白蛋白信号肽引导天然N-端的rBPTI在毕赤酵母中高效分泌表达

目的：探讨在毕赤酵母(Pichia pastoris)中高效分泌表达具有天然N-端序列的rBPTI。方法：将白蛋白信号肽(hsasp)和bpti基因连接并构建真核表达载体pPICZ/hsasp-bpti，电击转化毕赤酵母菌株X-33，用PCR法、SDS-PAGE和胰蛋白酶抑制活性分析筛选阳性转化菌。结果：转染pPICZ/hsasp-bpti的毕赤酵母X-33工程菌能够高效地分泌表达rBPTI；培养上清中rBPTI含量约200 mg• L^-1；SDS-PAGE和质谱分析结果显示rBPTI相对分子质量分别为6 500和6 508；rBPTI的N-端测序结果表明其N-端15个氨基酸序列与天然BPTI完全一致；胰蛋白酶活性抑制分析结果表明，抑制常数Ki＝（2.6±0.1）×10^-9,与天然BPTI一致。结论：hsasp能够在毕赤酵母中高效地引导分泌表达天然N-端氨基酸序列的rBPTI,其表达量达200 mg• L^-1。     

人抑制素M突变体在毕赤酵母中的分泌表达研究

目的:构建重组人抑瘤素M突变体(Recombinant human mutant oncostatin M,rhMut-OSM)毕赤酵母分泌表达菌株.方法:将人抑瘤素M蛋白成熟蛋白编码序列同义突变成毕赤酵母偏好密码子,同时将100位和217位Asn突变成Glu,消除糖基化位点,人工合成人抑瘤素突变体基因.将基因直接连接到pPIC9载体信号肽识别序列之后,构建毕赤酵母真核表达载体DPIC9-rhMut-OSM,电转化毕赤酵母菌株GS115,用PCR法筛选阳性克隆,SDS-PAGE和Western blotting方法筛选能够稳定、高效分泌表达rhMut-OSM的酵母工程菌.结果:培养液上清经SDS-PAGE和Western blotting证实获得了相对分子质量约为22kD的rhMut-OSM,实现了非糖基化表达,表达量高峰出现在诱导72h后,摇瓶表达量为400mg/L.结论:成功构建了重组人抑瘤素突变体毕赤酵母工程菌株,能稳定、高效分泌表达rhMut-OSM.     

人碱性成纤维细胞生长因子cDNA的克隆及在毕赤酵母中的表达

目的：克隆和表达人碱性成纤维细胞生长因子(hbFGF),以便进一步研究其功能。方法：从人神经胶质瘤细胞中提取总RNA,采用RT-PCR方法,扩增出hbFGF cDNA片段,与pMD18-T载体连接后作DNA序列分析,并用亚克隆的方法构建pPICZα-hbfFGF,将测序正确的重组质粒用SacI线性化后电转化至毕赤酵母X-33,经PCR法、SDS-PAGE和Western blotting分析表达产物,从而筛选出能够稳定、高效分泌表达hbFGF的酵母工程菌。结果：经测序证实获得的hbFGF序列与GenBank（登录号NM002006）报道的完全一致,甲醇诱导表达后培养液上清的SDS-PAGE凝胶电泳显示在相对分子质量约18 000有一蛋白条带,Western blotting结果显示表达产物与抗人碱性成纤维细胞生长因子抗体产生特异性条带,证明rhbFGF蛋白的表达。结论：成功克隆了hbFGF 基因,并在毕赤酵母体系中进行了表达。     

弓形虫表面抗原P30与免疫佐剂CTA2/B复合基因在毕赤酵母中的分泌表达

目的：探讨毕赤酵母能否高效表达具有生物学活性的弓形虫主要表面抗原P30与免疫佐剂CTA2／B重组蛋白（P30-CTA2／B）。方法：将目的基因定向亚克隆入pGAPZαA表达载体。构建酵母表达载体pGAPZαA-P30-CTX;线性化重组酵母表达载体,电穿孔法导入毕赤酵母GS115。抗生素Zeocin筛选、PCR法鉴定阳性转化子;酵母工程菌摇瓶表达,取上清液行SDS-PAGE和Westem blotting分析。结果：在毕赤酵母菌中分泌表达P30-CTA2／B重组蛋白,产量高达0．57g／L：SDS-PAGE显示其在49000处有一条明显表达蛋白条带,Western blotting显示表达蛋白具有P30抗原特异性。结论：大量具有免疫活性的P30-CTA2／B重组蛋白在毕赤酵母中表达。为弓形虫亚单位复合疫苗的研制和大规模动物实验创造了条件。     

