体外培养大鼠脊髓前角神经元：脑源性神经生长因子对突触蛋白表达的影响

探讨BDNF对体外培养的大鼠脊髓前角神经元内突触素I与突触囊泡素(SYN)表达的影响。取孕14 d大鼠子宫内胎鼠的脊髓腹侧部分神经元,体外有血清培养。在培养7 d后．随机分成对照组、BDNF组和抗BDNF组。BDNF组培养液中加入BDNF(20 ng/ml),抗BDNF组培养液中加入BDNF抗体(20цg/ml),对照组加入等量Hanks液。3 d后在倒置显微镜下计数三组神经元成活数,并用NF-200、MAP-2、NSE的免疫组化反应对神经细胞进行鉴定。行突触素I与SYN免疫组化反应,对部分细胞行突触素I mRNA原位杂交反应,运用图像分析系统对突触素I与SYN免疫反应阳性产物以及突触素I原位杂交反应阳性产物作光密度分析。结果发现有血清培养时各组脊髓前角神经元的存活数差异无显著性 (P>0.05);BDNF组突触素I与SYN免疫反应阳性产物的平均光密度值高于其它两组,抗BDNF组最低（P<0.01）。BDNP组突触素I mRNA阳性产物的平均光密度值明显高于其它两组,抗BDNF组突触素I mRNA阳性产物的平均光密度值最低（P<0.01）。本研究结果提示BDNF对有血清培养时脊髓前角神经元的存活没有明显影响,但BDNF可明显上调培养的脊髓前角神经元内突触素I与SYN的表达     

骨髓间充质干细胞移植对大鼠脊髓损伤后脑神经生长因子表达影响的研究

背景: 近年来关于骨髓间充质干细胞移植对脊髓损伤修复方面的研究较多,但目前相关机制尚不清楚。 目的：观察间充质干细胞移植对大鼠脊髓损伤后脑源性神经营养因子表达的影响。 设计、时间及地点：随机对照动物实验,于2003-04/07在中国医科大学神经解剖学实验室完成。 材料：选取鼠龄3个月的SD大鼠64只,雌雄不拘,体质量250~300 g,随机抽取4只大鼠用于骨髓间充质干细胞的分离与培养,其余60只用于制备脊髓横断损伤模型。 方法：60只大鼠随机抽签法分为3组,细胞移植组(n=24)：脊髓损伤后第7天,无菌条件下以微量注射缓慢注入含骨髓间充质干细胞(1×109 L-1)的培养液5 μL至脊髓损伤区;PBS组(n=24)：注入等量(5 μL)磷酸盐缓冲液体;空白对照组(n=12)：注入生理盐水5 μL。 主要观察指标：分别于造模后7,14,28 d取材,观察骨髓间充质干细胞的形态变化;免疫组织化学法检测间充质干细胞移植后大鼠脊髓损伤区脑源性神经营养因子的表达。 结果：60只SD大鼠均进入结果分析。10代以后细胞增殖能力有所减弱,胞体变得扁平,若加入碱性成纤维细胞生长因子,则可维持其增殖能力和形态。大鼠脑源性神经营养因子在正常大鼠脊髓组织中有一定表达,细胞移植后第7,14,28天,细胞移植组脑源性神经营养因子表达均高于PBS组和空白对照组(P < 0.05);空白对照组与PBS组脑源性神经营养因子表达无明显差异(P > 0.05)。 结论：骨髓间充质干细胞在移植后通过上调脑源性神经营养因子的表达从而促进轴突的再生,可能是治疗脊髓损伤的重要机制。     

大鼠脊髓源性神经干细胞的培养分化及其特异性研究

目的 研究大鼠脊髓源性神经干细胞培养和分化的特异性。方法 从孕17d的SD大鼠胚胎脊髓中分离，培养神经干细胞并用血清诱导其分化，通过免疫荧光化学方法研究其特性。结果 在血清的诱导下，脊髓源性神经干细胞大多数分化成GFAP阳性的星形胶质细胞，少数分化为tubulin-β阳性的神经细胞；与脑源性神经干细胞分化的神经细胞相比较，其分化出的神经细胞的突起长度明显延长。结论 脊髓源性神经干细胞在体外具有多向分化潜能，但与脑源性神经干细胞有明显差别。     

