小鼠GM─CSFcDNA重组逆转录病毒的构建及在成纤维细胞中的表达

为探索粒－巨噬细胞集落刺激因子（ＧＭ－ＣＳＦ）基因治疗的可能性，将小鼠ＧＭ－ＣＳＦｃＤＮＡ重组于缺陷型逆转录病毒载体ｐＬＸＳＮ中，重组质粒转染病毒包装细胞ＰＡ３１７，经Ｇ４１８筛选，用其抗性克隆培养上清液感染小鼠成纤维细胞ＮＩＨ３Ｔ３，筛选出抗Ｇ４１８的转化细胞克隆，用ＰＣＲ和Ｓｏｕｔｈｅｒｎｂｌｏｔ证明转化细胞的基因组中整合有ＮｅｏＲ基因和ＧＭ－ＣＳＦ基因，原位杂交显示转化细胞有较强的ＧＭ－ＣＳＦｍＲＮＡ表达，用骨髓细胞增殖法和ＣＦＵ－ＧＭ检测也表明转化细胞分泌有较多的ＧＭ－ＣＳＦ，该研究为下一步在动物体内进行ＧＭ－ＣＳＦ基因治疗的研究奠定基础     

转hGM－CSF基因人膀胱癌细胞株的建立及其生物学特性

采用逆转录病毒载体将ｈＧＭ－ＣＳＦ基因导入人膀胱癌细胞株ＢＩＵ－８７细胞中，建立转基因细胞株ＢＩＵ／ＧＭ。经ＰＣＲ－ＳｏｕｔｈｅｒｎＢｌｏｔ杂交证实ＧＭ－ＣＳＦ基因已整合到ＢＩＵ／ＧＭ细胞基因组中。经流式细胞仪细胞ＤＮＡ周期分析表明，转基因前后ＢＩＵ－８７细胞增殖状态无变化。免疫荧光检测发现ＧＭ－ＣＳＦ基因导入及表达不能促进ＢＩＵ－８７细胞表面ＨＬＡ－ＡＢＣ、ＤＲ、ＤＱ抗原的表达。转基因细胞经６０Ｇｙ／ｓＸ线灭活后，丧失增殖能力，但能维持一定水平的ＧＭ－ＣＳＦ分泌活性达２周。本文为进行转基因瘤苗的深入研究奠定了初步基础。     

小鼠GM—CSF cDNA重组逆转录病毒的构建及在成纤维细胞中的表达

为探索粒－巨噬细胞集落刺激因子（ＧＭ－ＣＳＦ）基因治疗的可能性，将小鼠ＧＭ－ＣＳＦｃＤＮＡ重组于缺陷型逆转录病毒载体ｐＬＸＳＮ中，重组质粒转染病毒包装细胞ＰＡ３１７，经Ｇ４１８筛选，用其抗性克隆培养上清液感染小鼠成纤维细胞ＮＩＨ３Ｔ３筛选出抗Ｇ４１８的转化细胞克隆，用ＰＣＲ和Ｓｏｕｔｈｅｒｎｂｌｏｔ证明转化细胞的基因中整合有ＮｅｏＲ基因和ＧＭ－ＣＳＦ基因，原位杂交显示转化细胞有较强的ＧＭ－ＣＳＦｍ     

粒—巨噬细胞集落刺激因子cDNA在造血祖细胞中的表达

目的；探讨逆转录病毒介导的ＧＭ－ＣＳＦｃＤＮＡ在造血母细胞中转移与表达。方法：采用电穿孔法将小鼠ＧＭ－ＣＳＦｃＤＮＡ重组逆转录病毒ｐＬＸＳＮ／ＧＭ和空载体ｐＬＸＳＮ转染病毒包装细胞ＰＡ３１７，再将含有ＧＭ－ＣＳＦ重组逆转录病毒的细胞培养上清液感染富含造血干祖细胞群体，采用ＰＣＲ和Ｓｏｕｔｈｅｒｎｂｌｏｔ分析培养细胞基因组中外源基因的整合，用Ｄｅｘｔｅｒ培养体系检测培养３周的各组细胞增殖数，结果：在     

