多聚凝胶介导IGF-IR反义寡核苷酸治疗体内胶质瘤的实验研究

目的探讨反义寡核苷酸阻断IGF-IR基因表达对裸鼠移植胶质瘤的抑制作用。方法首先建立胶质瘤裸鼠移植模型,随机分为4组:空白对照组、多聚凝胶组、正义核酸组和反义核酸组,反义核酸组在瘤内注射多聚凝胶包裹的反义寡核苷酸,其他每组均作相应的瘤内注射处理。利用多聚凝胶缓释反义寡核苷酸的作用,观察肿瘤的抑制情况、肿瘤病理和IGF-IR表达结果。结果反义核酸组用反义核苷酸开始治疗后的第1周、第2周和第3周,肿瘤的生长速度明显减慢,与空白对照组相比,抑制率分别为65.2%、76.38%和69.6%;而多聚凝胶组和正义核酸组肿瘤生长速度与空白对照组相比无明显差异,其抑制率在各时间点均低于10%。肿瘤的组织病理发现多聚凝胶组、正义核酸组如同空白对照组(野生型),肿瘤细胞密集分布,呈明显的恶性增殖表现,而反义核酸组肿瘤细胞稀疏,可见部分细胞呈凋亡改变,细胞染色质浓聚边缘化。在空白对照组(野生型)、多聚凝胶组和正义核酸组IGF-IR蛋白均呈高表达,而反义核酸组IGF-IR的表达明显减弱。结论IGF-IR的反义寡核苷酸对体内胶质瘤的生长具有明显的抑制作用,并能诱导部分肿瘤细胞凋亡。因此,IGF-IR可作为胶质瘤基因治疗的靶。     

IGF-IR反义寡核苷酸对胶质瘤细胞增殖的影响

目的 根据胰岛素样生长因子-受体（IGF-IR）基因序列设计了IGF-IR mRNA起始密码子下游的硫代磷酸型反义寡核苷酸和正义寡核苷酸，研究其对C6胶质瘤细胞增殖作用。方法 实验分为反义核酸组、正义核酸组和空白对照组，经细胞计数、MTT法研究反义核苷酸对胶质瘤细胞生长和增殖的抑制作用。并应用免疫细胞化学方法检测胶质瘤细胞IGF-IR和增殖细胞核抗原（PCNA）蛋白的表达。结果 反义寡核苷酸能有效地降低IGF-IR基因的表达，抑制体外培养的胶质瘤细胞的增殖，其抑制作用24h显效，96h仍有作用，反义寡核苷酸的抑制效果与其作用浓度有关。而正义寡核苷酸对其无抑制作用。同时可见反义寡核苷酸抑制增殖作用中，能明显下调PCNA蛋白的表达。结论 IGF-IR介导的IGF-I-IGF-IR的自（旁）分泌环对胶质瘤生长极其重要，通过IGF-IR反义寡核苷酸治疗能较有效地抑制胶质瘤细胞的增殖。     

反义基因片段抑制胶质瘤细胞IGF-IR基因表达的研究

目的 探讨反义基因片段对胶质瘤细胞胰岛素样生长因子-I受体（IGF-IR）基因表达抑制作用的可行性。方法 应用RT-PCR技术和免疫细胞化学方法，并经图象分析以检测反义寡核苷酸作用后细胞IGF-IR基因的表达水平的变化。结果 反义寡核苷酸能有效地降低IGF-IRmRNA表达，并随着反义核苷酸浓度的增加，其mRNA水平逐渐减少。正义核酸组与空白对照组相比较，IGF-IRmRNA水平无显著性差异。免疫细胞化学方法和生物图像分析研究发现；反义核酸组细胞IGF-IR蛋白低表达或不表达，而空白对照组和正义核酸组细胞均呈高表达。结论 针对IGF-IR基因mRNA序列起始密码子及下游序列所设计的反义寡核苷酸能有效阻止mRNA的翻译功能，使其蛋白产物表达下调，达到封闭或减弱该基因表达的目的。     

