实时定量PCR技术在转基因肿瘤细胞株筛选中的应用

为了探讨实时定量RTPCR技术用于筛选转基因细胞株的可行性,以转染RbAp46基因的细胞株为研究对象,利用优化的SYBRGreenI染料实时定量PCR技术检测RbAp46基因的的表达水平,并与半定量PCR及Westernblot检测结果相比较。结果表明:K562/RbAp46中RbAp46N为2064.42±253.47,KA562/CMV中RbAp46N为860.94±291.07;单克隆SHG44/RbAp46的细胞株中RbAp46N为234.46±31.08,多克隆SHG44/RbAp46的细胞株RbAp46N为18.17±5.14,SHG44/CMV为1.46±0.54。与半定量RTPCR及Westernblot检测结果比较,三者之间具有非常好的一致性。结论:实时定量RTPCR技术可以用于筛选转基因细胞株,与半定量RTPCR及Westernblot检测方法比较,具有简便、快捷、重复性好、灵敏度高且不需要后期处理等优点。     

联合转染mdrl和mcll基因短发夹RNA干扰表达质粒逆转K562/A02细胞耐药的实验研究

目的构建针对 mdrl 和 mell 基因的短发夹 RNA(shRNA)干扰表达质粒,并探讨联合转染对 K562/A02细胞耐药的逆转作用。方法根据 mdrl 和 mell 基因表达序列设计有效的 RNA 干扰片段,分别将其构建入质粒表达空载体中,以获得两种基因特异性 shRNA 干扰表达质粒;然后在脂质体介导下分别和联合转染 K562/A02细胞,用 G418和(或)Hygro B 筛选出稳定表达的细胞克隆。用RT-PCR 分析 mdrl 和 mcll mRNA 的表达;MTT 法检测阿霉素对 K562/A02细胞的半数抑制浓度(IC_(50));流式细胞术测定细胞 P-糖蛋白表达水平以及细胞凋亡率。结果成功构建两个基因的 shRNA干扰表达质粒。mdrl、mell shRNA 干扰表达质粒单独和联合转染 K562/A02细胞可有效封闭相应基因表达,联合转染组 mdrl 基因和 mell 基因的 mRNA 相对表达水平分别是未转染细胞的52%,44%。mdrl、mell shRNA 干扰表达质粒单独和联合转染后 K562/A02细胞耐药逆转率分别为63.8%,71.1%,83.1%,转染两种质粒组对 K562/A02细胞耐药逆转率最高,P 糖蛋白相对表达量由未转染组的19.70±1.15降至6.40±0.92(P<0.01),阿霉素诱导的细胞凋亡率由(1.53±0.42)%提高至(7.77±0.42)%(P<0.01)。联合转染两种质粒组和单独转染组比较,细胞对阿霉素敏感性和阿霉素诱导的细胞凋亡率差异亦有统计学意义(P<0.05)。结论转染 mdrl 或 mell 基因的 shRNA 干扰表达质粒可有效抑制相应基因表达,皆不同程度逆转 K562/A02细胞对阿霉素的耐药性;联合转染两种质粒可显著增加逆转耐药的效果。mell 基因可能与 K562/A02耐药相关。     

mdr1和GSTπ基因缄默逆转K562/A02细胞多药耐药性的研究

目的研究短发夹状小分子干扰RNA(short hairpin RNA,shRNA)对白血病多药耐药细胞株K562/A02mdr1和谷胱甘肽S-转移酶(GST)π基因的表达和功能的影响。方法根据mdr1mRNA第79~99位和GSTπmRNA第308~327位核苷酸为作用靶点,合成针对靶区域序列的shRNA,克隆入pSilencer2.1-U6neo,克隆产物为pSilence-mdr1和pSilence-GSTπ,转染K562/A02细胞株。用实时荧光定量PCR检测K562/A02细胞mdr1和GSTπmRNA的表达;MTT法检测阿霉素对K562/A02细胞半数抑制浓度(IC50)。结果经pSilence-mdr1转染后的K562/A02细胞mdr1mRNA表达量下降了71.5%,从(2.80±1.65)×108拷贝/μg RNA下降至(3.90±2.37)×107拷贝/μg RNA(P<0.01);同时pSilence-GSTπ作用后,K562/A02细胞GSTπmRNA表达量较对照组下降了39.8%,从(2.30±1.14)×105拷贝/μg RNA下降至(5.40±2.45)×104拷贝/μg RNA(P<0.01);空载体转染后阿霉素的耐药指数为23,pSilence-mdr1转染后为8,pSilence-GSTπ转染后为10,差异有统计学意义(P<0.01)。结论shRNA可有效逆转K562/A02细胞mdr1和GSTπ的多药耐药性。     

