人抑制素M突变体在毕赤酵母中的分泌表达研究

目的:构建重组人抑瘤素M突变体(Recombinant human mutant oncostatin M,rhMut-OSM)毕赤酵母分泌表达菌株.方法:将人抑瘤素M蛋白成熟蛋白编码序列同义突变成毕赤酵母偏好密码子,同时将100位和217位Asn突变成Glu,消除糖基化位点,人工合成人抑瘤素突变体基因.将基因直接连接到pPIC9载体信号肽识别序列之后,构建毕赤酵母真核表达载体DPIC9-rhMut-OSM,电转化毕赤酵母菌株GS115,用PCR法筛选阳性克隆,SDS-PAGE和Western blotting方法筛选能够稳定、高效分泌表达rhMut-OSM的酵母工程菌.结果:培养液上清经SDS-PAGE和Western blotting证实获得了相对分子质量约为22kD的rhMut-OSM,实现了非糖基化表达,表达量高峰出现在诱导72h后,摇瓶表达量为400mg/L.结论:成功构建了重组人抑瘤素突变体毕赤酵母工程菌株,能稳定、高效分泌表达rhMut-OSM.     

巴斯德毕赤酵母表达的人抑瘤素M发酵条件及发酵产物分析

目的：研究巴斯德毕赤酵母表达的人抑瘤素M（hOSM）大规模发酵条件。方法：利用hOSM毕赤酵母高表达菌株,于试管水平进行发酵pH条件的摸索,以补料分批培养方式在 80 L发酵罐中对hOSM工程菌进行3个批次的高密度发酵,控制和优化各种发酵条件,通过SDS-PAGE对发酵产物进行分析。结果：最终确定在pH 5.0的FM21培养基中扩增菌体,待菌体密度达190 g/L 时添加甲醇诱导,在发酵液pH 5.5的条件下,发酵温度稳定在28℃,通入空气的流量为2 vvm, 转速为650 r/min,罐内压力为10 P,溶解氧保持在25%左右,甲醇流加速度在9.3 mL/h/L 初始发酵液体积,诱导36 h时结束发酵,hOSM占分泌总蛋白的28%,产量达到280 mg?L-1。结论：应用hOSM工程菌能够进行稳定的发酵,为进行下一步生物学功能测定提供充足的物质基础。     

水蛭素在毕赤酵母中的分泌表达

目的:构建水蛭素毕赤酵母表达载体,获得重组蛋白在毕赤酵母中的分泌型表达. 方法: 通过PCR扩增获得水蛭素HV2, HV2-N47K基因,将序列正确的基因序列插入酵母表达载体pPIC9α分泌信号下游,再亚克隆入高拷贝载体pPIC9K,构建表达质粒pPIC9K-HV2, pPIC9K-HV2-N47K. 重组质粒转化宿主菌GSM1168,G418抗性筛选高拷贝的稳定表达菌株,经甲醇诱导表达并对表达产物进行鉴定. 结果: 成功构建了水蛭素毕赤酵母表达载体,获得水蛭素在毕赤酵母中的分泌型表达,表达产物具有抗凝血酶活性. 结论: 水蛭素在毕赤酵母中获得分泌型表达,为研究新药奠定了基础.     

人TALL-1基因在毕赤酵母中的分泌表达与鉴定

目的 研究在毕赤酵母(Pichia Pastoris)系统中人TALL-1基因的分泌表达,获得具有生物活性的重组TALL-1.方法 将人TALL-1基因插入含AOX1启动子和α分泌信号肽序列的酵母表达载体pPIC9K中,用Sac Ⅰ将重组质粒线性化,电转化Pichia Pastoris GS115感受态细胞,筛选阳性整合子并进行甲醇诱导表达,采用MTY对表达产物进行初步的生物活性检测.结果 经过诱导表达条件的优化,人TALL-1在酵母培养基BMMY中实现了分泌表达;免疫印迹和酶联免疫检测结果显示,重组产物可以结合其特异抗体;生物学活性检测证实其可抑制Hela细胞增殖.结论 在毕赤酵母系统中实现了人TALL-1的分泌表达,具有生物学活性的重组TALL-1分子可以用于进一步的结构与功能研究.     