重组人β-淀粉样蛋白1-42在毕赤酵母中的表达与鉴定

目的：探索在毕赤酵母中表达人β-淀粉样蛋白1-42 (hAβ_1-42)的可行性。方法：以含有hAβ_1-42基因的质粒为模板，采用PCR方法扩增所需DNA片段，与毕赤酵母表达载体pPICZα连接，构建重组质粒pPICZα-hAβ_1-42 并进行DNA测序分析。将其电击转化毕赤酵母菌株X-33，经SDS-PAGE和Western blotting分析表达产物。结果：经测序证实，获得的hAβ_1-42序列与基因合成的完全一致。SDS-PAGE显示，在约4 000处有一蛋白带，Western blotting证明表达产物与抗hAβ_1-42抗体有特异性免疫反应。结论：本研究在毕赤酵母中成功地重组表达hAβ_1-42。     

应用毕赤酵母分泌表达筛选人抗狂犬病毒抗体scFv-Fc

目的：利用毕赤酵母人抗狂犬病毒抗体分泌表达文库获得具特异性狂犬病毒抗原结合活性的分泌型小分子抗体（scFv-Fc）。方法： RT-PCR方法扩增获得一组轻链和重链可变区基因。利用重叠延伸PCR方法组装scFv基因后克隆入毕赤酵母scFv-Fc抗体库通用表达质粒pPICZα/Fc后，电转化X33酵母菌，甲醇诱导表达后进行ELISA筛选、基因序列分析及免疫印迹分析。结果：构建了抗狂犬病毒毕赤酵母分泌型scFv-Fc库，获得了12株阳性菌株。对其中2株阳性克隆进行了序列分析证实为新的抗体可变区基因。ELISA、Western blotting分析，证实该scFv-Fc具有特异性狂犬病毒抗原结合活性，相对分子质量为56 000。结论：通过毕赤酵母人抗狂犬病毒抗体scFv-Fc分泌表达文库筛选获得具较高亲和力的新scFv-Fc抗体。     

EB病毒衣壳蛋白P23重组质粒的构建及其在毕赤酵母中的表达

目的 构建pPICZα A-BLRF2重组表达载体,实现BLRF2重组蛋白在毕赤酵母中高效分泌表达,为进一步研制高效能重组抗原诊断试剂,研发亚单位疫苗奠定基础.方法 以B95-8细胞提取的EBV DNA为模板,采用PCR法扩增出目的基因片段BLRF2,与毕赤酵母表达载体pPICZαA连接,电转化酵母菌GS115,甲醇诱导重组蛋白表达,表达产物经Western blotting进行鉴定.结果 成功构建pPICZαA-BLRF2重组质粒,并在毕赤酵母菌中成功表达了分泌型BLRF2重组蛋白.结论 在毕赤酵母GS115中高效分泌表达了P23蛋白,获得了在鼻咽癌筛选中有一定应用价值的pPICZα A-BLRF2生产酵母工程菌株,为进一步应用研究奠定了基础.     

人胰岛新生相关蛋白基因的克隆及在毕赤酵母中的表达

目的 在毕赤酵母中分泌表达具有生物学活性的重组人胰岛新生相关蛋白(rhINGAP),用于INGAP的生理功能研究和动物试验.方法 通过PCR扩增INGAP基因,插入到重组质粒α/pUC18的α因子信号序列的Xho Ⅰ和EcoR Ⅰ酶切位点处,再将融合基因αINGAP重组到表达质粒pPIC9K的BamH Ⅰ和EcoR Ⅰ之间,Sal Ⅰ酶切线性化重组质粒INGAP/pPIC9K,电穿孔转化毕赤酵母,营养缺陷型培养基MD和G418筛选含高拷贝表达盒的酵母转化子,PCR鉴定是否含有目的 基因INGAP,甲醇诱导rhINGAP的表达,SDS-PAGE和Western blotting鉴定目的 蛋白,用ELISA定量测定生物学活性.结果 成功构建了重组表达质粒INGAP/pPIC9K,筛选得到3个阳性转化子,表达产物具有良好的抗原活性.结论 实现了rhINGAP在毕赤酵母中的高效分泌性表达.     