尿激酶型纤维蛋白酶原激活物受体的反义基因片断抑制胶质瘤u25i细胞的体外侵袭

目的：研究尿激酶型纤维蛋白酶原激活物受体（uPAR）的反义基因片断对胶质瘤细胞株u251体外侵袭能力的影响。方法：脂质体介导寡核苷酸转染培养的u251胶质瘤细胞，用RT—PCR、原位杂交和免疫组化方法分别检测相关基因和蛋白的表达，Boyden小室模型研究对肿瘤细胞侵袭能力的影响。结果：uPAR反义寡核苷酸作用u251胶质瘤细胞后相关基因的mRNA及蛋白的表达明显减弱，细胞的体外侵袭能力被明显抑制。结论：uPAR的反义寡核苷酸片断能有效地抑制胶质瘤细胞u251相关基因的表达，并能抑制胶质瘤细胞的体外侵袭能力。     

反义IGF-ⅠR基因片段诱导胶质瘤细胞凋亡的流式细胞仪分析和电镜观察

目的探讨反义胰岛素样生长因子-Ⅰ受体(IGF-ⅠR)基因片段诱导胶质瘤细胞凋亡的作用及其形态学的变化。方法根据IGF-ⅠRcDNA序列设计其正义、反义基因片段,并对部分碱基进行硫代磷酸修饰。实验分为空白对照组、正义寡核苷酸组和反义寡核苷酸组,应用流式细胞仪检测DNA含量,根据DNA直方图分析凋亡细胞发生率。应用透射电镜观察凋亡细胞的形态学变化。结果经反义寡核苷酸5μmol/L、10μmol/L、15μmol/L、20μmol/L等4种浓度处理的胶质瘤细胞的凋亡率分别为(16.06±3.86)%、(24.52±4.84)%、(36.69±5.53)%和(43.85±5.72)%;而经同样浓度正义寡核苷酸处理的胶质瘤细胞的凋亡率分别为(3.76±1.22)%、(3.14±1.15)%、(2.51±0.93)%和(3.26±1.15)%;空白对照组(野生型)的自然凋亡率为(1.01±0.89)%。反义寡核苷酸组与空白对照组相比差异有显著性意义(P<0.05),而正义寡核苷酸组与空白对照组之间差异则无显著性意义(P>0.05)。透射电镜观察显示,凋亡细胞表现为细胞体积缩小,染色质凝聚,并聚集于核膜下呈新月状或块状,胞膜内陷形成膜包裹的核碎片或细胞器,最后出泡形成凋亡小体。结论反义IGF-ⅠR基因片段可诱导胶质瘤细胞发生凋亡。     

反义IGF-1基因治疗C6鼠脑胶质瘤的体内实验研究

目的 明确IGF－1在脑肿瘤发生发展中的作用并为基因治疗优选靶的。方法 采用Wistar大鼠C6脑胶质瘤模型进行反义IGF－1基因治疗,通过MRI及病理活检等手段。动态观察,分析各时限治疗组与对照组动物（每组10只）肿瘤的判别,结果（1）颅内种植肿瘤后,反义治疗组肿瘤不断 减小至8周后几乎完全消失,动物生存期超过80天的观察期,对照组均因肿瘤增大在2周期前后死亡;（2）治疗组肿瘤相对于同时限对照组者凋亡细胞,淋巴细胞浸润增加,IGF－1表达,细胞增殖活性有所下降,结论反义IGF－1基因治疗能有效抑制大鼠体内胶质瘤的恶性进展,IGF－1表达减少使用细胞增殖活性下降和免疫系统攻击增强可能是治疗组肿瘤消失的双重原因。     

