RNA干扰体外抑制乙型肝炎病毒抗原表达的实验研究

目的 针对乙型肝炎病毒(HBV)prec/c区构建shRNA表达载体,观察shRNA表达载体对HBV抗原表达的抑制作用,为运用RNA干扰(RNAi)技术治疗乙型肝炎奠定基础.方法 运用基因重组技术构建shRNA表达载体,经酶切,测序鉴定确认后,与1.5倍HBV真核表达质粒pHBV1.5共转染Hela细胞,并于转染后72 h,用微粒子酶免疫实验(MEIA)分别检测细胞上清液和细胞裂解液中HBsAg和HBeAg表达水平;用半定量PCR检测prec/c mRNA的转录情况;分析shRNA表达载体对HBe/HBs抗原表达的抑制情况.结果 成功构建了针对HBV prec/c区的shRNA表达载体psiHBV4、psiHBV5、psiHBV6及无关shRNA表达载体psiC;筛选到对HBeAg有明显的抑制作用的psiHBV4载体,同时其对HBsAg的表达有促进作用;psiHBV5和psiHBV6对HBeAg的抑制作用相对较弱,其对HBsAg的表达也有不同程度的促进作用;无关干扰对照psiC对HBV两种抗原的表达均无显著抑制作用.结论 成功构建带U6启动子的shRNA表达载体并初步筛选到可显著抑制HBeAg表达的psiHBV4;本研究设计的3个靶向序列中,只有一个序列有大约70%的抑制率,而另外两个序列的抑制率相对较小,说明RNA干扰作用有较强的序列依赖性;无关干扰序列psiC几乎无干扰作用,说明siRNA产生的干扰作用具有高度的特异性.以上结果为应用RNAi治疗乙型肝炎奠定了一定的基础.     

RNA干扰体内抑制HBeAg表达

目的 在机体水平观察小干扰RNA(siRNA)对HBeAg表达的影响.方法 通过尾静脉注射1.5倍的HBV真核表达质粒pHBV1.5建立小鼠急性乙型肝炎病毒感染模型,再将其与针对乙型肝炎病毒核心区的siRNA表达载体(psiHBV4)共注射,于注射后第6天取血测HBeAg的表达,并用RT-PCR检测肝组织HBV prec/c mRNA转录子的水平.结果 注射后第6天血清中,HBsAg、HBeAS在造模组中高表达.psiHBV4干扰组中HBeAg的表达受到了明显的抑制,与对照组相比有显著差异(P<0.05),RT-PCR显示肝内HBV prec/c mRNA水平亦明显降低,而无关干扰对照组则无相应的干扰作用.结论 RNAi能特异,高效的抑制小鼠体内HBeAS的表达,为乙型肝炎的治疗带来了新的希望.     

靶向HBVs和e抗原基因的shRNA表达载体共转染对HBV抗原表达的抑制作用

目的:探索靶向乙型肝炎病毒HBsAg基因的shR-NA表达载体Pgs1、Pgs2、Pgs3及靶向HBeAg基因shRNA表达载体psiHBV4、psiHBV5、psiHBV6共转染,对体外培养HepG2.2.15细胞中的HBV抗原表达的抑制作用。方法:以质粒PTZ为阴性对照,将自行构建的靶向HBVs和e抗原基因的shRNA表达载体按不同组合共转染HepG-2.2.15细胞;继续培养24 h后用MEIA分别检测细胞裂解液和培养上清中HBsAg和HBeAg的表达水平。结果:psiHBV4+PgS2、psiH-BV4+PgS3在联合转染时,在细胞上清和裂解液中对HBsAg和HBeAg表达都有显著抑制作用(P0.05),psiHBV5+PgS1、psiHBV6+PgS3对裂解液HBeAg表达抑制作用不显著(P0.05)。结论:靶向HBs和HBe基因的两种载体psiH-BV4+PgS2、psiHBV4+PgS3共转染比单个载体转染更能显著减少HBV抗原的表达。     