CD自杀基因联合GM-CSF基因治疗的抗肿瘤作用及免疫机理

目的：研究自杀基因与粒细胞－巨噬细胞集落刺激因子（ＧＭ－ＣＳＦ）基因联合治疗抗肿瘤作用及免疫机制。方法：小鼠皮下接种黑色素瘤Ｂ１６Ｆ１０细胞３ｄ后,分别在肿瘤局部直接注射表达小鼠ＧＭ－ＣＳＦ的重组腺病毒ＡｄＧＭ－ＣＳＦ和表达大肠杆菌胞嘧啶脱氨酶（ＣＤ）基因的腺病毒ＡｄＣＤ,然后连续１０ｄ腹腔注射５氟胞嘧啶（５ＦＣ）（ＡｄＣＤ／５ＦＣ／ＡｄＧＭＣＳＦ组）、单用ＡｄＣＤ／５ＦＣ组、单用ＡｄＧＭ－ＣＳＦ组、注射对照病毒ＡｄｌａｃＺ／５ＦＣ组或ＰＢＳ组。结果：与接受ＡｄＣＤ／５ＦＣ、ＡｄＧＭ－ＣＳＦ、ＡｄｌａｃＺ／５ＦＣ或ＰＢＳ治疗的荷瘤小鼠比较,经联合治疗后荷瘤小鼠皮下肿瘤结节的生长明显受到抑制,荷瘤小鼠的存活期明显延长（Ｐ＜０．０１）。经ＡｄＣＤ／５ＦＣ／ＡｄＧＭＣＳＦ联合基因治疗后,肿瘤瘤体内或瘤周有大量树突状细胞、ＣＤ８＋Ｔ细胞浸润,黑色素瘤细胞表达ＭＨＣ－Ⅰ和Ｂ７－１分子明显增加,荷瘤小鼠脾细胞对Ｂ１６Ｆ１０黑色素瘤细胞特异性杀伤功能增强。结论：联合应用自杀基因和ＧＭ－ＣＳＦ基因转移可以直接杀伤肿瘤细胞,又可提高机体对肿瘤的免疫应答,两者可协同发挥抗肿瘤作用。     

脐血血浆、rhGM-CSF增强急性髓性白血病细胞对Ara-C敏感性的研究

研究了脐血血浆（ＣＢＰ）、基因重组人粒－单细胞集落刺激因子（ｒｈＧＭ－ＣＳＦ）对２０例急性髓性白血病（ＡＭＬ）细胞体外对阿糖胞苷（Ａｒａ－Ｃ）敏感性的影响。采用ＭＴＴ法测定Ａｒａ－Ｃ的细胞毒作用，发现，ＣＢＰ及ｒｈＧＭ－ＣＳＦ可显著增强Ａｒａ－Ｃ对耐药ＡＭＬ细胞的毒性作用，与对照组相比，Ｐ＜０．０５；另采用台盼蓝拒染法测定细胞的存活能力，发现：ＣＢＰ虽然可增加耐药ＡＭＬ细胞的存活能力，但当Ａｒａ－Ｃ与ＣＢＰ或ｒｈＧＭ－ＣＳＦ合用时，ＡＭＬ活细胞总数反而下降，与对照组相比，Ｐ＜０．０５。由此认为：ＣＢＰ及ｒｈＧＭ－ＣＳＦ可通过促进耐药ＡＭＬ细胞进入增殖周期，从而增强耐药ＡＭＬ细胞对Ａｒａ－Ｃ的敏感性，预示着ＣＢＰ、ｒｈＧＭ－ＣＳＦ与Ａｒａ－Ｃ联合应用治疗耐药ＡＭＬ的潜在价值。     

GM—CSF基因转导的肿瘤疫苗研究

目的：观察ＧＭ－ＣＳＦ基因转导的肿瘤细胞免疫小鼠的抗肿瘤效果。方法：用电穿孔法将小鼠ＧＭ－ＣＳＦ的表达质粒导入ＲＭＡ淋巴瘤细胞,经Ｇ４１８筛选后,将ＧＭ－ＣＳＦ高表达克隆（ＲＭＡ－ＧＭ）细胞皮下接种Ｃ５７ＢＬ／６小鼠,观察成瘤性,以及经丝裂霉素－Ｃ处理灭活的ＲＭＡ－ＧＭ细胞免疫小鼠,观察抗肿瘤作用。结果：ＲＭＡ－ＧＭ细胞免疫小鼠及亲代肿瘤细胞攻击后与对照组相比,肿瘤生长速度减慢,小鼠生存期明显延长     