表皮生长因子对脑源性神经生长因子诱导体外培养大鼠脑海马神经干细胞向神经元分化的影响*★

目的：获得大量神经干细胞并且能够控制其向神经元定向分化可为进一步修复损伤大脑和治疗退行性神经系统疾病奠定种子细胞基础，实验观察了表皮生长因子对脑源性神经生长因子诱导神经干细胞向神经元分化过程中的影响。 方法：实验于2007-08在中国医科大学神经解剖研究室完成。①材料：清洁级雄性成年SD大鼠3只，由中国医科大学实验动物部提供，实验过程中对动物的处置符合动物伦理学标准。②实验方法：无菌条件下分离大鼠脑海马组织，胰蛋白酶消化后采用无血清培养技术体外培养神经干细胞，传至第4代克隆球直径约为200 μm时，滴加DMEM/F12 + 2% B27 + 20 μg/L表皮生长因子+ 20 μg/L碱性成纤维细胞生长因子 + 条件培养液（细胞原代培养第7天的上清液的过滤液），进行单细胞克隆培养，传代的神经干细胞分成空白对照组、表皮生长因子组、脑源性神经生长因子组、表皮生长因子+脑源性神经生长因子组。空白对照组培养液为含体积分数0.1胎牛血清的DMEM/F12，其余3组培养液在此基础上分别加入各自对应的细胞因子培养1周，表皮生长因子浓度为20 μg/L，脑源性神经生长因子浓度为50 μg/L。③实验评估：传代后的克隆球进行神经干细胞免疫细胞化学染色鉴定。计数神经元特异性烯醇化酶阳性细胞率，检测神经干细胞向神经元的分化情况。 结果：①单细胞克隆培养后，克隆球细胞表达巢蛋白，诱导分化后神经元特异性烯醇化酶、胶质纤维酸性蛋白均呈阳性表达。②与空白对照组神经干细胞分化为神经元的比例比较，表皮生长因子组有所降低；脑源性神经生长因子组、表皮生长因子+脑源性神经生长因子组均明显提高（t=2.309~2.779，P < 0.05），且后者提高幅度尤为显著（t=2.309，P < 0.05）。 结论：表皮生长因子可以提高脑源性神经生长因子诱导成年大鼠脑海马神经干细胞向神经元分化的比例。     

脑源性神经营养因子对海马神经元NMDA受体功能下调的逆转作用

应用全细胞膜片钳技术研究BDNF对培养养海马神经元NMDA受体的调控作用。结果发现,培养18d的海马神经元NMDA诱发电流小,BDNF可快速、可逆地增加NMDA诱发电流,而培养10,14d的海马神经元NMDA诱发电流大,BDNF增强NMDA诱发电流不明显。本文结果提示BDNF对功能低下的海马神经元NMDA受体具有上调作用。     

骨髓间充质干细胞尾静脉移植脊髓损伤大鼠脑源性神经营养因子及神经生长因子的表达

背景：骨髓间充质干细胞移植对脊髓损伤有治疗作用,但其机制尚不完全清楚。 目的：应用免疫组织化学方法观察骨髓间充质干细胞静脉移植损伤脊髓局部脑源性神经营养因子及神经生长因子的表达,分析骨髓间充质干细胞移植治疗大鼠脊髓损伤的作用途径。 方法：运用改良Allen法制备T10脊髓外伤性截瘫大鼠模型,假手术组6只,脊髓损伤组24只随机分为对照组和骨髓间充质干细胞移植组。骨髓间充质干细胞移植组、假手术组接受骨髓间充质干细胞单细胞悬液1 mL(1×106 cells)自大鼠尾静脉缓慢注射移植,对照组静脉注射PBS 1 mL。 结果与结论：脊髓损伤后损伤局部的脑源性神经营养因子、神经生长因子表达增加,骨髓间充质干细胞静脉注射移植后能促进脊髓损伤局部脑源性神经营养因子、神经生长因子更进一步的表达,这可能是促进神经结构及神经功能恢复的因素之一。     

脑源性神经营养因子对海马神经元NMDA受体功能下调的逆转作用

应用全细胞膜片钳技术研究BDNF对培养海马神经元NMDA受体的调控作用.结果发现,培养18d的海马神经元NMDA诱发电流小,BDNF可快速、可逆地增加NMDA诱发电流,而培养10,14d的海马神经元NMDA诱发电流大,BDNF增强NMDA诱发电流不明显.本文结果提示BDNF对功能低下的海马神经元NMDA受体具有上调作用.     