反义AKT2 RNA抑制U251胶质瘤细胞生长的体内外研究

目的 研究反义AKT2RNA对U251人脑胶质瘤细胞在体内外的生长抑制效用。方法 将逆转录病毒pLXSN为载体的反义AKT2构建体转染U251人脑胶质瘤细胞系，应用蛋白印记确定基因转染前后AKT2的表达水平。流式细胞法与Matrigel基质生长实验评价肿瘤细胞转染前后的增殖活性。进一步应用裸鼠皮下荷瘤模型观察脂质体介导pLXSN、pLXSN-AS-AKT2基因治疗对U251细胞生长抑制作用。在28d的观察期内定期测量皮下肿瘤体积，对肿瘤标本应用免疫组化的方法进行AKT2和胶质纤维酸性蛋白（GFAP）表达比较。结果 脂质体介导pLXSN-AS-AKT2可显著抑制U251细胞AKT2表达。与对照组和pLXSN转染组比较，细胞周期分析结果表明AK—AKT2转染组进入S期的细胞数减少了8．5％～8．9％，而进入G0＋G1期细胞则增加了7．9％～8．6％。Matrigel基质生长实验显示对照组和pLXSN转染组细胞呈正常形态贴壁生长，而AS～AKT2转染组细胞不能贴壁生长，呈团块状簇集生长。裸鼠皮下荷瘤模型实验显示pLXSN-AS-AKT2显著抑制皮下肿瘤生长，组织病理学分析显示AS-AKT2转染组AKT2表达下降而GFAP表达上调。结论 体内外实验证明反义AKT2方法在抗胶质瘤增殖方面作用重要，AKT2可作为基因治疗胶质瘤的优选靶标。     

反义基因片段抑制人胶质瘤u251增殖和侵袭的体外研究

目的:研究反义PCNA及uPAR基因片段对胶质瘤细胞株u2 5 1体外增殖和侵袭能力的影响。方法:用脂质体介导寡核苷酸转染培养的u2 5 1胶质瘤细胞,RT PCR、原位杂交和免疫组化等方法分别检测相关基因和蛋白的表达,MTT比色法研究对胶质瘤细胞增殖能力的影响,Boyden小室模型研究对细胞侵袭能力的影响。结果:PCNA及uPAR反义寡核苷酸作用u2 5 1胶质瘤细胞后相关基因的mRNA及蛋白的表达明显减弱,细胞的体外增殖和侵袭能力明显被抑制。结论:反义PCNA及uPAR寡核苷酸片段能有效地抑制胶质瘤细胞的u2 5 1相关基因的表达,并能抑制胶质瘤细胞的体外增殖和侵袭能力。     

反义AKT2 cDNA治疗C6胶质瘤的体内外实验研究

目的研究反义AKT2(antisense AKT2，AS—AKT2)cDNA对鼠脑胶质瘤细胞系C6的生长抑制作用。方法将AS—AKT2 cDNA构建体转染鼠脑胶质瘤细胞系C6，原位杂交和蛋白印迹鉴定后，应用PCNA阳性率和MTT法检测细胞增殖能力，TUNEL法计算凋亡指数。应用立体定向技术将C6细胞和转染反义AKT2 cDNA的C6细胞种植到SD大鼠的右侧尾状核作为对照组和转染组；并对颅内已经形成C6胶质瘤的大鼠进行脂质体包裹的AS—AKT2 cDNA和空载体治疗；MRI动态监测大鼠颅内肿瘤生长情况，并检测标本AKT2和PCNA表达以及细胞的凋亡情况。结果转染AS—AKT2 cDNA后C6细胞AKT2表达显著抑制，增殖减慢，凋亡指数增加。反义治疗组和转染组大鼠生存时间明显延长；转染组和治疗组肿瘤标本AKT2表达下降或消失，PCNA阳性率降低，可见大量凋亡细胞，而对照组和空载组标本几乎没有凋亡细胞。结论体内外实验证明AS—AKT2 cDNA可以抑制肿瘤细胞增殖、诱导凋亡，AKT2可作为基因治疗胶质瘤的重要优选靶的。     