联合转染mdr1和mcl1基因短发夹RNA干扰表达质粒逆转K562/A02细胞耐药的实验研究

目的构建针对mdr1和mcl1基因的短发夹RNA(shRNA)干扰表达质粒,并探讨联合转染对K562/A02细胞耐药的逆转作用.方法根据mdr1和mcl1基因表达序列设计有效的RNA干扰片段,分别将其构建入质粒表达空载体中,以获得两种基因特异性shRNA干扰表达质粒;然后在脂质体介导下分别和联合转染K562/A02细胞,用G418和(或)Hygro B筛选出稳定表达的细胞克隆.用RT-PCR分析mdr1和mcl1 mRNA的表达;MTT法检测阿霉素对K562/A02细胞的半数抑制浓度(IC50);流式细胞术测定细胞P-糖蛋白表达水平以及细胞凋亡率.结果成功构建两个基因的shRNA干扰表达质粒.mdr1、mcl1 shRNA干扰表达质粒单独和联合转染K562/A02细胞可有效封闭相应基因表达,联合转染组mdr1基因和mcl1基因的mRNA相对表达水平分别是未转染细胞的52%,44%.mdr1、mcl1 shRNA干扰表达质粒单独和联合转染后K562/A02细胞耐药逆转率分别为63.8%,71.1%,83.1%,转染两种质粒组对K562/A02细胞耐药逆转率最高,P糖蛋白相对表达量由未转染组的19.70±1.15降至6.40±0.92(P《0.01),阿霉素诱导的细胞凋亡率由(1.53±0.42)%提高至(7.77±0.42)%(P《0.01).联合转染两种质粒组和单独转染组比较,细胞对阿霉素敏感性和阿霉素诱导的细胞凋亡率差异亦有统计学意义(P《0.05).结论转染mdr1或mcl1基因的shRNA干扰表达质粒可有效抑制相应基因表达,皆不同程度逆转K562/A02细胞对阿霉素的耐药性;联合转染两种质粒可显著增加逆转耐药的效果.mcl1基因可能与K562/A02耐药相关.     

急性白血病视网膜母细胞瘤相关蛋白46基因和蛋白表达谱的变化及意义

目的探讨急性白血病(AL)患者骨髓单个核细胞(BMMNC)视网膜母细胞瘤相关蛋白46(RbAp46)蛋白和基因表达状态,揭示RbAp46表达与AL类型及预后的可能联系。方法用Western印迹技术检测46例AL患者BMMNCRbAp46蛋白表达量;用RTPCR方法扩增22例AL患者BMMNCRbAp46mRNA的表达并进行半定量检测;用间接免疫荧光技术观察RbAp46蛋白在BMMNC的表达和分布。结果①AL患者BMMNC存在RbAp46蛋白和mRNA表达,表达强度与白血病类型无关。②肿瘤重度负荷组的AL患者BMMNC表达RbAp46蛋白的平均吸光度(A)值为93.4±37.2,明显低于肿瘤轻度负荷组的127.2±15.8(P<0.05)。③难治性白血病患者BMMNCRbAp46蛋白表达的平均A值为87.1±33.8,明显低于非难治性白血病组的126.6±21.2(P<0.05)。④肿瘤重度负荷组AL患者BMMNCRbAp46mRNA的相对表达量为0.19±0.08,明显低于肿瘤轻度负荷组的0.31±0.12(P<0.05)。⑤AL和对照组患者BMMNC均存在RbAp46蛋白的原位表达;RbAp46蛋白主要分布在细胞核中。结论AL患者BMMNC存在RbAp46蛋白和mRNA表达,该表达在肿瘤负荷重的AL和难治性白血病患者显著降低,提示RbAp46可能是白血病细胞生长的抑制基因。     