脑苷肌肽对体外培养神经元BDNF表达的影响

目的 研究脑苷肌肽（CM1）对培养神经元脑源性神经营养因子（BDNF）的表达及其意义。方法 培养液加入一定剂量的CM1，利用免疫组织化学方法检测无血清培养神经元BDNF的表达。结果 CM1可促进神经元的生长发育，明显增加BDNF免疫阳性细胞的表达。结论 CM1在神经元生长发育中可能具有重要作用。     

嗅鞘细胞移植对脊髓慢性压迫形态和脑源性神经营养因子表达的影响

背景：嗅鞘细胞是介于星形胶质细胞和许旺细胞之间的一类特殊的胶质细胞,具有切实有效的促进神经再生修复的作用,但其相关机制还没确定。 目的：观察嗅球成鞘细胞移植对脊髓慢性压迫损伤后脊髓功能形态和脑源性神经营养因子的影响,以及嗅鞘细胞移植后脊髓慢性压迫损伤动物脊髓功能的修复。 设计、时间及地点：对照动物实验，细胞学观察，于2005-11/2007-03在上海中医药大学脊柱病研究所完成。 材料：新生SD雄性大鼠采用酶消化法培养原代大鼠嗅鞘细胞，并将其制成细胞悬液。雄性3月龄SD大鼠以螺钉持续性压迫大鼠C4脊髓建立脊髓慢性压迫动物模型。 方法：造模后大鼠分为模型组、嗅鞘细胞组、DMEM/Ham’s F-12 培养液组、正常组，每组12只。嗅鞘细胞组在距离脊髓压迫区域上下0.5 mm处选4点注射,按1μL/点脊髓内注射109 L-1嗅鞘细胞，注入速度为1μL/ min。 主要观察指标：应用光学显微镜、电子显微镜观察脊髓形态的变化，采用免疫组织化学、PT-PCR 的方法检测脊髓组织脑源性神经营养因子的分泌，以改良的Gale联合行为评分法对脊髓功能进行评定， 结果：免疫组织化学检测显示，嗅鞘细胞移植能部分改善大鼠脊髓灰质神经细胞的凋亡程度，延缓白质神经纤维的减少，促进髓鞘的修复与再生。与模型组、DMEM/Ham’s F-12 培养液组比较， 嗅鞘细胞移植治疗后脊髓组织中脑源性神经营养因子表达明显增加（P < 0.01）。与模型组、DMEM/Ham’s F-12 培养液组比较，嗅鞘细胞移植能较大程度的改善大鼠脊髓功能（P < 0.05）。 结论：嗅鞘移植能够部分改善脊髓损伤后脊髓组织的病理形态，促进脊髓组织中脑源性神经营养因子的表达，减轻脊髓慢性压迫后的功能损害。     

