重组人唾液淀粉酶A的制备及活性鉴定

目的 利用基因工程制备重组人唾液淀粉酶A(rSAA),用其替代唾液中的SAA水解淀粉.方法 设计一对带酶切位点的引物,PCR扩增SAA cDNA全长,将pET-28a质粒和PCR产物双酶切、连接.连接产物热激法转化大肠杆菌DH5α,于含卡那霉素的LB平板筛选抗性菌落,培养抗性菌落,抽提质粒,进行酶切和测序鉴定.将重组质...     

含小鼠PPRE反应元件报告质粒的转化扩增

目的对含小鼠过氧化物酶体增殖物反应元件（PPRE）报告质粒p4×PPRE-luc进行体外转化和扩增，为基于PPAR为靶标的药物筛选分子平台的建立提供高纯度、高丰度的报告载体。方法取p4×PPRE-luc质粒转化DH5α感受态菌，再接种到含氨苄青霉素的LB琼脂培养板进行抗性筛选培养，挑取阳性克隆菌落进行培养后抽提质粒，紫外分光光度计测定提取质粒的纯度和浓度，并取样进行琼脂糖凝胶电泳验证。结果经转化后获得了抗氨苄青霉素的阳性克隆菌落，挑取阳性克隆并经培养后提取的p4×PPRE—luc质粒其A260/A280=1．84，浓度为750ng／μl。结论成功转化并扩增了p4×PPRE—luc质粒，为基于PPAR为靶标的药物筛选分子平台的建立提供了高纯度、高浓度的报告质粒。     

小鼠PPARγ2基因表达载体pcDNA3-PPARγ2的转化扩增

目的对含小鼠过氧化物酶体增殖物激活受体γ2（mPPARγ2）基因载体pcDNA3-PPARγ2进行体外转化和扩增,为基于PPARγ2的相关研究提供高纯度、高丰度的表达载体。方法取pcDNA3-PPARγ2质粒转化DH5α感受态菌,再接种到含氨苄青霉素的LB琼脂培养板进行抗性筛选培养,挑取阳性克隆菌落进行培养后抽提质粒,紫外分光光度计测定提取质粒的纯度和浓度,并取样进行琼脂糖凝胶电泳验证。结果经转化后获得了大量抗氨苄青霉素的阳性克隆菌落,挑取阳性克隆并经培养后提取的pcDNA3-PPARγ2质粒其A260/A280=1.89,浓度为420 ng/μl。结论成功转化并扩增了pcDNA3-PPARγ2质粒,为PPARγ的相关研究提供了高纯度、高浓度的表达载体。     

肺炎克雷伯杆菌产β-内酰胺酶耐药性质粒的提取及鉴定

目的探讨耐药性质粒在肺炎克雷伯杆菌中的耐药机制。方法采用琼脂稀释法测定临床分离的31株肺炎克雷伯杆菌对阿奇霉素、氨苄西林和头孢菌素类抗生素的耐药性，采用质粒DNA小量制备的碱裂解法对耐药菌株进行质粒提取，通过转化试验对质粒的耐药性进行鉴定。结果31株肺炎克雷伯杆菌对阿奇霉素、氨苄西林和头孢菌素类抗生素有不同程度的耐药现象。其中从两株耐药性肺炎克雷伯菌中分离出两种质粒，经转化后鉴定为耐药性质粒，大小分别为2．3kb和8．2kb。结论肺炎克雷伯杆菌的临床分离株的耐药性部分决定于耐药性质粒的存在。     

人醛缩酶A在大肠杆菌中的表达及纯化

目的 用基因工程生产人醛缩酶A(ALDOA),为后续酶学研究奠定基础。方法 用Snapgene设计一对5′分别附加Nde I和Xho I位点的引物,PCR扩增ALDOA cDNA,cDNA与质粒pET-28a经Nde I+Xho I酶切后用琼脂糖凝胶电泳分离、胶回收纯化。用DNA连接酶连接cDNA和pET-28a,连接产物转化大肠杆菌Top10,于卡那霉素的LB平板(LBK板)筛选抗性菌落。于LBK培养基培养抗性菌落,抽提质粒,酶切和测序鉴定。将重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3),同法筛选抗性菌落,于LBK培养基培养抗性菌落,0.2mmol/LIPTG,16℃诱导24h。超声破碎细胞,离心取上清,用Ni²⁺-NTA试剂盒纯化ALDOA。超滤浓缩纯化的ALDOA,用pH7.0磷酸缓冲液交换洗脱液,降低ALDOA溶液中的咪唑浓度。BCA法测定重组ALDOA浓度并保存。结果 大肠杆菌表达质粒pET-28a-ALDOA构建成功,重组菌pET-28a-ALDOA-BL21(DE3)经0.2mmol/LIPTG诱导后,ALDOA获得可溶性表达,产量达600mg/L。结论 ...     