重组人β-淀粉样蛋白1-42大规模发酵及纯化工艺

目的:在毕赤酵母（Pichia pastoris）中高效表达人β-淀粉样蛋白1-42(hAβ_1-42),用80 L的发酵罐大量制备hAβ_1-42。方法: 在成功构建表达载体pPICZα-hAβ_1-42并电转化至毕赤酵母X-33的基础上,筛选高表达hAβ_1-42工程菌,对发酵液的pH值、溶解氧、甲醇流加速度以及诱导表达的时间等发酵条件进行系统优化,通过阳离子交换层析和反向疏水层析对其进行纯化,实现其大规模制备。结果: 筛选出的高表达工程菌采用80 L发酵罐甲醇诱导补料批式发酵,在pH 4.0、溶解氧浓度20 %～30 %、罐内压力为10 psi、甲醇诱导48 h时产量最高可达150 mg•L^-1;纯化的hAβ_1-42经SDS-PAGE分析显示单一区带,相对分子质量约为4 200。结论:构建、筛选出高效表达hAβ_1-42的毕赤酵母工程菌,并建立稳定的发酵和纯化制备工艺。     

人成纤维细胞生长因子21基因的克隆及在毕赤酵母中的表达

目的：以毕赤酵母(Pichia pastoris) GS115和SMD1168为宿主菌表达人源成纤维细胞生长因子21（hFGF21）,为开发治疗糖尿病药物提供一定的实验基础。方法：根据毕赤酵母基因偏爱密码子和hFGF21氨基酸序列,设计多条寡核苷酸引物。利用融合PCR方法获得人工合成的成纤维细胞生长因子21(FGF21)基因,定向克隆到质粒pPIC9K中,电转化Pichia pastoris GS115和SMD1168。MD、MM平板筛选表型Mut⁺,YPD/G418平板进一步筛选高拷贝转化子。甲醇诱导表达,硫酸铵沉淀、分子筛、离子交换方法纯化目的蛋白。结果：PCR　扩增出约569 bp的特异性片段,测序分析正确;诱导表达上清经SDS-PAGE和Western blotting分析表明：FGF21在宿主菌GS115中不表达,而在SMD1168表达上清中出现相对分子质量为20 000的特异性条带,且与抗FGF21抗体产生特异性反应,阴性对照在该处无特异性带,证明hFGF21蛋白在SMD1168菌株中成功分泌表达。结论：成功克隆FGF21基因,并在Picha pastoris　SMD1168中获得表达。     

戊型肝炎病毒 ORF2截短蛋白 p154在毕赤酵母中的分泌性表达及其抗原性

目的：利用毕赤酵母系统表达戊型肝炎病毒（HEV）ORF2编码蛋白第452～605氨基酸多肽（p154）,探讨毕赤酵母表达系统用于研发戊型肝炎基因工程疫苗的可能性。方法：采集戊型肝炎患者粪便,进行RT-PCR检测和测序鉴定,并依此为模板扩增ORF2 p154基因,克隆到表达载体pPICZαA上,电转化入毕赤酵母宿主菌GS115,经筛选鉴定后将携带目的基因的重组克隆菌进行诱导表达,对表达产物进行SDS-PAGE和蛋白质印迹法分析。结果：利用基因重组技术构建了含HEV p154片段的pPICZαA重组质粒,并在毕赤酵母菌株GS115中实现了分泌性表达,表达的目的蛋白p154分子质量约为22 kDa,上清中p154表达量可达到200μg· ml -1。 p154可与HEV感染兔恢复期血清及HEV单克隆抗体6F9进行反应,表明酵母表达的p154具有良好的抗原性。结论：HEV ORF2 p154在毕赤酵母表达系统中得到了成功表达,为进一步研发真核表达的戊型肝炎基因工程疫苗奠定了实验基础。     