抗血管内皮生长因子发夹状核酶基因抑制白血病细胞裸鼠体内生长和肿瘤内血管生成

目的探讨抗血管内皮生长因子(VEGF)发夹状核酶基因对白血病细胞裸鼠体内生长和肿瘤内血管生成的影响。方法采用脂质体介导的方法将抗 VEGF 发夹状核酶基因真核表达载体pcDNA-RZ 转染白血病细胞系 K562,G418抗性筛选获得阳性克隆;抽提基因组 DNA,用 PCR 方法验证核酶基因已转入 K562细胞;荧光定量 PCR 和免疫印迹反应检测白血病细胞中 VEGF mRNA 和蛋白表达量的改变;将白血病细胞皮下接种 BALB/c 裸鼠,观察转染细胞在裸鼠体内成瘤及生长情况;组织形态学和免疫组织化学法检测裸鼠移植瘤微血管密度(MVD)。结果抗 VEGF 发夹状核酶基因真核表达载体 pcDNA-RZ 转入白血病细胞系 K562(K562/RZ),G418筛选两周获得阳性克隆,PCR 检测证实核酶基因整合入白血病细胞基因组 DNA;与 K562及 K562/PC 细胞(转染空质粒的 K562细胞)相比,K562/RZ 细胞 VEGF mRNA 和蛋白的表达量明显降低。接种 K562、K562/PC 和 K562/RZ 细胞组小鼠肿瘤终体积分别为(3.21±0.89)cm~3,(3.42±1.01)cm~3,(1.71±0.94)cm~3;肿瘤重量分别为(4.43±0.87)g,(3.96±0.94)g,(2.24±0.56)g;瘤体内 MVD 分别为4.70±1.25,4.67±1.31和1.80±1.55。以上各组之间的差异均有统计学意义(P<0.01)。结论转导抗 VEGF 发夹状核酶基因能减少白血病细胞中 VEGF 的合成,细胞裸鼠致瘤能力明显减弱,瘤体内血管形成能力降低。     

CD44基因沉默对K562/A02细胞逆转耐药及生物学活性的研究

本研究旨在探讨CD44基因表达抑制对白血病多药耐药细胞株K562/A02耐药性及生物学活性的影响。根据CD44基因表达序列设计有效的RNA干扰片段,将其插入质粒表达载体中,获得针对CD44mRNA的特异性siRNA真核质粒(pGCsiRNA-CD44),转染K562/A02细胞。用实时荧光定量RT-PCR检测K562/A02细胞CD44、mdr-1和bcl-2mRNA的表达;用MTT法检测阿霉素对K562/A02细胞的半数抑制浓度(IC50);流式细胞术(FACS)检测细胞周期;Hochest33258染色荧光显微镜观察细胞凋亡的形态学变化。结果表明:针对CD44基因的siRNA真核质粒可有效沉默K562/A02细胞的CD44基因:与对照组相比,转染了4条pGCsiRNA-CD44质粒的K562/A02细胞CD44表达均明显受抑,以转染了siCD44-1的细胞中抑制最强。转染pGCsiRNA-CD44质粒48小时后,K562/A02细胞CD44mRNA表达水平下降64.1%(p0.05),同时mdr-1与bcl-2mRNA的表达量较对照组分别下降了25.6%与50.8%;K562/A02细胞IC50为(17.97±1.61)μg/ml,无义序列质粒转染后阿霉素对K562/A02细胞的IC50为(16.95±1.72)μg/ml,pGCsiRNA-CD44转染后IC50明显降低为(8.77±1.63)μg/ml(p0.01)。转染48小时后,G0/G1期细胞比例提高了10.7%;细胞出现核固缩、核边集、凋亡小体等改变。结论:特异性CD44siRNA可显著抑制K562/A02细胞CD44基因的表达,抑制细胞增殖,诱导其凋亡,并有效逆转K562/A02细胞的多药耐药性。     