抗鼻咽癌质粒 pFY 转化和菌种筛选的研究

目的：筛选携带抗鼻咽癌质粒 pFY 的稳定高产菌株。方法以 CaCl2法制备大肠杆菌 JM109感受态,将抗鼻咽癌质粒 pFY 转化 JM109感受态,对琼脂平板上获得的菌落进行筛选,选出符合标准的单菌落为菌种,进行菌种稳定性实验。用质粒提取试剂盒检测质粒含量。将抗鼻咽癌质粒 pFY 转染到细胞 CNE-2中,四氮唑蓝(MTT)比色法观察转染试剂及质粒载体对细胞生长增殖的影响。结果筛选得到菌株的培养液中质粒 DNA 含量为30 mg/mL,超螺旋 DNA 比例为92%。经电泳和酶切鉴定,该菌株的50子代所携带质粒与原代一致。质粒 pFY 对 CNE-2细胞株生长有明显的抑制作用。结论成功筛选出携带抗鼻咽癌质粒 pFY 的稳定高产菌株,为大批量制备临床应用级质粒奠定了基础。     

基因探针在大肠杆菌中的扩增及其提纯

本文报道了基因探针在大肠杆菌中的扩增与提纯方法。含基因探针的质粒用氯化钙方法转染大肠杆菌,被转染的细菌与质粒在培养液中同步扩增,然后用碱裂解法抽提扩增后的质粒。结果表明:(1)质粒的转化效率与其浓度有关;(2)经转染、扩增与抽提后,获得了大量的纯化质粒DNA;(3)纯化后的基因探针能满意地用于DNA 标记及分子杂交。     

重组人HIF-1α真核表达质粒的构建和鉴定

目的： 构建重组人HIF-lα 真核表达质粒,为进行人HIF-lα基因的克隆与表达做准备。 方法： 从人外周血细胞中提取总RNA,逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)法反转录合成cDNA。分别以含有绿色荧光蛋白(EGFP)片段的质粒PIREGFP质粒和反转录合成的cDNA 为模板,加入所设计的3对引物［EGFP-linker、HIF-1α)上游(up)和下游(down)引物］所扩增目的基因片段分别与T载体连接后转化大肠杆菌DH5α,LB/Amp平板培养基筛选菌落,提取质粒。测序正确后经酶切先后克隆进入pVAX1载体。 结果：通过聚合酶链反应(PCR)分别获得约870、1 199和672 bp的特异性DNA片段,分别与T载体连接后测序,测序结果与GenBank所提供的基因序列相同。将以上3个片段依次连入pVAX1载体后,所得质粒经酶切鉴定后获得约1 800 bp　片段,与预想结果一致。结论：成功构建了重组人HIF-1α真核表达质粒pVAX1-EGFP-linker-HIF-1α。     

大肠埃希菌耐药性质粒的提取及鉴定

目的检测大肠埃希菌对9种抗生素的耐药性，探讨大肠埃希菌耐药的分子机制。方法采用平皿二倍稀释法测定40株临床分离的大肠埃希菌对抗生素的敏感性，同时用碱裂解法对耐药菌株进行质粒的抽提，将得到的质粒转化至受体菌JM109进行质粒耐药性的鉴定。结果40株大肠埃希菌对头孢菌素等9种抗生素呈现出不同程度的耐药现象。对氨苄西林和青霉素的耐药性分别达到了87．5％和97．5％。从两株耐药大肠埃希菌中提取出质粒，对其中一株进行转化鉴定，确定为耐药质粒，大小约为3．0kb。结论临床分离大肠埃希菌对多种抗生素表现出较高的耐药性，而耐药性质粒的存在是细菌产生耐药性的机制之一。     

人源Dickkopf-1真核表达质粒的构建

目的构建人源Dickkopf-1（DKK-1）基因的真核表达质粒,为进一步探讨DKK-1的生物学功能奠定基础。方法Trizol法从人新鲜胎盘组织中抽提总RNA,RT-PCR法反转录为cDNA,以cDNA为模板扩增人源DKK-1的基因序列,将真核表达载体pcDNA3.1和DKK-1的PCR产物分别在双酶切后用T4连接酶连接,构建重组质粒pcDNA3.1-DKK-l,转化至大肠杆菌后经菌落PCR、NHeⅠ和EcoRⅠ双酶切及测序鉴定。结果RT-PCR法从人胎盘中扩增出816bp大小的目的片段,重组质粒转化至大肠杆菌后菌落PCR同样扩增出816bp大小的目的片段,NHeⅠ和EcoRⅠ双酶切重组质粒能切出两条目的条带,测序后与Genbank中DKK-1的cDNA对比,证明DKK-1的基因序列完全正确。结论成功构建了pcDNA3.1-DKK-1重组质粒,为研究人源DKK-1的功能及其在细胞系中的作用奠定了基础。     