神经生长因子联合康复训练对脑梗死大鼠神经行为学及脑源性神经营养因子、Bax表达的影响

目的 研究神经生长因子(NGF)联合康复训练对脑梗死大鼠神经行为学及脑源性神经营养因子(BDNF)和促凋亡蛋白Bax表达的影响.方法 将72只SD大鼠随机分为对照组、NGF组、康复训练组及NGF联合康复训练治疗组(联合治疗组),每组又分为脑梗死后7d、14 d、21 d 3个亚组.采用线栓法制作脑梗死大鼠模型,NGF组制模后即予腹腔注射鼠NGF 20 μg/(kg·d);康复训练组制模后72 h给予平衡木、转棒、网屏训练;联合治疗组同时给予NGF和康复训练.各组分别于相应时间点进行神经行为学评分,采用免疫组化染色检测脑组织BDNF、Bax的表达,逆转录-PCR法检测BDNF mRNA、BaxmRNA的表达.结果 与对照组相比,NGF组、康复训练组及联合治疗组各时间点亚组的神经行为学评分均明显降低,脑组织BDNF、BDNFmRNA表达明显升高,Bax及Bax mRNA表达明显降低(均P＜0.05).与联合治疗组比较,NGF组、康复训练组各时间点亚组的神经行为学评分均明显升高,脑组织BDNF、BDNF mRNA水平明显降低,Bax、Bax mRNA表达水平明显增高(均P＜0.05).结论 NGF联合康复训练能上调BDNF、下调Bax的表达,而显著改善脑梗死大鼠的神经功能恢复.     

脑源性神经营养因子对帕金森病大鼠多巴胺能神经元的影响

目的观察脑源性神经营养因子对帕金森病(Parkinson’s disease,PD)大鼠模型黑质多巴胺能神经元的影响。方法选用Wistar种系大白鼠30只,体质量230~250g,随机分3组,通过左侧中脑黑质立体定向注射法,组1为生理盐水对照组(简称对照组)10只,注射相应量(5μL)的生理盐水;组2为注射6-OHDA制作帕金森病模型组(简称6-OHDA组)10只,注射6-OHDA,5μL(2μg/μL);组3为(6-OHDA+BDNF)组,在制成帕金森病模型后再向同侧中脑黑质注射BDNF 5μL(3μg/5μL),连续6d,1次/d。分别观察动物的旋转行为,免疫组化染色方法观察黑质酪氨酸羟化酶(tyrosine hydroxylase,TH)阳性神经元的数量,高效液相法测定纹状体部多巴胺(dopamine,DA)含量的变化。结果单侧黑质内注入6-OHDA制成帕金森病大鼠模型后,6-OHDA组与对照组比较,产生旋转行为,(6-OHDA+BDNF)组在观察旋转行为时,症状明显改善;镜下见TH阳性神经元主要见于对照组的黑质致密部,数量为(42.3±7.56)个/μm2,模型组黑质致密部TH阳性神经元数明显减少为(2.41±1.07)个/μm2,(6-OHDA+BDNF)组黑质致密部TH阳性神经元数为(15.36+3.04)个/μm2;纹状体部多巴胺含量:生理盐水组为(11.4±1.2)μg/g,6-OHDA组(3.6±0.5)μg/g,(6-OHDA+BDNF)组(5.5±0.6)μg/g。结论 BDNF能改善6-OHDA所致的帕金森病大鼠黑质多巴胺能神经元数目的减少;明显抑制6-OHDA引起的纹状体部多巴胺含量降低;并可抑制6-OHDA对黑质多巴胺能神经元的毒性作用。     

银杏叶提取物对脑缺血大鼠脑源性神经营养因子的影响

目的　观察银杏叶提取物 (GBE)对局灶脑缺血大鼠脑源性神经营养因子 (BDNF)表达的影响 ,探讨GBE与缺血损伤神经元可塑性的关系。方法　制作大鼠大脑中动脉闭塞 (MCAO)模型 ,应用免疫组化方法观察不同缺血时间 GBE治疗组及脑缺血组 BDNF阳性细胞数 ,并进行图像分析。结果　坏死灶中心区 GBE组及缺血组BDNF阳性神经元均消失 ,但在坏死灶周围区 ,两组 BDNF阳性细胞均显著增加。两组细胞形态无明显不同 ,但GBE治疗组阳性细胞数又显著高于相应缺血对照组。结论　银杏叶提取物可提高大鼠局灶脑缺血半暗带区 BDNF的表达水平 ,促进神经元的修复及重塑。     