人Endostatin在毕赤酵母菌中的表达及其抑癌活性研究

目的在毕赤酵母中获得有活性的分泌型重组Endostatin.方法一步法抽提胎肝总RNA,RT-PCR扩增endostatin全基因.用T-A克隆技术构建克隆载体;双酶切回收550bp的endostatin基因,亚克隆入酵母表达载体.重组质粒分别以PCR、酶切及测序鉴定.电转化法将线形化的重组表达DNA转导入GS¨5感受态细胞,SDS-PAGE电泳筛选阳性重组子,G25及Heprin亲和层析柱初步纯化重组蛋白.MTT法测定重组endosatatin对血管内皮细胞增殖的抑制作用.结果RT-PCR获得550bp的特异扩增条带,T-A克隆后,PCR挑选阳性重组子,测序证实序列正确;亚克隆后的表达载体,PCR可得550bp的特异条带,EcoRI、Not I双酶切获得550bp和3kb的条带,与预期一致,DNA测序证明核苷酸序列100%正确.SDSPAGE证实重组菌较空白有一明显条带,Heparin亲和层析后,1mol/INaCl洗脱的蛋白峰在体外可特异性抑制血管内皮细胞的增殖.结论在毕赤酵母菌中成功地获得了分泌表达的活性endostatin蛋白.     

人血管抑素K1-3在毕赤酵母胞内表达的研究

目的:构建人血管抑素K1-3的重组酵母胞内表达质粒PHIL-D2/K1-3,获得重组目的蛋白.方法:从胎儿肝脏组织用RT-PCR方法扩增人血管抑素K1-3目的基因,克隆至酵母胞内表达质粒PHIL-D2中,线性化后转化到毕赤酵母GS115胞内,经PCR和Sourthern杂交筛选出阳性转化子,并用甲醇诱导表达.表达产物进行SDS-PAGE(12%)和Western blot检测,经赖氨酸亲和层析柱纯化后,用Lowry法测定蛋白含量,并进行生物活性测定.结果:SDS-PAGE和Western blot结果显示,表达蛋白质的相对分子量为30kd左右,低糖基化.Lowry法测定蛋白表达量为6.8mg/L.活性测定实验表明重组血管抑素能特异抑制人血管内皮细胞的增殖.结论:在毕赤酵母GS115胞内成功表达了人血管抑素K1-3重组蛋白.     

重组融合蛋白rTMP-GH在巴斯德毕赤酵母中表达的研究

目的 实现TPO模拟肽(thrombopoietin mimetic peptide,TMP)与人生长激素(human growth hormone,hGH)的重组融合蛋白rTMP-GH在巴氏毕赤酵母中的高效表达.方法 以含有rTMP-GH核苷酸序列的原核质粒为模板,PCR方法获得rTMP-GH的编码序列,并亚克降至载体pPIC9K中,将所构建pPIC9K-rTMP-GH表达质粒转化酵母宿主细胞GS115,MD/MM平板及G418抗性筛选高表达株,然后进行试管补料分批表达,Western blot对表达产物进行鉴定,通过巨核细胞集落形成能力对其,圭物学活性进行初步检测.结果 成功构建pPIC9K-rTMP-GH表达质粒,筛选到高表达rTMP-GH重组融合蛋白的巴氏毕赤酵母细胞株,初步证实所表达产物具有刺激巨核细胞集落形成的能力.结论 成功实现了rTMP-GH融合蛋白在巴氏毕赤酵母中的高效表达.     

LZ-8基因克隆及其在毕赤酵母中的诱导表达

【目的】从灵芝中克隆LZ-8基因并在毕赤酵母表达系统中诱导表达LZ-8蛋白。【方法】采用聚合酶链反应(PCR)法从赤灵芝的基因组DNA中扩增LZ-8基因序列,采用电激转化法将pPLZ8-X重组质粒转化到毕赤酵母中,PCR Southernblot法检测酵母是否转化LZ-8基因,十二烷基磺酸钠—聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)并银染法观察蛋白在酵母中的差异表达。【结果】PCR Southern blot结果显示LZ-8基因已转化到酵母中;SDS-PAGE胶银染结果提示LZ-8蛋白在酵母中被诱导表达。【结论】免疫调节蛋白基因LZ-8在毕赤酵母表达系统获得了诱导表达。     