化疗＋G—CSF与化疗＋G—CSF＋GM—CSF动员外周血干细胞效果？…

目的：比较化疗＋Ｇ－ＣＳＦ与化疗＋Ｇ－ＣＳＦ＋ＧＭ－ＣＳＦ二种动员方案动员外周血干细胞（ＰＢＳＣ）和造血重建的效果。方法：将３３例患者（急性白血病２３例，恶性淋巴瘤９例，乳腺癌１例）分为化疗＋Ｇ－ＣＳＦ与化疗＋Ｇ－ＣＳＦ＋ＧＭ－ＣＳ组，化疗后ＷＢＣ最低时开始分别应用Ｇ－ＣＳＦ１５０μｇ皮下注射，２／ｄ及Ｇ－ＣＳＦ１５０μｇ，ＧＭ－ＣＳＦ１５０μｇ，皮入注射，上，下午各１次。动员３ｄ后行ＰＢＳＣ采集     

转hGM—CSF基因肿瘤细胞疫苗抗肿瘤作用的实验研究

利用逆转录病毒中介基因转移体系将ｈＧＭ—ＣＳＦ基因导入大鼠Ｗａｌｋｅｒ瘤细胞ＷＴ２５６中，经ＰＣＲ和ＳｏｕｔｈｅｒｎＢｌｏｔ检测证实，ｈＧＭ—ＣＳＦ基因已成功导入ＷＴ２５６细胞，生物学活性检测表明，转基因瘤细胞分泌一定水平ｈＧＭ—ＣＳＦ。转基因细胞经Ｘ线灭活，接种荷瘤的Ｗａｌｋｅｒ瘤模型，诱导了有效的抗肿瘤免疫反应     

异基因外周血干细胞的动员,检测及临床移植的应用研究

目的：探讨异基因外周血干细胞移植（ａｌｌｏ－ＰＢＳＣＴ）供者经Ｇ－ＣＳＦ或Ｇ－ＣＳＦ＋ＧＭ－ＣＳＦ动员后,采集的外周血干细胞（ＰＢＳＣ）移植物中的幼稚粒细胞与单个核细胞（ＭＮＣ）、ＣＤ３４＾＋细胞及ＣＦＵ－ＧＭ之间的相关性和移植的剂量标准及临床应用效果。方法：对１１例ａｌｌｏ－ＰＢＳＣＴ供者用Ｇ－ＣＳＦ（９例）或Ｇ－ＣＳＦ＋ＧＭ－ＣＳＦ（２例）进行动员,于动员前及动员后,分别对外周血及ＭＮＣ惧物中的幼稚粒细胞、ＣＤ３４＾＋细胞及ＣＦＵ－ＧＭ进行检测计数,预处理方法主要用大剂量环磷酰胺（ＣＴＸ）＋全身照射（ＴＢＩ）。结果：动员后外周血中的幼稚粒细胞与ＣＤ３４＾＋细胞及ＣＦＵ－ＧＭ同步增加,外周血ＭＮＣ中的幼稚粒细胞数与ＣＤ３４＾＋细胞数及ＣＦＵ－ＧＭ有较好的相关性。１１例患者全部植活和恢复造血功能,并为染色体核型     

联合应用四种造血生长因子对不同骨髓细胞集落形成的作用

对２例正常人、３例骨髓增生异常综合征、２例慢性再生障碍性贫血、５例慢性髓细胞白血病病人骨髓细胞体外培养显示，各种骨髓细胞对造血生长因子ｒｈＧＭＣＳＦ、ｒｈＥＰＯ、ｒｈγＩＦＮ、γｈＩＬ－３联合作用的反应较为一致，只是反应程度不同。ＧＭ－ＣＳＦ、ＥＰＯ双因子联合应用时对ＣＦＵＧＭ形成的作用与ＧＭ－ＣＳＦ单因子作用相似。而当培养体系中同时加入ＩＬ－３、ＧＭ－ＣＳＦ、ＥＰＯ时，表现出明显的协同与叠加作用     