重组腺病毒载体转导的脑源性神经生长因子在大鼠体外培养海马神经元谷氨酸损伤模型中的保护作用

近年来研究表明,脑缺血缺氧损伤机制与兴奋性氨基酸兴奋毒性、钙超载和细胞凋亡等有关。谷氨酸具有毒性损伤作用,但其是否能够引起细胞凋亡尚不确定。大量文献报道,在细胞培养液中加入谷氨酸可模拟体内兴奋性氨基酸损伤状态,但这种损伤与细胞凋亡的关系尚未完全明了。脑源性神经生长因子(BDNF)是神经营养因子之一,这类因子可促进神经元分化生长,对应激状态也有保护作用,但机制尚不完全明了。我们利用体外培养海马神经元观察谷氨酸损伤作用及其与凋亡的关系;以腺病毒为载体转导BDNF(Ad BDNF)观察BDNF蛋白表达;观察Ad BDNF对正常生长…     

脑源性神经营养因子对胎鼠神经干细胞向神经元方向分化的诱导

背景：神经元是中枢神经系统起主导功能的细胞，培养干细胞的最终目的是获得相应表型的神经元，从而促进中枢神经系统损伤的修复。但以往相关文献显示神经干细胞分化为神经元的比例不到30%。 目的：以脑源性神经营养因子作为诱导分化剂，观察其对胎鼠源性神经干细胞向神经元方向分化的作用。 设计、时间及地点：细胞学体外观察，于2006-06/2007-08在南京医科大学第一附属医院中心实验室完成。 材料：清洁级孕14~17 d的SD大鼠10只，诱导分化剂脑源性神经营养因子为Peprotech产品，胎牛血清为杭州四季青产品。 方法：孕鼠处死后取出胚胎，剪碎后机械法体外分离培养神经干细胞，锥虫蓝染色计数，调整细胞密度为2×106，添加B27及碱性成纤维细胞生长因子，置于37 ℃、体积分数为0.05的CO2恒温箱中原代培养，待细胞克隆球明显增大、中央变暗时传代扩增。将培养所得的干细胞克隆球分为2组，诱导组添加体积分数为0.01的胎牛血清+20 μg/L脑源性神经营养因子共培养，血清对照组仅添加体积分数为0.01的胎牛血清。 主要观察指标：在倒置显微镜下观察细胞生长、贴壁和分化情况。诱导分化5 d后，行神经元免疫组化鉴定，流式细胞仪检测神经元阳性细胞率。取原代培养未分化的神经干细胞及诱导分化3 d的两组细胞，RT-PCR检测内源性bHLH基因MASH-1的表达。 结果：原代培养可获得数十至数百个神经干细胞聚集在一起的神经克隆球，形态规则，立体感强；悬浮生长的克隆球经诱导分化后，逐渐失去其球状的立体外观，邻近克隆球发出的突起可相互连接，3 d后即有神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞从克隆周围出现。培养的神经干细胞呈巢蛋白阳性表达，诱导分化后呈微管相关蛋白2阳性表达。与血清对照组比较，诱导组神经元阳性细胞率显著升高（χ2=16.0，P < 0.05）。与未分化的神经干细胞比较，诱导组、血清对照组细胞MASH-1的表达均明显升高，且前者升高幅度明显强于后者（F=21.7，P < 0.05）。 结论：脑源性神经营养因子能促进神经干细胞向神经元方向分化，可能与内源性bHLH基因MASH-1的表达升高有关。     

高血压对慢性脑缺血大鼠海马和大脑皮质的脑源性神经营养因子表达的影响

目的 探讨高血压对慢性脑缺血大鼠海马及大脑皮质部位脑源性神经营养因子（Brain-derivedneurotrophic factor,BDNF）表达的影响。方法 使用正常血压的WKY大鼠以及有高血压的SHR大鼠制作双侧总颈动脉永久阻塞的慢性脑缺血模型。应用原位杂交及免疫组织化学染色观察BDNF在缺血后第1～4周的变化,H&E染色比较缺血后第4周脑梗死范围的大小。结果 慢性脑缺血后,在SHR大鼠海马CA1和大脑皮质,BDNF的mRNA及免疫染色密度在缺血后第1~4周皆有显著的减少（P <0.05）,蛋白质印迹（Western-blot）实验也呈现了相同的结果。而WKY大鼠,只在缺血后第1周有短暂的减少（P <0.05）。在第4周,HE染色显示SHR大鼠比WKY大鼠有较大范围的脑组织受损（[ 12.40±4.26）% vs（0.41±0.17）%,P =0.026]。结论 在慢性脑缺血的情况下,长期的高血压会加重脑损伤,并且影响BDNF的mRNA及蛋白质的表达,尤其在缺血耐受性低的海马CA1及大脑皮质部位。     