RNA干扰体外抑制HBeAg的表达

目的：构建乙型肝炎病毒前C／C基因小发夹RNA（shRNA）表达载体，探索shRNA表达载体对HBeAg表达的抑制作用。方法：用基因重组技术构建shRNA表达载体，经酶切、测序鉴定后，与HBeAg表达载体pcDNA3．1-preC／C按7：1的比例，共转染HeLa细胞，采用半定量PCR和微粒子酶免疫试验（MEIA）分析shRNA表达载体对HBeAg表达的抑制情况。结果：经限制性内切酶、测序证实成功构建shRNA表达载体；筛选到psiHBV2载体对HBeAg表达有一定抑制作用，对mRNA的抑制率为75％，对蛋白质的抑制率为53％，其余两序列无明显抑制作用。结论：RNAi技术可以有效抑制载体pcDNA3．1-preC／C表达HBeAg。     

shRNA表达载体的构建及对HBV复制和表达的抑制

目的:构建shRNA的表达载体,检测针对乙型肝炎病毒(HBV)的shRNA的稳定表达质粒对HBV复制和表达的影响。方法:扩增U6启动子构建shRNA表达载体pU6。针对HBV基因组序列设计并化学合成双链核苷酸克隆到pU6载体得到质粒pU6B/HBVi,脂质体介导转染带有HBV基因组的2.2.15细胞,定量PCR和ELISA法检测pU6B/HBVi对HBV复制和表达的影响。结果:成功构建了shRNA的真核表达载体;针对HBV的pU6B/HBVi质粒对HBV的复制和表达有明显的抑制作用。结论:稳定表达shRNA的pU6B/HBVi质粒可以抑制HBV在2.2.15细胞中的复制和表达。     

鸟苷结合蛋白1对柯萨奇病毒B3及乙型肝炎病毒体外介导的不同作用

目的构建人鸟苷结合蛋白1（hGBP-1）真核表达质粒，观察hGBP-1体外对柯萨奇病毒B3（CVB3）和乙型肝炎病毒（HBV）的抑制作用。方法长链RT-PCR扩增全长hGBP-1编码区基因，克隆到pCR2．1TA克隆载体，再亚克隆到pcDNA3．1（-）真核表达载体。体外转染HepG2细胞和Hela细胞，Western blot检测hGBP-1的表达。然后分别观察转染细胞中hGBP-1对HBV体外复制子pHBV1．3和CVB3的抑制作用。ELISA检测共转染HepG2细胞培养L清HBsAg、HBeAg水平；Southern blot检测细胞HBVDNA复制中间体。TCID50试验检测Hela细胞培养物中CVB3感染量。结果成功构建hGBP-1真核表达质粒，能在HepG2细胞和HeLa细胞进行高效表达。该质粒与pHBV1．3共转染HepG2细胞，不能抑制HBV复制，HBsAg、HBeAg及HBV DNA复制中间体水平与对照相比都无明显变化。转染质粒在HeLa细胞上对CVB3复制有明显的抑制作用，CVB3感染量显著降低，尤其在低剂量病毒攻击时能完全抑制CVB3复制。结论hGBP-1可能在IFN介导的抗CVB3中起重要作用，但不能抑制HBV的复制。     

固有免疫分子TRIM5α对乙型肝炎病毒复制的影响

目的:构建固有免疫分子TRIM5α的真核表达质粒,研究TRIM5α 对HBV复制的影响.方法:通过巢氏RT-PCR技术从恒河猴肺组织中扩增出TRIM5α的编码基因,并将其克隆入pcDNA3.1真核表达载体.将TRIM5α真核表达质粒转染HepG2细胞,用Western blot的方法鉴定TRIM5α蛋白表达情况.将TRIM5α真核表达质粒与复制型HBV质粒通过磷酸钙沉淀法共转染HepG2细胞、通过尾静脉高压注射法共转染BALB/c小鼠.ELISA检测转染细胞上清及小鼠血清中的HBsAg和HBeAg;免疫组化检测小鼠肝组织HBcAg的表达;Southern blot检测转染细胞中HBV复制中间体.将TRIM5α真核表达质粒转染293T细胞3小时后,再将基于HIV-1结构的慢病毒载体三质粒系统转染293T细胞,通过检测转染细胞上清中的HIV-1 p24抗原含量来鉴定TRIM5α抗HIV-1功能.结果:成功构建TRIM5α真核表达质粒;过表达TRIM5α不能有效降低HBV抗原和复制中间体水平,但可抑制HIV-1 p24抗原的表达.结论:TRIM5α不能有效抑制HBV的复制.     