尿激酶型纤维蛋白酶原激活物受体的反义基因片断抑制胶质瘤u251细胞的体外侵袭

目的:研究尿激酶型纤维蛋白酶原激活物受体(uPAR)的反义基因片断对胶质瘤细胞株u251体外侵袭能力的影响。方法:脂质体介导寡核苷酸转染培养的u251胶质瘤细胞,用RT-PCR、原位杂交和免疫组化方法分别检测相关基因和蛋白的表达,Boyden小室模型研究对肿瘤细胞侵袭能力的影响。结果:uPAR反义寡核苷酸作用u251胶质瘤细胞后相关基因的mRNA及蛋白的表达明显减弱,细胞的体外侵袭能力被明显抑制。结论:uPAR的反义寡核苷酸片断能有效地抑制胶质瘤细胞u251相关基因的表达,并能抑制胶质瘤细胞的体外侵袭能力。     

血小板源生长因子B链反义寡核苷酸体内抑瘤作用的研究

目的 探讨阻断血小板源生长因子B链表达对裸鼠移植脑膜瘤的影响。方法 首先建立脑膜瘤裸鼠移植模型，观察转染PDGF B链反义寡核苷酸对移植瘤生长的影响。结果 PDGF B链反义寡核苷酸能够阻断裸鼠移植脑膜瘤表达PDGF B链，导致细胞增殖活性减弱，细胞生长受到抑制。结论 PDGF B链可作为脑膜瘤基因治疗的靶点。     

反义寡核苷酸逆转大鼠胶质瘤细胞多药耐药性的实验研究

目的探讨针对多药耐药基因(MDR-1)上特异位点的反义寡核苷酸对体外培养的大鼠胶质瘤细胞多药耐药性的逆转作用。方法根据MDR-1基因的碱基序列设计合成硫代修饰的寡核苷酸,通过阳离子脂质体介导转染胶质瘤耐药细胞,应用流式细胞仪、RT-PCR等方法,对转染后的耐药细胞进行P-170、MDR-1mRNA水平的检测;用MTT法对转染后的细胞进行化疗药物敏感性试验,评价寡核苷酸对多药耐药性的逆转效果。结果流式细胞结果显示转染后胶质瘤耐药细胞P-170表达明显低于转染前(P<0.05);RT-PCR可见转染后细胞的MDR-1mRNA水平减低;药物敏感性试验显示反义寡核苷酸转染后胶质瘤耐药细胞对化疗药物的敏感性增强(P<0.05),含有脂质体的转染体系组对化疗药物的敏感性显著高于不含脂质体的转染体系组(P<0.01)。结论特异序列的反义寡核苷酸能够明显抑制大鼠胶质瘤细胞的P-170表达和减低MDR-1mRNA水平,进而对胶质瘤细胞的多药耐药性产生明显的逆转作用;应用阳离子脂质体作为转染载体可显著提高转染效率。     

Insulin-like growth factor-I decreased etoposide-induced apoptosis in glioma cells by increasing bcl-2 expression and decreasing CPP32 activity