小檗胺对K562细胞体外及体内作用的实验研究

为了探讨小檗胺(berbamine,BER)在体外及体内抗人白血病细胞株K562细胞的作用及其可能的机制,用MTr法测定K562细胞的增殖抑制,用流式细胞术检测凋亡细胞,用RT-PCR方法检测bcr/abl基因表达,用Westem blot方法检测BCR/ABL蛋白质水平表达,利用K562细胞荷瘤裸鼠模型观察小檗胺治疗后瘤体大小、组织病理及bcr/abl基因表达的改变.结果表明小檗胺对K562细胞有明显的增殖抑制作用,呈时间-浓度依赖关系.经8.0μg/ml BER作用24、48、72小时,对K562细胞的抑制率分别为(26.63±3.57)%,(61.84±4.74)%,(75.32±1.95)%,与对照组相比,P＜0.01.IC50值(72小时)为(5.227±1.307)μg/ml.与空白对照组相比,经8.0μg/ml小檗胺处理72小时后,K562细胞凋亡率明显增加[(61.77±4.35)%vs(0.50±0.14)%,P＜0.01].小檗胺能下调K562细胞bcr/abl mRNA表达和P210水平,且呈浓度-时间依赖效应,并与细胞凋亡率有一定的相关性.经8.0μg/ml BER处理后,与同浓度点对照组相比,72小时组的表达明显地减弱(0.97±0.01vs1.38±0.02,P＜0.01).4.0-16.0μg/ml BER处理24小时后,P210的相对表达量由未加药对照组的1.04±0.02降至16.0μg/ml组的0.63±0.01(P＜0.01),与所设的对照组药物酪氨酸蛋白激酶抑制剂STI571的作用结果相似.在K562荷瘤裸鼠模型,小檗胺治疗组瘤重较未治疗对照组的明显减少[(1.46±0.43)g vs(2.90±0.94)g,P＜0.01],抑瘤率为49.66%.瘤体细胞的bcr/abl mRNA的表达水平明显下调.结论小檗胺在体外对K562细胞具有明显的增殖抑制作用及明确的诱导凋亡作用,并呈时间-浓度依赖关系;小檗胺诱导细胞凋亡可能与其下调bcr/abl基因和(或)P210的表达水平有关;在荷瘤裸鼠体内,小檗胺同样具有显著的抑制K562细胞生长的作用,尤其能下调瘤体组织细胞bcr/abl mRNA的表达水平.     

PLK1基因沉默对K562/A02细胞周期、增殖和耐药性的影响

为了探讨小干扰RNA(siRNA)对K562/A02细胞Polo样激酶1(PLK1)基因的抑制作用及其对细胞周期、细胞增殖和耐药性的影响,将构建的针对PLK1mRNA的siRNA真核质粒,导入K562/A02细胞,用RT-PCR和Western-blot方法分析PLK1基因在转染前后的表达差异;台盼蓝拒染试验检测细胞存活率;流式细胞术(FACS)检测细胞周期和细胞内阿霉素(ADM)的积累量;MTT试验检测细胞对ADM的药物敏感性。结果显示,与对照组相比,转染24和48小时后,siRNA-PLK1质粒转染组的PLK1mRNA下降(34.7±2.1)%和(56.6±1.5)%,蛋白水平下降(49.9±3.2)%和(62.1±1.7)%;转染24和48小时后,细胞存活率下降了30%和59%;转染48小时后,G2/M期细胞比例提高了2.77倍,同时细胞内ADM积累量显著提高;对ADM药物敏感性的相对率为73.8%。结论:PLK1基因沉默能有效抑制K562/A02细胞生长,使细胞周期停滞在G2/M期,同时使得细胞内ADM积累量提高,对ADM敏感性增强。     