shRNA干扰A549细胞KIAA0101基因表达的初步研究

目的探讨小发卡RNA(small hairpin RNA,shRNA)真核表达质粒介导的RNA干扰技术对人肺腺癌A549细胞KIAA0101基因表达的抑制作用。方法应用pSIREN-RetroQ载体构建KIAA0101基因shRNA重组质粒,经脂质体法导入A549细胞,分别设置为空白对照组、阴性对照组、干扰A组和干扰B组,采用实时定量PCR法和免疫印迹(Western blot)法检测检测转染后细胞KIAA0101基因mRNA与表达蛋白质的变化,四唑盐(MTT)比色法测定各组干扰细胞活性。结果成功构建KIAA0101基因shRNA重组质粒,相对阴性对照组与空白对照组,干扰B组KIAA0101的mRNA与蛋白质表达水平均下降达70%(P≤0.05)以上,MTT法结果显示降低KIAA0101的表达可抑制肺癌细胞的生长活性。结论shRNA干扰质粒可以显著降低细胞内KIAA0101mRNA与蛋白质的表达水平,并且抑制癌细胞的生长活性,为该基因在肺癌中的深入研究奠定了基础。     

AIF靶向短发夹RNA干扰重组载体对神经母细胞瘤细胞SHSY5Y的沉默作用

目的探讨AIF基因短发夹RNA(shRNA)表达质粒对神经母细胞瘤细胞(SHSY5YAIF)基因的干扰作用。方法根据siRNA设计原则,构建靶向AIF基因的短发夹RNA干扰质粒(pGPU6/GFP/AIF),使用脂质体法转染人神经母细胞瘤细胞,通过RT-PCR和Wester blot印迹检测神经母细胞瘤细胞AIF基因mRNA和蛋白表达水平。结果 pGPU6/GFP/AIF重组质粒经限制性内切酶酶切及测序证明基因插入正确。质粒成功转染SHSY5Y细胞后,该细胞的AIFmRNA和蛋白表达明显下降(P0.05)。结论成功构建靶向AIF基因的shRNA表达载体转染神经母细胞瘤细胞,有效抑制AIFmRNA和蛋白表达,为AIF基因靶向治疗提供前期的实验依据。     

RNA干扰MAD2基因对细胞增殖的影响

目的:探讨MAD2对HepG2细胞周期的影响。方法:构建针对MAD2基因的shRNA表达载体,MAD2基因与GFP融合的绿色荧光蛋白真核表达质粒pmad2-EGFP共转染HepG2细胞株,用Western印迹法检测shRNA的抑制效应;用MTT法测定细胞增殖率;用流式细胞仪检测细胞周期。结果:shRNA的重组质粒表达载体能明显抑制MAD2绿色荧光融合蛋白的表达。HepG2细胞转染有效干扰质粒48h后,细胞增殖抑制率达65%。有效干扰质粒引起G0/G1期和S期细胞的明显降低,G2/M期细胞增多。结论:在细胞水平,可通过RNA干扰特异性抑制MAD2基因来抑制细胞的增殖,为研究MAD2基因在细胞增殖中的作用机制奠定基础。     

针对S基因的siRNA或shRNA表达框对HepG2.2.15细胞中HBV基因表达和病毒复制的抑制作用比较

目的 化学合成针对乙型肝炎病毒（HBV）S基因的siRNA，同时制备针对相同区段的shRNA表达框，并比较二者对HepG2．2．15细胞中HBV基因表达和病毒复制的抑制作用。方法 化学合成针对HBVS基因的带有FITC标记的siRNA，设计合成带有FTrc标记的引物，PCR扩增含有RNA聚合酶Ⅲ启动子H1序列和shRNA编码序列的表达框，并对扩增产物进行纯化，将等摩尔数siRNA和shRNA表达框分别用脂质体转染稳定表达HBV的HepG2．2．15细胞，转染1d后流式细胞仪检测转染效率，转染3d后RT-PCR检测靶基因mRNA的水平，用SDS-PAGE、Westem blot及间接免疫荧光染色检测HBsAg的表达。收集转染前和转染后1、3、5和7d的细胞培养上清，检测HBsAg水平，同时用荧光定量PCR方法检测HBV　DNA的含量。结果成功制备了针对HBVS基因的shRNA表达框，将其与等摩尔数siRNA分别转染HepG2．2．15细胞后，RT-PCR证实细胞中HBV　mRNA水平降低，SDS-PAGE、Westem blot及间接免疫荧光染色检测到HBsAg的表达受到抑制，细胞培养上清中HBsAg和HBV DNA含量下降。与siRNA相比，shRNA表达框对HBV的抑制作用虽然起效较慢，但持续时间更长。结论shRNA表达框和siRNA均可明显抑制HBV的转录和表达，与siRNA相比，shRNA表达框能够更持久地抑制靶基因的表达。     