人α-防御素5在毕赤酵母中分泌表达的研究

目的 探索人α-防御素5成熟肽(mHD5)在酵母中高效分泌表达的可行性.方法 PCR扩增获得酵母菌偏好的mHD5密码子序列,应用基因重组方法构建表达质粒,电击转化酵母菌株GS115,应用G418浓度梯度、表型和PCR技术筛选高拷贝转化株.经摇瓶发酵和甲醇诱导,Tricine-SDS-PAGE分析重组mHD5(rmHD5)表达量,并采用Western blot鉴定.选用琼脂扩散法检测rmHD5的抑菌活性.结果 构建了pPIC9K-mHD5酵母表达质粒.筛选得到3株His /Mut 表型,且耐受8 mg/ml G418的多拷贝转化酵母菌株,成功获得表达量约120 mg/L的发酵上清.rmHD3对大肠杆菌(EC25922)和金黄色葡萄球菌(SA25923)2种标准菌株均具有明显的抑菌活性.结论 防御素基因可以在毕赤酵母中实现分泌型离表达,此策略可能是抗菌肽工业化开发的有效途径之一.     

人EGFR配体结合区在Pichia酵母中的表达

目的采用基因工程方法构建基因工程菌制备人EGFR配体结合区蛋白。方法 自人肿瘤细胞SK中获取人EGFR cDNA,构建pPIC9K酵母表达栽体,采用Piehia酵母真核表达系统表达目的蛋白。结果SDS-PAGE及Western-blot结果显示目的蛋白已成功表达。结论在Piehia酵母中成功表达人EGFR配体结合区蛋白。     

可溶性GPC3基因的克隆及酵母表达

目的克隆可溶性磷脂酰肌醇蛋白聚糖3（soluble glypican-3,sGPC3）基因,并分泌表达重组蛋白。方法通过RT-PCR克隆sGPC3 cDNA,利用EcoRⅠ和XbaⅠ酶切位点,将sGPC3基因插入酵母表达载体pPICZαA中,构建真核表达质粒pPICZαA-sGPC3,以该表达质粒转染酵母菌株X-33,在含有Zeozin的YPD平板上进行筛选,然后对PCR鉴定为阳性的酵母重组子进行甲醇诱导表达,表达上清经SDSPAGE和Western blot检测。结果使用特异性引物进行RT-PCR,获得约1 600 bp左右与目的基因大小相符的条带,构建的真核表达质粒pPICZαA-sGPC3表达框正确无误,阳性酵母重组子x-33/pPICZαAsGPC3诱导表达上清在60 000处有与预期大小相符的蛋白条带,且该蛋白条带与抗6×His单克隆抗体孵育后呈现特异性反应。结论成功克隆了可溶性GPC3基因,并在毕赤酵母中获得分泌表达,为进一步研究sGPC3对肝细胞癌的作用及作用机制、开发一种生物治疗肝癌的新型药物奠定了基础。     

登革病毒3型病毒样颗粒在酵母体内的表达与鉴定

目的 探讨登革病毒3型病毒样颗粒(DENV3-vLPs)的免疫原性.方法 用PCR法扩增登革病毒3型prME 基因,插入载体pGAPZaA构建重组质粒pGAPZaA-prME-D3,将其转化毕赤酵母X33构建转化子pGAPZaA-prME-D3/X33.对转化子表达上清和细胞裂解液进行SDS-PAGE和Western blotting分析.用蔗糖密度梯度离心纯化表达的DENV3-VLPs并进行鉴定和电镜观察.结果 成功构建重组载体pGAPZaA-prME-D3,获得酵母转化子pGAPZaA-prME-D3/X33,并应用毕赤酵母表达了DENV3-VLPs,表达蛋白约50 000 Mr,电镜观察vLPs直径为20～50 am.结论 应用酵母表达系统成功表达了DENV-3 VLPs,经鉴定表明其具有免疫反应性,为后续免疫原性研究及四价登革vLPs疫苗的构建奠定了基础.