p21WAF1抑制K562细胞生长并降低其对足叶乙甙的敏感性

目的探讨p21WAF1对白血病细胞系K562增殖及其对化疗药物足叶乙甙(Vp16)敏感性的影响.方法构建p21WAF1逆转录病毒表达载体pLXSN-p21WAF1,将pLXSN-p21WAF1和空载体pLXSN-neo通过FuGENETM6介导体外转染p21WAF1表达缺如的K562细胞,经筛选得到G418抗性K562细胞株,用RT-PCR和Western blot证明该基因在转染后的K562细胞中有表达,用锥虫蓝染色法和流式细胞术检测p21WAF1对K562细胞增殖和细胞周期的影响,用活细胞计数法和MTT法检测转染p21WAF1的K562细胞对Vp16敏感性变化.结果表达外源性p21WAF1的K562细胞生长明显慢于对照组细胞,流式细胞术检测显示G0/G1期细胞增多,活细胞计数法和MTT法显示K562-p21WAF1细胞对化疗药物Vp16的药物敏感性明显降低,Vp16对K562-neo细胞的IC50值为(56.4±6.5)μg/ml, 而对K562-p21WAF1细胞的IC50值为(131.0±8.7)μg/ml,两者相比差异有显著性(P<0.01).结论 p21WAF1能抑制K562细胞增殖,但同时降低了K562细胞对Vp16的敏感性.     

PLK1基因缄默在K562细胞凋亡中的作用

目的观察缄默PLK1基因的短发夹状RNA(short hairpin RNA,shRNA)对K562细胞内PLK1表达和细胞凋亡的影响,探讨PLK1在白血病发病中的作用,寻找更为有效的白血病治疗途径。方法设计合成针对PLK1基因1416~1436位点的shRNA片段,并将其克隆于绿色荧光蛋白的表达载体pEGFP-H1中,命名为pEGFP-H1/PLK1。通过电穿孔转染法将其导入K562细胞中,分为对照组、pEGFP-H1空载体转染组和pEGFP-H1/PLK1shRNA重组质粒转染组,转染后24,48h,分别通过RT-PCR和Western blot检测各组细胞PLK1基因和蛋白水平的变化,以MTT方法测各组细胞的增殖活性,比色法检测各组细胞的半胱天冬酶3(caspase-3)蛋白酶活性,并通过流式细胞仪检测各组细胞的凋亡和G2/M期转变情况。结果PLK1mRNA相对水平(与内参的灰度比值)对照组为1.25±0.07,空载体转染24,48h组分别为1.21±0.08和1.23±0.09,shRNA重组质粒转染24,48h组分别为0.52±0.04和0.25±0.02,shRNA重组质粒转染组较其他两组明显降低(P<0.01)。各组细胞PLK1的蛋白水平变化趋势与PLK1mRNA表达相似。相应地,对照组、空载体转染48h组、shRNA重组质粒转染24,48h组的凋亡率分别为(8.3±0.6)%、(8.7±0.7)%、(49.7±3.8)%和(82.3±6.9)%,后两者与前两组之间差异有统计学意义(P<0.05)。此外,与对照组和空载体转染组相比,shRNA重组质粒转染组的细胞增殖能力明显下降(P<0.05),且位于G2/M期的细胞较对照组和空载体转染组显著增加。以上结果均于转染后48h时较明显(P<0.05)。结论构建的shRNA能明显抑制转染细胞PLK1的表达和增殖,并可促进转染细胞的凋亡,并使停留于G2/M期的细胞显著增加。     