1．3倍乙型肝炎病毒全基因真核表达载体的构建及其在Bew0细胞中的表达

目的构建1．3倍乙型肝炎病毒（HBV）全基因的真核表达载体pcDNA3．1（＋）一HBV1．3。并观察其在Bewo细胞中的表达。方法以质粒pMD18T—HBV上的HBVDNA序列为模板,构建1-3倍HBV全基因序列,将其插入到真核表达载体pcDNA3．1（＋）,用酶切、PCR及测序鉴定,并把该载体转染Bewo细胞,以Western免疫印迹、微粒子酶免疫分析法（MEIA）和荧光定量PCR法分别检测胞内和上清中HBsAg、HBeAg蛋白的表达及HBVDNA水平。结果通过酶切、PCR及测序鉴定,成功构建1．3倍HBV全基因表达载体．该载体可以在Bewo细胞系中表达和分泌HBsAg与HBeAg。并可检测到高水平的HBVDNA。结论成功构建了1．3倍HBV全基因真核表达载体pcDNA3．1（＋）一HBV1．3,为研究胞内HBV宫内感染奠定了基础。     

B7-DC-silenced dendritic cells induce stronger anti-HBV immunity in transgenic mice

Hepatitis B virus (HBV) is a noncytopathic DNA virus and is the pathogen of acute and chronic hepatitis. Interferon and nucleotide analogues such as lamivudine and adefovir are the current treatment strategies of HBV infection; however, it is still a serious disease. Therefore, the development of new therapeutic options against HBV is needed. In the present study, we have investigated whether the vectors carrying short hairpin RNA (shRNA) targeting the murine B7-DC gene could silence the expression of B7-DC and analyzed the function of gene-modified dendritic cells (DCs) by mixed lymphocyte reaction. The results demonstrated that two shRNA vectors efficiently suppressed the expression of B7-DC. The MLR assay showed that shRNA-B7-DC-transfected DCs induced markedly higher allogeneic lymphocyte proliferation than transfected DCs with the vector plasmid pAS and untreated DCs at all dilutions. The most efficient shRNA plasmid vector against B7-DC was then used to silence the expression of B7-DC on DCs, the gene-modified DCs were pulsed with HBV-specific peptides, and HBV transgenic mice were immunized. After three rounds of immunization, the splenocytes were stimulated in vitro and tested for cytotoxicitic T lymphocyte activity, while the sera were used to detect the level of HBsAg and HBV DNA. The data demonstrated that blockade of B7-DC on DCs augmented the cytolytic activity induced by immunization with peptide-pulsed DCs and significantly reduced the concentration of serum HBsAg and HBV DNA, suggesting that silencing of B7-DC is of potential value in DC-based therapy of HBV infection.     

Construction, Stable Expression of Survivin shRNA Vector

Objective: To construct survivin shRNA expression vector carting enhanced green fluorescent protein gene, transfect it into GBC-SDH cells via electroporation, and get GBC-SD cells which are stable expressing survivin shRNA. Methods: The siRNA sequence targeting survivin mRNA was synthesized and cloned into pEGFP-H1. The constructed plasmid and pEGFP-H1 were transfected into GBC-SD cells respectively via liposome, and the transfecting effect was detected with Flow Cytometry. Then the transfected cells were selected with G418. Results: The recombinant plasmid was successfully constructed, named pEGFP-survivin. The gene transfection efficiencies in pEGFP-H1-transfected group and pEGFP-survivin- transfected group were the 80.29%±2.71% and 83.85%±2.34%(P>0.05), which was successful to get the cells that are stable expressing shRNA, named GBC-SD/EGFP and GBC-SD/survivin. Conclusion: Survivin shRNA expression vector was constructed successfully and got GBC-SD cells which are stable expression shRNA.     

携带乙型肝炎病毒感染性克隆的四种转基因载体在体内外抗原表达分析

目的 构建四种不同结构的1.3倍全基因乙型肝炎病毒(HBV)转基因载体,观察HBV抗原在体内外表达水平的差异.方法 克隆1.3倍的HBV基因至慢病毒转基因质粒pCS-CG并取代其中的EGFP表达盒,构建四种结构的pCS-HBV1.3质粒,体外转染Huh 7细胞和尾静脉高压水动力法注射C57BL/6小鼠后,ELISA方法分别检测细胞上清和小鼠血清中HBsAg和HBeAg的表达.结果 成功构建了四种不同结构的pCS-HBV1.3质粒,四种质粒HBV S抗原与e抗原在体内外的表达趋势一致,即乙肝抗原表达水平在正向插入的转基因质粒中高于反向插入;HBV抗原表达水平还与载体序列中RRE调控元件和cPPT调控元件前的基因序列长度有关.结论 筛选获得了可在体内外高效表达HBV抗原的转基因载体可应用于乙肝病毒体内外感染模型的建立与应用.     