AIMS: In a variety of tumors, the susceptibility of the tumor cells to apoptotic cell death following chemotherapy is a major determinant of therapeutic outcome. Gliomas are resistant to most chemotherapeutic agents, and its mechanism is not known in detail. In an attempt to understand the mechanism of chemo-resistance, we investigated the roles of insulin-like growth factor-I (IGF-I), IGF-I receptors (IGF-IR), and their relationship with the apoptotic response of two glioma cell lines to etoposide, a chemotherapeutic agent for malignant gliomas. METHODS: Two human glioma cell lines, U-87MG and KNS-42, were used. Etoposide-induced cell growth inhibition was quantified using a modified MTT (3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyl tetrasodium bromide), colorimetric assay. Hoechst 33258 staining, DNA fragmentation assay, and western blot were used for the evaluation of apoptosis. ApoAlert caspase assay was used for measuring the activity of caspase-3 (CPP32) and interleukin-1 beta -converting enzyme (ICE) protease. In addition, the effect of IGF-IR antisense was tested in U-87MG and KNS-42 glioma cell lines. RESULTS: Etoposide inhibited the growth of U-87MG and KNS-42 cells in a concentration-dependent manner. Etoposide increased the expression of wild-type p53, activated CPP32 (but not ICE) activity, and induced apoptosis in these cells. IGF-I prevented etoposide-induced apoptosis by increasing the expression of bcl-2 and decreasing the activity of CPP32. IGF-IR antisense enhanced the apoptotic effect of etoposide. CONCLUSIONS: IGF-I decreased etoposide-induced apoptosis in glioma cells by increasing the expression of bcl-2 and decreasing the activity of CPP32. The antisense of IGF-IR increased etoposide-induced apoptosis. The anti-apoptotic effect of IGF-I and IGF-IR might be related to the chemo-resistance of glioma to chemotherapeutic agents.     

稳定表达荧光素酶裸鼠垂体腺瘤移植瘤模型的建立

目的 建立稳定表达荧光素酶的裸鼠垂体腺瘤移植瘤模型,并通过活体生物发光成像系统实时观察移植瘤的生长特点.方法 经G418药物选择性对转染细胞进行筛选,获得稳定表达荧光素酶的GH3-1uc和MMQ-1uc细胞系.将两株细胞系分别皮下接种于BALB/c裸鼠,建立BALB/c裸鼠移植瘤模型,利用活体生物发光成像系统观察肿瘤的成瘤和生长情况.结果 本组成功构建稳定表达荧光素酶的裸鼠GH3 - 1uc和MMQ-1uc移植瘤模型.体表直尺测量显示:移植瘤在接种MMQ-1uc和GH3-1uc细胞后10d内生长均较缓慢,15～30d肿瘤体积迅速增长,且MMQ-1uc移植瘤较GH3-1uc移植瘤生长快.活体生物发光成像系统荧光测量显示:接种GH3-1uc细胞移植瘤20 d时的荧光强度明显高于10d的荧光强度.活体生物发光成像系统荧光测量与取瘤直尺测量的肿瘤体积变化趋于一致,而体表直尺测量的肿瘤体积偏小.结论 稳定表达荧光素酶的裸鼠垂体腺瘤移植瘤模型的成功建立,不仅可用于活体生物发光成像系统实时观察肿瘤的成瘤及生长情况,而且为垂体腺瘤的研究及药物开发提供了方便、有效的平台.     