WAVE1基因在K562/A02白血病细胞多药耐药中的作用

目的 探讨WASP家族Verprolin同源蛋白1（WAVE1）基因在K562／A02白血病细胞多药耐药机制中的作用。方法 将pEFBOS—WAVE1真核表达质粒转染K562细胞构建WAVE1高表达的K562细胞，将WAVE1基因的特异性小片段干扰RNA（WAVE1siRNA）转染K562／A02细胞构建WAVE1低表达的K562／A02细胞。Western blot和RT-PCR法检测基因转染前后K562／A02细胞及K562细胞WAVE1基因及蛋白的表达；可溶性噻唑盐WST-8染色法检测阿霉素对转染前后细胞的半数抑制浓度（IC50）；Hoechest33258染色法检测细胞形态学改变并计算凋亡细胞百分率；RT—PCR检测多药耐药基因mdrl mRNA表达；Western blot检测Bcl-2表达。结果 ①与K562细胞相比，K562／A02细胞WAVE1 mRNA表达水平增加70％，蛋白表达水平增加63％。②转染WAVE1基因的K562细胞WAVE1过表达，并降低了对阿霉素的药物敏感性，使IC50从转染前的（0．05±0．00）μg／ml，增加到（2．99±0．12）μg／ml，在阿霉素浓度为1.5μg／ml时，凋亡细胞分别下降30％、35％。③转染WAVE1 siRNA的K562／A02细胞WAVE1蛋白表达水平与未转染组相比明显降低，并可增强对阿霉素的药物敏感性，使IC50从转染前的（4．29±0．15）μg／ml下降到（1．85±0．07）μg／ml，阿霉素浓度为1.5μg／ml时，凋亡细胞分别增加24％、21％。④转染WAVE1的K562细胞mdr1基因和Bcl-2蛋白表达水平均增高，而转染WAVE1 siRNA的K562／A02细胞mdr1基因和Bcl-2蛋白表达水平比转染前明显降低。结论 WAVE1参与了K562／A02细胞多药耐药的形成，其机制可能与调控mdr1和Bcl-2水平有关。     

稳定表达外源RbAp46基因的U937白血病细胞株的建立和初步特性分析

为建立RbAp46基因稳定转染的白血病细胞株，对悬浮培养的白血病细胞的电穿孔条件进行优化之后，运用电穿孔介导的转基因技术，在低电压、高电容的条件下将含RbAp46基因cDNA的表达质粒转染白血病细胞系U937，经G418筛选获得稳定转染的克隆，用PCR检测RbAp46基因的整合，用Western blot分析蛋白质的表达水平，然后筛选出表达外源RbAp46蛋白水平最高的亚克隆。用台盼蓝拒染法判定细胞活力，用细胞计数判定细胞生长速率。结果发现，转染RbAp46基因的U937细胞的生长速率比对照组低50％左右。结论：在白血病细胞系U937中建立了稳定表达外源RbAp46基因的细胞株，并发现过表达的外源RbAp46基因能抑制U937细胞的增殖。     

米非司酮逆转K562/A02细胞多药耐药的研究

目的研究孕激素拮抗剂米非司酮对白血病多药耐药细胞K562／A02的逆转作用及其机制。方法MTT法检测米非司酮作用72h后K562／A02细胞增殖及其对阿霉素杀伤敏感性的变化；流式细胞术检测米非司酮作用前后K562／A02细胞表面P糖蛋白的表达和细胞内柔红霉素的浓度；免疫组化法观察米非司酮作用前后K562／A02细胞凋亡相关蛋白bcl-2、Bax、caspase-3的表达；RT—PCR检测米非司酮作用后对K562／A02细胞内葡萄糖神经酰胺合成酶（GcS）mRNA表达的影响。结果2．5、5．0和10．0μmol／L米非司酮不抑制K562／A02细胞的增殖，但上述浓度的米非司酮作用后K562／A02细胞对阿霉素的敏感性较前分别增强了1．68、4．17和10．71倍。K562／A02细胞表面P糖蛋白的表达为（49．03±5．32）％，10μmol／L米非司酮作用72h后降低到（28．60±2．13）％（P〈0．01）；K562／A02细胞内柔红霉素的浓度为（61．07±8．61）％，而10μmol／L米非司酮作用后升高到（92．72±3．48）％（P〈0．01）。经10μmol／L米非司酮作用后，bcl-2蛋白表达由（56±9）％降低到（37±6）％（P〈0．05）；Bax蛋白由（40±5）％升高到（87±10）％（P〈0．01）；caspase-3蛋白则由（36±7）％升高到（89±6）％（P〈0．01）。RT—PCR结果显示K562／A02细胞GcS mRNA的表达较K562细胞明显升高，10μmol／L米非司酮能明显降低K562／A02细胞内GcS mRNA的表达。结论米非司酮可逆转白血病K562／A02细胞的多药耐药，且具有剂量依赖性。10μmol／L米非司酮能明显逆转白血病K562／A02细胞的多药耐药，其机制与降低P糖蛋白的水平，调节凋亡相关蛋白bcl-2、Bax、caspase-3的表达，降低GcS mRNA有关。     