毕赤酵母分泌表达系统的研究进展

毕赤酵母表达系统是一种新的，极具潜力的真核表达系统，具有其他系统不可比拟的优点，在生物医药领域正在得到越来越广泛的应用。本文综述了该蛋白表达系统的一些特征及影响其表达的相关因素。     

人CTLA4胞外区突变体在毕赤酵母中的高效表达

目的 根据毕赤酵母密码子偏好，设计并改造人CTLA4胞外区cDNA，构建毕赤酵母分泌型表达载体，以实现人CTLA4胞外区蛋白在毕赤酵母中的高效表达。方法 利用PCR定点突变技术，将人CTLA4胞外区cDNA中的毕赤酵母低频使用密码子突变成高频使用密码子而不改变其氨基酸序列；经DNA序列测定证实后插入毕赤酵母高拷贝表达载体pPIC9Ka分泌信号下游，SacⅠ线性化后电转GS115；G418梯度筛选转化菌；PCR鉴定目的基因整合；甲醇诱导表达，SDS-PAGE、Westem blotting、肽质量指纹等鉴定表达蛋白。结果 成功地对人CTLA4胞外区cDNA进行了定点突变，该突变体在毕赤酵母中能成功表达CTLA4胞外区蛋白。结论 为高效表达人CTLA4胞外区蛋白及其功能研究和临床应用奠定了基础。     

抑瘤素M在膝关节骨关节炎中的表达

目的检测抑瘤素M(OSM)在骨关节炎(OA)和正常滑膜组织中的表达差异,探讨OSM在骨关节炎发病中的作用。方法术中留取33例OA严重病变组、10例OA轻微病变组、8例正常对照组的滑膜组织。采用实时定量PCR技术检测各组膝关节滑膜组织中OSM的表达,免疫组织化学法检测各组滑膜组织中OSM的分布与表达。结果在膝关节滑膜组织中,OA严重病变组、OA轻微病变组和正常对照组均能检测出OSM阳性表达且与病情严重程度呈正相关,差异有统计学意义(P<0.05)。OA轻微病变组与对照组比较差异无统计学意义(P>0.05)。结论 OA患者滑膜细胞高表达OSM与病情相关。OSM在骨关节炎的发病过程中起到重要作用。     

人干燥综合征B抗原在巴斯德毕赤酵母中的高效分泌表达研究

目的：通过基因克隆在巴斯德毕赤酵母中表达人干燥综合征B抗原（SS—B）。方法：PCR扩增SS—B基因，与酵母表达载体pPIC9k重组，构建表达质粒pPIC9k—SS—B。用电穿孔法转化酵母菌SMD1168，在MD平板上筛选重组克隆，用G418快速筛选高拷贝转化子，阳性克隆经甲醇诱导表达后，培养上清用十二烷基硫酸钠一聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS—PAGE）和免疫酶斑点法（immunodot）鉴定。结果：PCR产物约为1200bp，与预期1224bp接近，pPIC9k—SS—B重组阳性克隆测序结果与GenBank核酸数据库报道完全一致，双酶切鉴定正确。表达产物SS—B的分子量约48000，高拷贝毕赤酵母转化菌的表达水平明显高于低拷贝的。表达量占分泌总蛋白60％以上。产物浓度为800—900mg／L。免疫酶斑点法证实表达产物具有天然SS—B分子的免疫原性。阴性对照菌未见目的表达条带。结论：SS—B在巴斯德毕赤酵母中获得高效分泌表达，为下一步研究打下了基础。     

hITF毕赤酵母表达载体的构建及分泌表达

目的构建hITF毕赤酵母分泌型表达载体,表达重组hITF,为功能研究奠定基础.方法通过PCR获得hITFcDNA片段,将目的基因插入酵母表达载体pGAPZαA分泌信号下游,得到重组载体pGAPZαA-hITF.BspH I线性化后氯化锂转化进入X-33,Zeocin筛选转化酵母菌,PCR鉴定目的基因.阳性转化子经摇瓶表达,取上清TCA沉淀后做Tricine SDS-PAGE分析及Western blot检测.结果经测序及PCR证实,hITFcDNA准确插入酵母表达载体pGAPZαA中,氯化锂转化后,重组载体通过同源重组整合进入酵母基因组中.Tricine SDS-PAGE分析证明hITF的分子量约为10×103,Western blot分析表明,表达蛋白具有良好的抗原性和特异性.结论成功构建出酵母表达载体pGAPZαA-hITF,获得重组hITF,为深入研究hITF奠定了基础.     