纳米高聚合物转导Survivin反义寡核苷酸对大肠癌的体内杀伤作用*

背景：近年来纳米载体已被视为突破基因转移瓶颈最有前途的技术之一。聚酰胺-胺型树枝状高聚合物(polyamidoamine,PAMAM)是一种新型的纳米材料,体内外实验表明,PAMAM比其他阳离子载体的基因转染效率高、细胞毒性低。 目的：探讨PAMAM介导Survivin反义寡核苷酸(Survivin antisense oligonucleotide,Survivin-asODN)对结直肠癌裸鼠移植瘤的抑制作用。 设计、时间及地点：肿瘤基因治疗体内实验,于2008-02/08在上海交通大学微纳米科学技术研究院生物纳米工程研究室及南方医科大学珠江医院中心实验室完成。 材料：人结直肠癌细胞株SW620购自中科院上海细胞所,PAMAM树形分子由上海交通大学微纳米研究院生物纳米工程研究室提供,脂质体LipolifectmainTM2000购自美国Invitrogen公司。Survivin-asODN由上海生工公司合成。 方法：将PAMAM和阳离子脂质体分别与Survivin-asODN混合得到载反义基因转染复合物。透射电镜观察复合物的形态,激光散射粒径分析仪测定粒径,zeta电位分析仪测定复合物的zeta电位,离心法和紫外分光分度仪测定复合物的包封率和体外DNA释放速度。将对数生长期的人结直肠癌细胞SW620细胞接种于18只Balb/C裸鼠皮下建立结直肠癌裸鼠皮下移植瘤模型,随机均分为脂质体组、PAMAM组和空白对照组。分别注射脂质体-survivin-asODN转染复合物、PAMAM-survivin-asODN转染复合物、血清培养液,观察两组移植瘤体积,Western bloting方法检测移植瘤组织中survivin基因的表达。 主要观察指标：阳离脂质体-survivin-asODN复合物及PAMAM-survivin-asODN复合物的粒经,zeta电位,基因载药率,包封率,释放率,转染后survivin表达率及对凋亡的诱导率,种植肿瘤生长抑制率,移植瘤细胞Survivin蛋白的表达及活性。 结果：PAMAM-survivin-asODN复合物的粒径小于脂质体-survivin-asODN复合物的粒径(P < 0.01),而zeta电位高于PAMAM- survivin-asODN复合物zeta电位(P < 0.05),基因包封率两组差异无显著性意义。PAMAM对DNA持续释放达14 d,但脂质体复合物只持续5 d。PAMAM- survivin- asODN复合物治疗组裸鼠移植瘤survivin蛋白表达低于脂质体-survivin- asODN复合物组(P < 0.05)。PAMAM- survivin-asODN复合物治疗组移植瘤体积低于脂质体-survivin-asODN复合物组(P < 0.05)。 结论：PAMAM能将Survivin-asODN高效递送到结直肠癌移植瘤细胞,降低survivin蛋白的表达,抑制移植瘤生长。 关键词：聚酰胺-胺型树枝状高聚合物;结直肠癌;反义寡核苷酸;Survivin doi:10.3969/j.issn.1673-8225.2009.47.045     

胃肠道间质瘤细胞组织在不同周龄裸小鼠不同部位的成瘤情况

背景：建立合适的人胃肠道间质瘤裸鼠动物模型,可为以后在活体状态下研究胃肠道间质瘤细胞提供一个必不可少的工具。 目的：观察胃肠道间质瘤细胞组织块接种于不同周龄裸小鼠腋下和臀部的成瘤情况。 方法：将胃肠道间质瘤细胞组织块分别接种于4,8周龄BALB/c(nu/nu)裸鼠的腋下和臀部,观察在一定时间内,不同周龄裸鼠不同部位的瘤体成瘤率,生长速度,破溃率和转移率。 结果与结论：4周龄裸鼠的成瘤率及生长速度明显高于8周龄裸鼠(P < 0.05),且接种于腋下的成瘤率较臀部高;4周龄与8周龄裸鼠的肿瘤破溃率差异无显著性意义(P > 0.05),但接种于臀部的肿瘤破溃率大于腋下(P < 0.05);在肿瘤软化消失率方面,8周龄裸鼠明显高于4周龄裸鼠(P < 0.05),同龄裸鼠中,臀部高于腋下。说明不论接种部位如何,周龄越小的裸鼠,移植瘤成瘤率越高、生长速度越快;但对于相同周龄的裸鼠,不论接种部位如何,肿瘤生长速度无明显差异。     

建立人脑膜瘤裸鼠皮下移植模型的研究

目的探讨人脑膜瘤裸鼠皮下移植模型的建立方法。方法将手术切除的4例新鲜人脑膜瘤标本制成组织块,接种于15只裸鼠的皮下,连续喂养12周,观察各组皮下肿瘤的生长情况和组织形态特征,并进行移植瘤传代实验和染色体鉴定。结果接种的15只裸鼠中12只有皮下肿瘤生长,成瘤率80％;皮下移植瘤无明显浸润生长,由裸鼠皮下血管供血,其病理形态特征与人脑膜瘤基本一致;传代后组织学类型与细胞核型均未改变。结论裸鼠皮下移植是建立人脑膜瘤动物模型的可靠方法,可用于脑膜瘤的基础和临床研究。