脑苷肌肽对体外培养神经元BDNF表达的影响

目的 研究脑苷肌肽(CM1)对培养神经元脑源性神经营养因子(BDNF)的表达及其意义.方法 培养液加入一定剂量的CM1,利用免疫组织化学方法检测无血清培养神经元BDNF的表达.结果 CM1可促进神经元的生长发育,明显增加BDNF免疫阳性细胞的表达.结论 CM1在神经元生长发育中可能具有重要作用.     

亚低温对局灶性脑缺血再灌注大鼠脑皮质神经元凋亡及存活素、脑源性神经营养因子表达的影响

目的观察亚低温干预对局灶性脑缺血再灌注大鼠脑皮质神经元凋亡及存活累(Survivin)、脑源性神经营养因子(BDNF)表达的影响,探讨Survivin、BDNF在亚低温脑保护机制中的作用。方法采用线栓法制备成年雄性SD大鼠大脑中动脉闭塞(MCAO)局灶性脑缺血再灌注改良模型,将90只大鼠随机分为假手术组、常温缺血组和亚低温缺血组,缺血组分别于缺血3h再灌注3h、6h、12h、24h、48h、72h、7d处死,亚低温缺血组于缺血后10min实施全身亚低温持续3h。进行TUNEL染色及免疫组化染色,检测梗死灶周围皮质神经元凋亡数量和Sur-vivin、BDNF的表达水平。结果 (1)亚低温缺血组和常温缺血组于再灌注6h皮质区均出现TUNEL染色阳性细胞,72h达高峰,随后逐渐减少,两组内相邻时间点比较差异均有统计学意义(P<0.05);在相同时间点亚低温缺血组凋亡细胞数明显少于常温缺血组,两组间比较差异有统计学意义(P<0.05)。(2)亚低温缺血组于再灌注3hSurvivin、BDNF表达有所增加,BDNF于24h达高峰,Survivin于48h达高峰,随后表达逐渐降低,但7d时仍高于假手术组,常温缺血组表达趋势与之相似,两组各时间点Survivin、BDNF表达均高于假手术组,差异有统计学意义(P<0.05);除再灌注3h Survivin表达在亚低温缺血组与常温缺血组间无明显差异外,其余各时间点亚低温缺血组Sur-vivin、BDNF表达均高于常温缺血组,差异有统计学意义(P<0.05)。结论亚低温干预可抑制梗死灶周围脑皮质神经细胞凋亡,促进存活素及脑源性神经营养因子的表达,发挥脑保护作用。     

脑源性神经营养因子对帕金森病大鼠黑质多巴胺能神经元的影响

目的 观察脑源性神经营养因子（Ｂｒａｉｎ ｄｅｒｉｖｅｄ－ｎｅｕｒｏｔｒｏｐｈｉｃ ｆａｃｔｏｒ,ＢＤＮＦ）对帕金森病（Ｐａｒｋｉｎｓｏｎｄｉｓｅａｓｅ,ＰＤ）大鼠模型黑质多巴胺能神经元的影响。方法将６－羟基多巴胺用立体定向法注入大鼠一侧中脑黑质制作 ＰＤ大鼠模型,并在注入６－羟基多巴胺之间每天向预伤侧壳核区定位注入ＢＤＮＦ,采用酪氨酸羟化酶免疫组化方法及透射电镜等观察ＢＤＮＦ对黑质多巴胺能神经元的显微超微结构影响。结果　ＢＤＮＦ能改善６－羟基多巴胺造成的ＰＤ大鼠黑质多巴胺能神经元数目减少及超微结构影响。结论　ＢＤＮＦ可减轻６－羟基多巴胺对黑质多巴胺能神经元的毒性作用。