乙型肝炎病毒外膜蛋白和核壳蛋白双表达质粒的构建和表达

目的 构建同时表达乙型肝炎病毒外膜蛋白和核心蛋白的真核表达质粒并研究其表达效果.方法 利用DNA重组技术,构建由两个CMV启动子分别表达乙型肝炎病毒外膜蛋白和核心蛋白的双表达真核质粒VR-SC,体外真核表达后ELISA检测HBsAg和HBeAg.结果 在乙肝病毒外膜蛋白表达质粒上插入多克隆位点,并插入乙肝病毒核心蛋白的完整表达调控单元,体外真核表达后成功检测到HBsAg和HBeAg.结论 成功构建双表达质粒vR-sc,其表达效果良好,为进一步改造成HBV DNA疫苗打下了基础.     

骨桥蛋白短发卡样RNA质粒载体的构建与筛选

目的 构建携带骨桥蛋白双链小干扰RNA(OPN-siRNA)的质粒表达载体,筛选出基因沉默效果最明显的短发卡样RNA(shRNA)质粒表达载体.方法 设计并合成2个针对OPN的shRNA寡核苷酸片段(shRNA1,shRNA2),退火形成双链并分别克隆进入载体pGenesil-1.酶切鉴定后,采用LipofectamineTM2000介导的转染方法将重组的shRNA质粒转入大鼠血管平滑肌细胞(VSMC),筛选出稳定转染株.采用RT-PCR及Western免疫印迹检测其对OPN表达的抑制效果.结果 shRNA质粒成功转染入VSMC且效率达50%以上.转染含OPN shRN A1的VSMC的OPN mRNA和蛋白的表达分别为0.16±0.04和0.30±0.09,含OPN shRNA2分别为0.23±0.06和0.44±0.06,两组之间及分别与正常细胞组比较差异均有统计学意义(P<0.01).空载体组和阴性对照组与正常细胞组比较,差异均无统计学意义(P>0.05).结论 成功构建了靶向OPN基因的shRNA质粒表达载体,其中抑制效果最为明显的shRNA质粒表达载体为shRN A1质粒.     

着色性干皮病基因D和p53对HBV复制的影响

 目的:探讨人着色性干皮病基因D(XPD) 和p53对乙型肝炎病毒（HBV）复制的影响。方法:使用脂质体转染法把重组质粒pEGFP-N2/XPD和空载质粒pEGFP-N2转染进入人肝癌细胞株HepG2.2.15细胞,转染后的第2天用20 μmol/L pifithrin-α（p53抑制剂）孵育细胞24 h。实验共分为空白对照组、pEGFP-N2组、pEGFP-N2/XPD组、pEGFP-N2/XPD+pifithrin-α组和pifithrin-α组。使用RT-PCR法检测XPD、乙型肝炎表面抗原（HBsAg）、乙型肝炎e抗原（HBeAg）及乙型肝炎病毒X蛋白（HBx） mRNA表达的变化;使用ELISA法检测培养上清液中HBsAg和HBeAg含量的变化;用荧光定量PCR法检测培养上清液中HBV-DNA含量的变化;用bDNA法检测细胞内核心颗粒中HBV-DNA含量的变化。结果:RT-PCR结果显示,重组质粒pEGFP-N2/XPD的转染可使得XPD mRNA表达增高,XPD表达增高能使得HBsAg、HBeAg和HBx mRNA表达明显减少,而pifithrin-α能抑制XPD的这一作用（均P<0.01）。ELISA结果显示,XPD表达增高能使得培养上清液中HBsAg和HBeAg含量明显减少,而pifithrin-α能抑制XPD的这一作用（均P<0.01）。荧光定量PCR结果显示,XPD表达增高能使得培养上清液中HBV-DNA含量明显减少,而pifithrin-α能抑制XPD的这一作用（均P<0.01）。bDNA结果显示,XPD表达增高使得细胞内核心颗粒中HBV-DNA含量明显减少,而pifithrin-α能抑制XPD的这一作用（均P<0.01）。结论: XPD能通过p53通路抑制HBV复制,所以XPD和p53可能成为乙型肝炎抗病毒治疗的作用靶点。