人钙调磷酸酶-B真核表达质粒的构建

目的 为研究钙振荡现象,构建人钙调磷酸酶-B(CNB)基因的真核表达质粒.方法 采用RT-PCR技术,从MCF-7细胞中扩增出人CNB基因序列;利用分子克隆技术将其插入到真核表达载体pcDNA3.0中,并进行酶切鉴定和DNA测序.结果 琼脂糖凝胶电泳分析显示RT-PCR产物为预期分子量大小,酶切鉴定图谱正确,DNA测序结果经核实完全符合.结论 成功构建人CNB基因的真核表达质粒,为进一步研究钙振荡现象打下了基础.     

PENK基因过表达克隆载体构建及其功能意义

目的 构建人前脑啡肽（homo sapiens proenkephalin,PENK）基因过表达克隆载体,研究其功能意义。 方法 用HIV载体质粒与PENK基因连接,构建成功后用双酶切及测序验证PENK克隆重组体的成功构建。用293Ta包装慢病毒后转染HT1080以测定慢病毒滴度。用PENK-HIV慢病毒颗粒转染PC12细胞,同步设立对照组（未转染PENK）,对两组细胞转染后48 h采集图片并经行细胞计数,收集细胞,用RT-PCR检测各组中PENK mRNA表达变化。 结果 PENK克隆载体酶切及测序结果都验证了克隆构建成功。PENK-HIV慢病毒成功转染PC12细胞48 h后,对照组细胞数为88.60±2.55,而PENK转染组细胞数为127.93±2.48,差异有统计学意义（P<0.01）。 结论 用HIV载体质粒成功构建的PENK克隆重组体可能会促进PC12细胞的生长。     

健康人肠道大肠埃希菌耐药性与质粒图谱的研究

目的 研究深圳市健康人肠道大肠埃希菌携带的质粒与其耐药性之间的关系.方法 分离健康人肠道大肠埃希菌,K-B法测定细菌对16种抗菌素的耐药性,分析细菌的质粒图谱,对耐药菌株进行质粒分子分型.结果 健康人肠道大肠埃希菌对四环素、萘啶酸、磺胺甲基异恶唑、氨苄西林、复方新诺明和链霉素的耐药率分别为63.33%、49.33%、40.67%、38.67%、35.33%、35.33%,全部菌株对头孢美唑和氨曲南敏感.122株菌(81.33%)耐一种以上抗菌素,88株菌(58.67%)耐2种以上抗菌素,44株菌(29.33%)耐5种以上抗菌素,2株菌耐10种抗菌素.结论 深圳市健康人肠道大肠埃希菌耐药性较严重,其耐药性与所携带质粒的数量和大小并无直接联系.     

Adiponectin真核表达质粒的构建与表达研究

目的构建重组鼠adiponectin真核表达质粒,为进一步研究adiponectin的功能提供实验基础。方法提取鼠脂肪组织总RNA,运用RT-PCR方法扩增鼠adiponectincDNA完全编码区,将扩增产物连接至pCDNA3.1( )载体,对重组质粒进行测序验证,并检测其体外表达和对小鼠乳腺癌细胞4T1的增殖抑制作用。结果重组真核表达质粒经PCR扩增后获得一744bp片段,并经测序证实,Western-blot检测到其体外表达。在体外的细胞学实验中,将重组质粒转染入小鼠乳腺癌细胞4T148h后,与对照组相比,可以观察到明显的细胞形态学改变,细胞体积变小皱缩,4T1细胞生长明显抑制。流式细胞术检测到该组细胞中凋亡细胞所占比例明显高于对照组。结论成功构建了鼠重组adiponectin真核表达质粒,该质粒对小鼠乳腺癌细胞4T1的增殖有明显的抑制作用。     

一种简便快速提取细菌质粒的方法改进

介绍一种简便快速提取细菌质粒的改进方法,不需要按常规对细菌培养物离心和用溶液Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ处理,而是直接用酚-氯仿(1∶1)处理,离心分层取上清,异丙醇沉淀,所得质粒产量高,纯度足以用于酶切。     

葡萄球菌DNA的原生质体转化

用三株金黄色葡萄球菌多剂抗生素耐药菌株80022,82022和82062的质粒DNA和总DMA,分别对受体菌金黄色葡萄球菌RN1304(Y-1)的原生质体进行转化试验。平衡期初期的受体菌用溶菌酶和溶葡萄球菌素处理,所获得的原生质体与质粒DNA混合,以PEG诱导,涂布于含药的双层DM_3再生培养基上,即可获得Tc~r或Cm~r转化子。转化率为10~2—10~3转化子/μg DNA。     