人瘦素在毕赤酵母中的表达及其分离纯化

目的:为了获得人(瘦素或瘦蛋白)而进一步研究其生理作用、作用机制与病理意义。Leptin方法:采用逆转录-聚合酶链反应()方法,从人腹部皮下脂肪组织中分离脂肪细胞总,经逆转录、扩增出肥胖基因的编码序列RT-PCRRNAPCR(基因),再克隆到表达载体α中,在毕赤酵母菌株中表达。ObcDNApPICZGS115结果:的扩增产物长度为,克PCR462bp隆后的表达产物,经证实,约为分子量为的特异蛋白条带,与人瘦素的理论预计值相符合,经放免法测定,SDS-PAGE17kD表达量达到。通过其多聚组氨酸接头与金属镍螯合的亲和层析法纯化表达蛋白,在上呈现分子量为的36mg/LSDS-PAGE17kD单一蛋白条带。结论:通过基因工程手段已成功表达出人瘦素并分离纯化得到纯度较高的人瘦素。     

人胰岛新生相关蛋白基因的克隆及在毕赤酵母中的表达

目的 在毕赤酵母中分泌表达具有生物学活性的重组人胰岛新生相关蛋白(rhINGAP),用于INGAP的生理功能研究和动物试验.方法 通过PCR扩增INGAP基因,插入到重组质粒α/pUC18的α因子信号序列的Xho Ⅰ和EcoR Ⅰ酶切位点处,再将融合基因αINGAP重组到表达质粒pPIC9K的BamH Ⅰ和EcoR Ⅰ之间,Sal Ⅰ酶切线性化重组质粒INGAP/pPIC9K,电穿孔转化毕赤酵母,营养缺陷型培养基MD和G418筛选含高拷贝表达盒的酵母转化子,PCR鉴定是否含有目的 基因INGAP,甲醇诱导rhINGAP的表达,SDS-PAGE和Western blotting鉴定目的 蛋白,用ELISA定量测定生物学活性.结果 成功构建了重组表达质粒INGAP/pPIC9K,筛选得到3个阳性转化子,表达产物具有良好的抗原活性.结论 实现了rhINGAP在毕赤酵母中的高效分泌性表达.     

白蛋白信号肽引导天然N-端的rBPTI在毕赤酵母中高效分泌表达

目的：探讨在毕赤酵母(Pichia pastoris)中高效分泌表达具有天然N-端序列的rBPTI。方法：将白蛋白信号肽(hsasp)和bpti基因连接并构建真核表达载体pPICZ/hsasp-bpti，电击转化毕赤酵母菌株X-33，用PCR法、SDS-PAGE和胰蛋白酶抑制活性分析筛选阳性转化菌。结果：转染pPICZ/hsasp-bpti的毕赤酵母X-33工程菌能够高效地分泌表达rBPTI；培养上清中rBPTI含量约200 mg• L^-1；SDS-PAGE和质谱分析结果显示rBPTI相对分子质量分别为6 500和6 508；rBPTI的N-端测序结果表明其N-端15个氨基酸序列与天然BPTI完全一致；胰蛋白酶活性抑制分析结果表明，抑制常数Ki＝（2.6±0.1）×10^-9,与天然BPTI一致。结论：hsasp能够在毕赤酵母中高效地引导分泌表达天然N-端氨基酸序列的rBPTI,其表达量达200 mg• L^-1。     

Production of human intestinal trefoil factor in Pichia pastoris

Objective：To construct a Pichia pastoris （P. pastoris） expression vector of human intestinal trefoil factor （hITF） and study its expression and purification procedures. Methods：hITF gene encoding mature peptide was modified with a polybistidine tag sequence at the N-terminal, and then inserted into the P. pastoris expression vector pGAPZaA at the downstream of the s-mating factor signal. After gene sequencing, the recombinant pGAPZaA-hITF was transformed into the P. pastoris strain X-33 with lithium chloride, rhITF was induced to constitutively express in shake flask, and then analyzed with Tricine SDS-PAGEand Western blotting. The obtained rhITF was isolated from the cultured supernatants by ammonium sulfate precipitation, Ni-NTA affinity chromatography, and ultrafiltration. Results：The correctness and integrity of rhITF were identified by restriction digestion and gene sequencing, rhITF was successfully expressed to 50 mg/L as a secretive protein. After purification, the purity was above 95%. Tricine SDS-PAGE and Western-blot analysis showed that rhITF presented as a single band with a molecular weight of 10 kDa, a little larger than 7 879 Da as assayed by mass spectrometry analysis. Conclusion： hITF P. pastoris expression vector is successfully constructed and rhITF is expressed in P. pastoris at commercially relevant level. This research lays foundation for the further functional studying of hITF.     

