转化至含有pAdEasy-1骨架质粒的E.coliBJ5183/p中进行同源重组,重组质粒转染HEK293细胞包装成含有hBMP-4基因的非复制型腺病毒。病毒颗粒感染HEK293和HeLa细胞,提取总RNA和总蛋白,进行RT-PCR和Western-blot检测。结果获得了含有目的基因hBMP-4的非复制型腺病毒表达载体pAdE/hBMP-4,酶切鉴定提示构建正确,RT-PCR检测到hBMP-4基因的转录,Western-blot检测到hBMP-4蛋白表达。结论将目的基因hBMP-4克隆至非复制型腺病毒表达载体中,为进一步研究其在基因治疗骨缺损中的应用奠定基础。     

携带IL-13基因大鼠肝干细胞系的建立

目的 构建包含IL-13基因片段的慢病毒载体,培养IL-13基因工程大鼠肝干细胞(肝卵圆细胞,HOC,WB-F344细胞),将IL-13基因重组至WB-F344细胞中,使之可分泌大鼠IL-13.方法 人工合成大鼠IL-13基因,利用pWPXL-MOD(TG-005)载体构建包含大鼠IL-13基因片段的质粒; 制备慢病毒穿梭质粒及其辅助包装元件载体质粒,四质粒载体(组成为pRsv-REV、pMDlg-pRRE、pMD2G及目的穿梭质粒)分别进行高纯度无内毒素抽提,共转染293T细胞,培养48 h后,收集富含慢病毒颗粒的细胞上清液,对其浓缩后得到高滴度的慢病毒浓缩液,定量PCR检测病毒滴度.将构建好的慢病毒感染WB-F344细胞,5 d后采用real-time PCR检测WB-F344细胞中IL-13的表达水平,Western blot检测重组蛋白表达水平.结果 成功构建了IL-13过表达慢病毒载体,并获得IL-13基因工程大鼠肝干细胞; 将IL-13基因重组至WB-F344细胞基因组中,并可在细胞中进行转录,慢病毒感染WB-F344细胞存在IL-13 mRNA表达,可分泌大鼠IL-13.结论 构建的基因工程WB-F344细胞能显著分泌大鼠IL-13,感染后的WB-F344细胞的IL-13表达水平显著高于感染前,满足动物实验要求.     

OX40-IgG1融合基因重组表达载体的构建及鉴定

目的:构建含人OX40-IgG1融合基因的真核表达载体pDC315-0X40Ig,表达具有生物学活性的OX40Ig融合蛋白,为诱导异体复合组织移植免疫耐受的基因治疗作准备.方法:全基因合成目的基因OX40Ig,即人0X40胞外段序列及人IgG1 Fc段序列,将该片段插入到pUC57(+)载体后,亚克隆至真核表达载体pDC315(+),构建pDC315-0X40Ig重组质粒.构建的重组质粒经PCR、酶切及测序鉴定后,用脂质体法转染于NIH/3T3细胞.以SDS-PAGE与Western Blotting检测细胞培养上清中OX40Ig融合蛋白的表达情况;MTT法观察OX40Ig对混合淋巴细胞反应(MLR)的抑制作用.结果:合成的目的基因全长1320bp,构建的重组质粒经PCR,双酶切及测序鉴定正确.SDS-PAGE与Western Blotting证实OX40Ig融合蛋白在3T3细胞中实现表达,表达产物相对分子量为48000左右,与理论预期值相符.体外实验证实OX40Ig蛋白能够抑制异基因淋巴细胞的MLR.结论:成功构建了人OX40-IgG1融合基因真核表达载体pDC315-OX40Ig,体外实验证实表达的OX40Ig蛋白可抑制淋巴细胞增殖,为干预同种异体复合组织移植排斥反应奠定了基础.     