外周血干细胞体外扩增的研究

本文对１０例经动员后的正常外周血造血细胞进行体外扩增研究，结果发现在ＳＣＦ与ＧＭ－ＣＳＦ共同作用下，不仅培养细胞总数明显增加，且ＣＦＵ－ＧＭ平均增加２６．７倍，ＣＤ３４细胞增加１９．６倍；ＣＤ３４细胞数与ＣＦＵ－ＧＭ呈正相关。     

不同细胞因子对培养人外周血树突状细胞的影响

目的建立从人外周血分离、纯化、培养、扩增树突状细胞（ＤＣ）前体的方法，研究细胞因子对ＤＣ体外增殖、分化成熟的影响。方法人外周血经血细胞分离仪及Ｆｉｃｏｌ、Ｐｅｒｃｏｌ等不连续密度梯度离心获得的含ＤＣ前体细胞组分用重组人粒细胞／巨噬细胞集落刺激因子（ｈｒＧＭ－ＣＳＦ）培养或用ＧＭ－ＣＳＦ及白细胞介素－４（ＩＬ－４）联合培养；光镜及电镜观察及ＡＢＣ法免疫细胞化学染色。结果分离的ＤＣ前体经１周左右时间培养，细胞数量可扩增２０～３０倍，纯度达９０％以上，ＧＭ－ＣＳＦ与ＩＬ－４联合培养所得到的ＤＣ数量约为用ＧＭ－ＣＳＦ培养的１．５倍。ＤＣ具有典型的树枝状或裙褶状突起，并表达高水平的ＨＬＡ－ＤＲ，其ＣＤ１４、ＣＤ１９、ＣＤ３的表达均为阴性。结论用ＧＭ－ＣＳＦ和ＩＬ－４联合作用更能促进ＤＣ的体外扩增及分化。     

pSVL／GM—CSF真核表达质粒的构建及其表达活性观察

以真核瞬时表达质粒ｐＳＶＬ为载体构建ｐＳＶＬ／ＧＭＣＳＦ真核表达质粒,用电穿孔法导入Ｃｏｓ－７细胞,以ＧＭ－ＣＳＦ依赖株ＴＦ１为靶细胞,检测其生物学活性;将不同剂量的ＰＳＶＬ／ＧＭ－ＣＳＦ质粒直接注射Ｂａｌｂ／Ｃ小鼠股四头肌,动态观察小鼠血清中ＧＭ－ＣＳＦ的表达;     

抗人粒细胞集落刺激因子单克隆抗体的研制

应用杂交瘤技术，用重组人Ｇ－ＣＳＦ（ｒｈＧ－ＣＳＦ）免疫Ｂａｌｂ／ｃ小鼠，然后将其脾脏细胞与小鼠骨髓瘤细胞ＮＳ－１融合，成功地获得了多种能够分泌抗ｒｈＧ－ＣＳＦ单克隆抗体（ＭｃＡｂ）的杂交癌细胞。对其中的２株杂交瘤细胞２Ａ６和２Ｃ２分泌ＭｃＡｂ的研究表明，它们能够特异性地和ｒｈＧ－ＣＳＦ结合，而与重组的人ＧＭ－ＣＳＦ、ＩＬ－ＣＳＦ、ＩＬ－２、ＩＬ－２α和ＴＮＦ细胞因子无交叉反应，为抗Ｇ－ＣＳＦ特异性ＭｃＡｂ。这些杂交瘤细胞经反复冻存和复苏后，仍能稳定地分泌ＭｃＡｂ。     