人重组白细胞介素11在毕氏酵母系统中的表达及纯化

目的在甲醇营养型毕氏酵母蛋白质表达系统中高效表达人白细胞介素-11(rhIL-11),便于进一步开发。方法以人工设计合成的rhIL-11基因,构建表达载体pPICZαA-IL-11,经线性化后电转化导入毕氏酵母菌株KM71,甲醇诱导表达,用ELISA和SDS-PAGE检测发酵上清中IL-11的抗原性和表达量,用IL-11依赖的B9-11细胞株分析其生物学活性,采用疏水层析、离子交换和凝胶过滤纯化发酵上清中的IL-11。结果序列分析表明,克隆载体中IL-11人工基因序列与设计相符;基因工程菌株KM71-2424在摇瓶培养上清中IL-11的表达量超过60mg/L,生物学活性测定显示其比活性为5.5×10     

人骨形成蛋白-2成熟肽在巴斯德毕赤酵母中的分泌表达

目的利用甲醇毕赤酵母表达系统,高效分泌表达人骨形成蛋白-2成熟肽(hBMP-2)。方法利用PCR方法扩增得到hBMP-2基因,构建其毕赤酵母真核表达载体pPICZaC/hBMP2,电转化巴斯德毕氏酵母X-33,于28℃进行甲醇诱导分泌表达,用PCR法、SDS-PAGE、WesternBlot等方法筛选获得高效表达rhBMP-2的工程菌株,并进行了表达产物的纯化和活性测定。结果表达产物分泌至培养上清中,rhBMP-2含量达100mg·L-1。SDS-PAGE初步验证了表达产物的分子量,经WesternBlot和ELISA检测到重组表达产物的特异性结合活性。结论构建了重组hBMP-2的基因工程菌,并在毕赤酵母中实现了高效分泌表达,为进一步研究其活性和功能奠定了基础。     

人肠三叶因子毕赤酵母表达载体的构建及稳定整合菌珠的筛选

目的 构建hITF毕赤酵母分泌型表达载体，获得稳定整合酵母菌珠，为大量获得重组hITF、进行功能研究奠定基础。方法 通过PCR获得hITFcDNA片段，将目的基因插入酵母表达载体pPICZαA分泌信号下游，得到重组载体pPICZαA—hITF，SαcⅠ线性化后氯化锂转化进入X-33，Zeocin筛选转化酵母菌，PCR鉴定目的基因，MD、MM鉴定基因型。结果 经测序证实PCR扩增的hITFcDNA与基因文库中的完全一致并准确插入酵母表达载体pPICZαA中，氯化锂转化后，PCR鉴定证明重组载体整合进入酵母基因组中，基因型鉴定表明获得的酵母菌株均为Mut^＋。结论 成功构建出酵母表达载体pPICZαA—hITF，获得稳定整合hITFcDNA的酵母菌株，为hITF的大量表达及其功能研究奠定了基础。     

人毛乳头细胞HSPC016基因在毕赤酵母中的表达和鉴定

目的构建人毛乳头细胞HSPC016基因的真核表达载体,诱导其表达并对目的蛋白基本生物学特性进行鉴定.方法用PCR从pET-28a( )/HSPC016中扩增出195 bp目的基因,克隆至酵母表达载体pPIC9K质粒,经酶切鉴定后转化毕赤酵母菌GS115,G418-YPD平板筛选高拷贝转化子,甲醇诱导表达后进行Western blot检测和目的蛋白N-端氨基酸测序鉴定.结果用PCR成功扩增出目的基因;pPIC9K/HSPC016转化GS115用G418-YPD平板筛选高拷贝转化子,甲醇诱导后,SDS-PAGE电泳鉴定:目的蛋白相对分子量约为7.2×103,与理论预测值相吻合;UVP扫描表明目的蛋白表达率约18%;Western blot检测具有良好的免疫反应性;N-端氨基酸测序结果与预期序列完全一致.结论HSPC016基因能通过酵母表达载体pPIC9K及宿主菌GS115进行高效、正确地表达,为研究HSPC016基因在真核细胞水平表达的生物学意义奠定了基础.