构建携带hTERT基因的慢病毒重组载体及其包装和表达

目的构建含hTERT基因的慢病毒重组载体,进行病毒包装并检测hTERT在293T细胞中的表达。方法PCR扩增hTERT．插入慢病毒载体,并与包装质粒转染293T细胞,进行病毒包装,并测定其滴度。Western—Blot检测慢病毒液感染293T细胞后hTERT的表达。结果成功构建了含hTERT的慢病毒重组载体,滴度为2．79×10^7Tu／mL,Western-B10t检测显示慢病毒液感染的293T细胞中hTERT基因高表达。结论含hTERT的慢病毒重组载体成功构建并包装后能够顺利感染293T细胞．并阳性表达目的基因。     

重组Akt腺病毒的构建及其在肝硬化大鼠肝脏中的表达

目的:探讨持续活化Akt且带有HA标签(myr-HA-Akt)基因的重组腺病毒在肝硬化大鼠肝脏中的表达特性。方法:酶切正向插入目的基因的真核表达载体pcDNA3.1-myr-HA-Akt,获得myr-HA-Akt cDNA后，将其定向克隆到穿梭质粒pDC316中,然后将重组质粒与病毒骨架质粒pBHGloxΔE1,3Cre共转染293 细胞,获得复制缺陷型重组腺病毒Ad-myr-HA-Akt,并进行扩增、纯化。通过观察腺病毒感染293细胞后是否出现细胞病变效应;PCR和基因测序方法对所构建病毒进行鉴定，并采用TCID50法检测病毒滴度。自尾静脉注射重组腺病毒Ad-myr-HA-Akt感染肝硬化模型大鼠。免疫印迹法检测大鼠肝组织内Akt 和p-Akt蛋白的表达。结果:感染的293 细胞出现明显的细胞病变效应，PCR产物电泳证实重组腺病毒的存在，基因测序证实myr-HA-Akt的cDNA正确插入穿梭质粒且与pBHGloxΔE1,3Cre正确同源重组;病毒滴度为5.5×1011 vp/mL。从蛋白水平证实感染病毒的肝硬化模型大鼠有外源性Akt基因的表达。结论:构建的重组腺病毒Ad-myr-HA-Akt能有效地感染肝硬化模型大鼠,并可在模型大鼠中正确转录和翻译，为进一步研究腺病毒介导的Akt基因对肝硬化的治疗奠定了实验基础。     

靶向大鼠诱导型一氧化氮合酶基因的shRNA重组腺病毒载体的构建及鉴定

目的 构建携带增强型绿色荧光蛋白基因(EGFP)标志针对大鼠诱导型一氧化氮合酶(iNOS)基因的shRNA重组腺病毒载体并在人胚肾-293细胞中扩增制备重组病毒.方法 利用AdMax包装系统,用先期构建的带有EGFP标记基因的穿梭质粒pDC316-iNOS-shRNA-EGFP,与骨架质粒pBHGlox_El,3Cre共转染293包装细胞,同源重组产生复制缺陷型重组腺病毒载体Ad5-inosshRNA-EGFP,反复感染293细胞扩增病毒后,离子交换法纯化病毒,并测定病毒颗粒数及滴度.结果 经聚合酶链反应(PCR)检测和EGFP表达证明已成功构建了携带iNOS-shRNA-EGFP的重组腺病毒载体;扩增纯化后,测得重组腺病毒颗粒数为3.6×1011 VP/ml,A260/A280值约为1.25,病毒活性为7.94×109IU/ml.结论 已成功构建重组腺病毒载体Ad5-inos-shRNA-EGFP,为利用基因激活技术治疗勃起功能障碍的研究奠定实验基础.

Abstract：

Objective To construct an adenovirus vector expressing short hairpin RNA (shRNA)of rat inducible oxide synthase (iNOS) carrying enhanced green fluorescent protein (EGFP) and amplify the adenovirus vector in HEK-293 cells. Methods The shuttle plasmid pDC316-inos-shRNA-EGFP that was constructed at an earlier date, was cotransfected with the adenovirus skeleton plasmid pBHGlox_E1,3Cre into 293 cells to obtain the produced replication defective recombinant adenovirus vector Ad5-inosshRNA-EGFP. The recombinant adenovirus was propagated by repeat infection of 293 cells and purified by ion exchange method, then the virus particles were counted and the purity and titer were determined.Results Recombinant adenoviral vector Ad-ACE-shRNA was constructed successfully, which was confirmed by polymerase chain reaction (PCR) and GFP expression. After amplification and purification, the virus particle count, A260/A280 and titer of recombinant adenovirus were 3.6 × 1011 VP/ml, 1.25 and 7.94 ×109 IU/ml,respectively. Conclusion Recombinant adenovirus vector Ad5-inos-shRNA-EGFP is successfully constructed, which laid a foundation for gene activation in erectile dysfunction treatment.     