乙肝基因疫苗系列质粒的构建及其在真核细胞中的表达

目的　构建一系列乙肝病毒表面抗原大、中、小蛋白的真核细胞表达质粒 ,并研究其在真核细胞中的表达情况。方法　采用常规 PCR法扩增 S、前 S2 - S、前 S1 -前 S2 - S片断 ,利用重叠 PCR法扩增出前 S1 - S片断后 ,分别插入 Rc/ CMV及 p SG5 U TPL/ Flag载体质粒中 ,并在其 ATG起始密码前加入 KOZAK序列后转染 SP2 / 0细胞 ,Western- Blot杂交检测所表达蛋白 ,并用核酸自动分析仪分析所插入片断的核酸序列。结果　插入片断的核苷酸序列与相应的大、中、小蛋白和前 S1 - S蛋白的编码基因一致 ,Western- Blot杂交检测出了相应的目的蛋白。结论　获得了 8个能高效表达乙肝病毒表面抗原大、中、小蛋白和前 S1 - S蛋白的真核细胞表达质粒。     

大肠杆菌O157:H7对消毒剂抗力与其质粒pO157、染色体DNA关系的研究

目的研究连续消毒中大肠杆菌O 157∶H 7对消毒剂抗力的变化及抗力与质粒pO 157、染色体DNA的关系。方法用四种消毒剂连续消毒5株大肠杆菌O 157∶H 7 50代,对比消毒前后试验菌对四种消毒剂的抗力、pO 157酶切图谱和染色体DNA酶切图谱。结果连续消毒50代后,试验菌对二氯异氢尿酸钠、碘伏、季铵盐的抗力增加,对洗必泰的抗力不变。经二氯异氢尿酸钠、季铵盐消毒后的pO 157酶切图谱和原始菌不同,经碘伏、洗必泰消毒后的pO 157酶切图谱与原始菌相同;经二氯异氢尿酸钠、碘伏、季铵盐消毒后细菌染色体DNA X baⅠPFGE酶切图谱均发生条带数目和位置的改变;经洗必泰消毒后细菌染色体DNA X baⅠPFGE酶切图谱不变。结论连续消毒会使试验菌对二氯异氢尿酸钠、碘伏、季铵盐的抗力增加。对二氯异氢尿酸钠、季铵盐抵抗力增加的原因可能与质粒pO 157和染色体DNA的结构改变有关;抵抗碘伏的基因则位于染色体DNA上,对碘伏抗力增加与染色体DNA结构改变有关而与质粒pO 157无直接关系。     

新生儿病房爆发不动杆菌流行104株药敏试验及质粒分析

目的 新生儿病房不动杆菌败血症爆发流行，了解不动杆菌的耐药性和质粒的关系。方法 收集来自病儿血培养104株不动杆菌，进行对16种抗菌药物的药敏试验和质粒检测。结果 104株均检出质粒，56株流行型含有4个相同的质粒（30．1、3．1、2．5、2Kb），非流行型的质粒数目不等（1～6个）。细菌的耐药性与质粒密切相关，对庆大、卡那、妥布、红霉素、萘啶酸、头孢盂多、复方新诺明耐药率流行型显著高于非流行型，在多重耐药菌株构成比中流行型也显著高于非流行型。结论 新生儿病房流行不动杆菌呈多重耐药性，耐药率流行型菌株高于非流行型；新生儿不动杆菌感染选择头孢氨噻肟和丁胺卡那霉素为宜。临床流行病学调查质粒分析结合药敏实验效果较好。     

龟分枝杆菌药物敏感性与耐药性探讨

目的：探讨龟分枝杆菌对抗生素的敏感性和耐药机理。方法：从我市工厂医院内感染标本中分离龟分枝杆菌12株。用琼脂扩散法测定抗生素的敏感性，用滤纸片进行联合药敏试验，并提取、鉴定质粒，用氟哌酸消除质粒。结果：42种抗生素中，3株龟分枝杆菌龟亚种对大多数氟喹诺酮类、氨基糖甙类的抗生素敏感。对抗结核药利福平、吡嗪酰胺、乙胺丁醇敏感。9种脓肿亚种对大多数氨基糖甙类的抗生素敏感，对氟喹诺酮类的环丙沙星敏感，对多数抗结核药耐药。在药物间均为无关作用。从6株脓肿亚种中提取出一个9．1kb质粒，消除质粒后耐药性不变。结论：龟分枝杆菌是一种对多种抗生素耐药的细菌，药物敏感性差异较大。其耐药性与质粒传递无关。