GM—CSF诱导红白血病细胞向树突状细胞分化及其抗原提呈功能的研究

目的探讨粒细胞－巨噬细胞集落刺激因子（ＧＭ－ＣＳＦ）诱导小鼠红白血病细胞分化过程中，树突状细胞的产生及其抗原提呈功能的变化。方法采用流式细胞仪分析、电镜技术和４小时５１Ｃｒ释放法等，进一步观察了ＧＭ－ＣＳＦ的诱导分化作用。结果１００ｎｇ／ｍｌＧＭ－ＣＳＦ处理３天后的ＦＢＬ－３细胞，树突状细胞的特异性标志３３Ｄ１和ＮＬＤＣ１４５的表达阳性率显著升高；同时，ＭＨＣ－Ⅱ、Ｂ７－１、Ｂ７－２、Ｉ－ＣＡＭ－１、ＶＣＡＭ－１和ＣＤ４０表达水平均增加；扫描电镜显示ＧＭ－ＣＳＦ处理的ＦＢＬ－３细胞，表面出现许多树突状突起，透射电镜下可见细胞浆内有丰富的线粒体，核呈分叶状。同时，能够显著刺激同种异体Ｔ淋巴细胞增殖，促进ＩＬ－２的产生；可显著提高细胞毒性Ｔ淋巴细胞（ＣＴＬ）细胞对ＦＢＬ－３细胞的特异性杀伤活性。结论ＧＭ－ＣＳＦ诱导的红白血病细胞可向树突状细胞分化，本身具有抗原提呈功能。     

荷胃癌小鼠自杀基因治疗后宿主免疫功能观察

目的 研究自杀基因疗法是否能诱导肿瘤宿主产免疫应条。方法 将小鼠胃癌细胞株（ＭＦＣ）接种于小鼠背部制作肿瘤模型,以单线疱疹病毒苷激酶基因（ＨＳＶ－ｔｋ）和大肠杆菌胞嘧啶脱氧基酶基因（ＣＤ）注射于瘤体内,并于瘤体周围注射ｍＩＬ－２和ｍＧＭ－ＣＳＦ ＤＮＡ及向腹腔内注射前药９－丙氧乌苷（ＧＶＣ）和５－Ｆｃ。治疗第５周取肿瘤消退小鼠的脾细胞测自然杀伤细胞（ＮＫ）和ＬＡＫ活性;第１２周取ＰＢＬ和脾细胞测Ｎ     

Egr—1启动子库列调控造血生长因子表达的实验研究

目的 探索辐射诱导基因调控元件启动的造血生长因子表达及其对造血恢复的作用。方法 该实验将携带Ｅｇｒ－１调控序列启动的ＦＬＴ３配基（ＦＬ）和ＧＭ－ＣＳＦ双顺反子载体（Ｅｇｒ－ＦＧ）导入骨髓基质细胞系ＨＦＣＬ（称为ＨＦＧＬ／ＥＦＧ）。采用ＲＴ－ＰＣ、ＥＬＩＳＡ及细胞半殖法观察ＦＬ和ＧＭ－ＣＳＦ ｃＤＮＡ在转染细胞中的表达及保护造血作用。结果 构建了Ｅｇｒ－１调控序列启动的双顺子反子基因表达载体（Ｅｇｒ     

小鼠骨髓基质细胞系QXMSC1促进骨髓移植后的造血重建

目的：观察骨髓基质细胞系ＱＸＭＳＣ１在骨髓移植后早期能否加速造血重建。方法：用脾克隆形成单位测定ＱＸＭＳＣ１对造血干细胞的影响。计数每根股骨有核细胞数，用半固体琼脂克隆形成法测定粒单系祖细胞（ＣＦＵ－ＧＭ），微量甲基纤维素法测定红系祖细胞（ＣＦＵ－Ｅ及ＢＦＵ－Ｅ）。结果：ＱＸＭＳＣ１细胞可明显增加ＣＦＵ－Ｓ克隆数。在骨髓移植后第１０天，ＱＸＭＳＣ１可增加骨髓有核细胞数，增加ＣＦＵ－ＧＭ、ＣＦＵ－Ｅ     

人硫氧还蛋白及其变异体对TF—1和NFS60细胞的凋亡抑制和？…

目的：比较ｒｈＴＲＸ与ｒｈＴＲＸδ３对细胞因子依赖株ＴＦ－１细胞、ＮＦＳ６０细胞撤除细胞因子所诱导调亡的抑制及促细胞增殖作用。方法：在大肠杆菌中克隆并表达重组ｈＴＲＸ和ｈＴＲＸδ３，纯化ｒｈＴＲＸ和ｒｈＴＲＸδ３蛋白，ＦＡＣＳ检测凋亡细胞，ＭＴＴ法检测细胞增殖。结果：在依赖ＩＬ－３、ＧＭ－ＣＳＦ生长的ＴＦ－１细胞（人红白血病细胞）和依赖Ｇ－ＣＳＦ生长的ＮＦＳ６０细胞（小鼠白血病细胞）撤除细胞因子后