Lck反义RNA重组腺病毒载体的构建及其对肾小管上皮细胞Lck表达的影响

目的:观察淋巴细胞特异性蛋白酪氨酸激酶(Lck)在肾小管上皮细胞中的表达及Lck反义RNA对其表达的影响.方法:采用RT-PCR方法从肾小管上皮细胞中获得Lck目的基因片段,将目的基因片段反向插入pDC 316质粒中,构建Lck反义RNA穿梭质粒(pDC 316-antisenseLck),经PCR、酶切及测序鉴定正确后,将此穿梭质粒与辅助质粒pBHGloxΔE1,3Cre 共转染HEK 293细胞,重组产生Lck基因反义RNA腺病毒载体(Ad-antisenseLck).用此重组腺病毒感染体外培养的肾小管上皮细胞,Western blotting方法观测此重组腺病毒载体对IL-2诱导的Lck蛋白表达的影响.结果:构建出Lck反义RNA重组腺病毒载体,此重组腺病毒载体感染培养的肾小管上皮细胞后可明显抑制IL-2诱导的Lck蛋白表达(P<0.05),抑制率可达47%.结论:成功构建出Lck反义RNA重组腺病毒载体,此载体可在肾小管上皮细胞内发挥生物学作用,显著阻抑肾小管上皮细胞的Lck蛋白表达.     

重组血管内皮生长因子165-PE38融合基因的构建及其对人脐静脉内皮细胞的抑制作用

目的 构建血管内皮生长因子(VEGF)基因和铜绿假单胞菌外毒素(PE38)基因真核融合表达载体,观察其表达产物对人脐静脉内皮细胞(HUVECs)的影响.方法 通过聚合酶链反应(PCR)获得VEGF165基因片段,通过Hind Ⅲ和EcoR Ⅰ双酶切pRB391质粒获得PE38基因.构建两融合基因的真核表达载体plRES2-VEGF165-PE38-EGFP,转染293细胞后用逆转录(RT)-PCR及ELISA检测VEGF165-PE38融合蛋白在293细胞的表达,并检测转染细胞的培养上清对HUVECs的选择性细胞毒作用.结果 成功构建VEGF165-PE38融合基因真核表达载体,其可在293细胞表达,ELISA检测表明空质粒转染组、无转染组和重组质粒转染组VEGF浓度分别为(269.0±23.6)、(306.0±29.3)和(1390.0±136.6)ng/L.CCK-8和TUNEL检测表明重组质粒细胞转染上清对HUVECs具有较强的细胞抑制效应,凋亡细胞率分别为8.34%、7.69%和39.88%,差异有统计学意义(P<0.05).结论 VEGF 165-PE38融合基因构建,表达及其功能的初步研究,为肿瘤血管内皮细胞的靶向治疗及临床应用奠定了基础.     

下调TPH2重组慢病毒载体的构建及鉴定

目的 构建色氨酸羟化酶(TPH)-2基因小干涉RNA的重组慢病毒载体.方法 在TPH-2 mRNA序列中选择1个特异性靶序列,体外合成对应发卡样DNA片段,经退火后,将其定向克隆入siRNA载体,获得重组质粒pU6 -MCS-CMV-TPH2-shRNA,后者与慢病毒试剂共转染293细胞,同源重组产生Lentivirus-TPH2-siRNA.经聚合酶链反应(PCR)鉴定目的基因的表达并测定病毒滴度.结果 PCR表明Lentivirus-TPH2-siRNA构建正确,病毒滴度为3×108 TU/rnl.结论 获得的Lentivirus-TPH2-siRNA可以用于转基因瘙痒治疗的实验研究.     