单用A23187快速诱导K562细胞分化成树突细胞的研究

目的探索一种快速、简便、廉价而高效获取树突细胞(DC)的方法。方法通过单用A23187、A23187+GMCSF或联合细胞因子(GMCSF、IL4及TNFα)将K562细胞诱导分化为DC(K562DC),倒置显微镜下观察细胞形态并摄相,流式细胞术检测K562DC表面分子表达情况。用MTT法检测K562DC刺激异基因淋巴细胞增殖及介导T细胞杀伤靶细胞的能力。结果上述3种细胞因子组合均能诱导K562细胞向成熟DC分化,均高表达CD1a、CD80、HLADR、CD83和CD86;含A23187的两组诱导72h获得DC数量分别为(69.5±17.2)%、(73.1±13.9)%,均高于细胞因子组的诱导率[(28.5±12.3)%],也高于细胞因子组诱导7d后的诱导率[(51.2±10.7)%](P值均<0.05);诱导7d后,含A23187的两组诱导的DC低表达CD1a,分别为(8.2±2.3)%和(10.3±5.1)%,而CD83表达分别高达(85.6±8.8)%和(82.4±9.1)%,而细胞因子组CD1a和CD83表达率分别为(17.2±1.6)%和(77.4±12.9)%;3组所获得的DC在对异基因淋巴细胞的刺激增殖能力及其致敏T细胞对靶细胞的杀伤作用差异无统计学意义(P值均>0.05)。结论单用A23187可快速(72h以内)诱导K562细胞向成熟DC转化,与联合细胞因子相比,该方法所获得的DC更趋成熟从而更适用于临床免疫治疗。单用A23187快速诱导白血病细胞生成DC是一种快速、简便、廉价而高效获取DC的方法。     

WT1基因启动子和增强子在不同细胞株中的转录活性研究

本研究探讨WT1基因启动子和增强子在不同细胞株中的转录活性,为开展基于WT1基因调控的白血病基因治疗奠定基础。以EGFP做报告基因,构建含有WT1基因启动子和增强子的重组表达载体;利用脂质体和电穿孔技术将重组质粒转染13个细胞株,包括WT1基因高表达的白血病细胞株(K562、NB4、THP-1、SHI-1),WT1基因低表达的白血病细胞株(U937和Jurkat);非造血细胞株中WT1基因高表达的MCF-7、T47D、293株细胞和WT1基因低表达的ECV304、SMMC7721、HT-29、SHG44细胞株;利用流式细胞术检测转基因细胞稳定表达EGFP的平均荧光强度。以平均荧光强度代表启动子和(或)增强子的转录活性。结果表明:通过基因重组技术构建了含有WT1基因启动子的表达载体pEWP,以及含有WT1基因启动子和增强子的表达载体pEWPA。就启动子的转录活性而言,在非白血病细胞株中,ECV304细胞EGFP的平均荧光强度最高,是空载体(pEGFP-1)的16.54±2.45倍,明显高于白血病细胞株(p<0.05);MCF-7和SHG44细胞次之,分别为9.46±1.10和7.29±0.73倍,HT-29细胞表达最低,仅为0.99±0.02倍。在人类血病细胞株中,K562细胞EGFP的平均荧光强度最高,是空载体pEGFP-1的2.93±0.27倍,明显高于Jurkat和SHI-1细胞株(p<0.05)。后二者分别为0.74±0.03和0.84±0.09倍。pEWPA可以使HT-29、SHI-1和K562细胞中WT1基因启动子的转录活性增强,分别增强到4.81、3.06和1.01倍。结论:WT1基因启动子的转录活性与细胞内在WT1基因的表达水平不相关,增强子增强部分细胞株中WT1基因启动子的转录活性,但不具有造血组织特异性。