人胚肾细胞SGLT2基因异源表达体系的构建

目的 构建钠依赖的葡萄糖转运蛋白2（SGLT2）基因异源表达体系,为探讨突变引起SGLT2蛋白功能及表达异常的分子机制提供实验依据。 方法 利用RT-PCR法从人肾组织中获得SGLT2基因,将该基因克隆到真核表达载体PEXL-GFP（绿色荧光蛋白）中,将携带有SGLT2基因的PEXL载体转染人胚肾细胞系（HEK293细胞）,获得目的蛋白的瞬时表达。应用Western印迹及激光共聚焦显微镜检测融合蛋白在HEK293细胞的表达和分布,并通过摄取实验进一步验证SGLT2蛋白的转运功能。 结果 SGLT2-GFP蛋白可在HEK293细胞表达,激光共聚焦显微镜观察发现,SGLT2-GFP蛋白在细胞膜上呈点状分布,并且与细胞膜标记物（DiI）有良好的共定位,转染SGLT2-GFP质粒的HEK293细胞的转运活性较对照组（未转染及转染空质粒细胞组）强约3.5倍（P < 0.01）。 结论 成功构建了SGLT2真核表达载体,为探讨SGLT2基因表达、功能及SGLT2突变在家族性肾性糖尿发病的遗传机制提供了重要的依据。     

可调控表达人骨形态发生蛋白2基因的腺病毒载体系统的构建

目的构建可调控人骨形态发生蛋白2（hBMP2）基因表达的重组腺病毒载体系统,为骨缺损的修复提供新思路。方法基因测序验证pcDNA3．1－hBMP2质粒的准确性,将酶切得到的hBMP2基因片段亚克隆到穿梭载体质粒pTRE—Shuttle2的多克隆位点,将pTRE—Shuttle2-hBMP2线性化并连接至腺病毒骨架质粒Adeno—XSystem 1 Viral DNA上,构建重组的Adeno—X－pTRE—hBMP2载体;用PacI酶将其线性化后脂质体法（Lipofectamine 2000）转染HEK293细胞,获得有感染能力的重组腺病毒颗粒,收集病毒上清进行hBMP2基因PCR鉴定;将包含rtTA激活因子的Adeno—X Tet—Onvirus Stock感染HEK293细胞包装扩增病毒。结果hBMP2基因被成功定向克隆到腺病毒骨架质粒Adeno—X System 1 Viral DNA上,转染HEK293细胞后获得有感染能力的重组腺病毒颗粒。结论本研究成功构建了hBMP2基因的腺病毒Tet—On表达系统,为实现hBMP2基因在靶细胞水平上的调控表达提供前期实验基础。     

含人β1转化生长因子短发夹RNA重组腺病毒载体的构建和鉴定

目的 构建含人β1转化生长因子(TGF-β1)短发夹RNA(short hairpin RNA,shRNA)的复制缺陷型腺病毒载体.方法 通过聚合酶链式反应(PCR)法将带有TGF-β1 shRNA 序列构建至U6启动子(U6sh TGF-β1)下游,与T载体连接,将质粒转化人大肠杆菌.将U6sh TGF-β1连到穿梭质粒pDC316上,与腺病毒基因组质粒pBHGlox△E1、3Cre共转染293T细胞,得到重组腺病毒载体(rAd TGF-β1).经PCR鉴定正确后,进行扩增、纯化、滴度测定及感染性鉴定.结果 PCR法得到目的 片段U6sh TGF-β1,经测序,序列与设计方案完全一致.rAd TGF-β1具有良好的感染性,腺病毒滴度可达107.3TCID50/ml.双引物PCR法鉴定Ad TGF-β1可扩增出腺病毒E2b区片段及特异性片段U6sh TGFβ1.结论 成功构建了能表达TGF-β1 shRNA 的重组腺病毒载体rAd TGF-β1(A)及对照载体rAdTGF-β1(B),可能为临床应用RNA干涉--新的基因技术防治瘢痕疙瘩提供高效的方法.