磷脂酰肌醇-3-激酶p55γ-N末端24个氨基酸对体外培养HaCaT细胞增殖的影响

目的 观察磷脂酰肌醇-3-激酶(PI3K)的调节亚单位p55γ-N末端24个氨基酸抑制人永生化角质形成细胞系HaCaT细胞增殖的作用.方法 构建含有PI3K-p55γ-N末端24个氨基酸的腺病毒载体AD-N24-GFP及对照病毒AD-GFP,感染HaCaT细胞,流式细胞仪检测细胞周期进程,应用BrdU/PI双掺入法检测其对细胞DNA合成的影响,CFDA-SE(细胞增殖示踪荧光探针)标记法检测细胞增殖情况.结果 AD-N24能有效阻滞HaCaT细胞周期进程于G 0/G 1期,S期和G 2/M期细胞减少,AD-N24-GFP组各期细胞分布为:G 0/G 1期(84.18±1.73)%,S期(7.60±1.47)%,G 2/M期(8.22±1.33)%,而AD-GFP组各期细胞分布为:G 0/G 1期(61.14±2.76)%,S期(24.54±1.29)%,G 2/M期(14.32±1.61)%,空白对照组各期细胞分布为:G 0/G 1期(65.78±2.11)%,S期(22.22±1.92)%,G 2/M期(12.00±1.19)%,AD-N24-GFP组与AD-GFP组及空白对照组间G 0/G 1期和S期细胞比例的差异有显著性意义(P ＜0.05);BrdU阳性细胞比例显示:AD-N24-GFP组R2为:(5.89±1.33)%,AD-GFP组R2为:(27.09±2.61)%,空白对照组R2为:(24.91±2.04)%,提示AD-N24能有效抑制HaCaT细胞的DNA合成;CFDA-SE检测显示AD-N24-GFP组增殖指数(PI)为:(33.60±2.52),AD-GFP组PI为:(52.47±4.41),空白对照组PI为:(55.29±7.61),提示AD-N24能有效抑制HaCaT细胞的增殖.结论 在HaCaT细胞中过表达N24能有效阻滞HaCaT细胞周期进程,干预其细胞DNA合成,抑制其细胞增殖.     

十溴联苯醚对宫颈癌细胞体外增殖的影响

目的探讨十溴联苯醚(PBDE-209)对宫颈癌HeLa细胞体外增殖的影响。方法观察HeLa细胞经不同浓度PBDE-209暴露后发生的形态学变化,并用MTT方法检测细胞存活率改变,采用免疫荧光化学方法检测细胞增殖核抗原Ki67表达变化,流式细胞术观察HeLa细胞细胞周期的分布变化。结果随着浓度升高,细胞增殖明显,细胞间隙变小。MTT方法检测发现PBDE-209促进HeLa细胞增殖,细胞增殖率的升高呈时间和浓度依赖效应,200nmol/LPBDE-209作用24、48和72h后细胞增殖率分别是阴性对照组的1.2、1.5和1.8倍(P<0.05)。Ki67表达强度随着PBDE-209浓度升高而增强。流式细胞术检测发现200nmol/LPBDE-209作用72h后,G0/G1期细胞比例下降了8%,而S期细胞比例升高了7%,与阴性对照组比较差异均有统计学意义(P<0.05)。结论低浓度PBDE-209暴露使HeLa细胞G0/G1期细胞减少,S期细胞增加,从而促进细胞增殖。     

初级纤毛及Hedgehog信号通路在银屑病角质形成细胞增殖过程中的作用

目的:探讨初级纤毛相关基因及Hedgehog(Hh)信号通路在角质形成细胞(KC)增殖过程中的作用,寻找治疗银屑病的特异性靶向治疗途径。方法:体外培养HaCaT细胞(人永生化表皮细胞系),并通过肿瘤坏死因子-α(TNF-α)诱导HaCaT细胞过度增殖,从而在体外模拟银屑病KC的增殖状态。构建纤毛生成必需基因Ift88特异性siRNA表达载体,体外转染TNF-α诱导的过度增殖HaCaT细胞,24 h后扫描电镜观察KC表面的纤毛生长情况,检测纤毛相关基因和Hh通路中Ptch-1和Gli-1的蛋白表达水平,并观察细胞的增殖情况。结果:TNF-α诱导的过度增殖的HaCaT细胞表达的初级纤毛较多,纤毛相关基因和Hh通路中Ptch-1和Gli-1均高表达。抑制Ift88基因表达能够有效减少具有初级纤毛的细胞比例,并且下调Ptch-1和Gli-1的表达,HaCaT细胞的增殖也受到明显抑制。结论:抑制纤毛的形成能够阻断Hh信号通路,从而抑制KC的过度增殖;初级纤毛可能参与了银屑病的发生,通过激活Hh信号通路促进银屑病的发生和发展。     

细胞周期素E的干扰RNA对HeLa细胞增殖的抑制作用

目的 利用RNAi技术下调宫颈癌HeLa细胞中cyclin E mRNA水平,研究对HeLa细胞增殖及周期的影响.方法 构建针对cyclin E基因的RNAi真核表达载体,脂质体转染HeLa细胞下调细胞中cyclin E mRNA含量.RT-PCR检测抑制效果;MTT检测细胞生长情况;流式细胞仪分析HeLa细胞周期变化.结果 成功构建针对cyclin E基因的RNAi真核表达载体,可以特异下调cyclin E mRNA含量,并抑制细胞恶性增殖.细胞周期分析显示干扰使细胞停留在G0～G1期,S期细胞明显减少.结论 RNAi能特异地下调HeLa细胞中cyclin E mRNA含量,抑制宫颈癌细胞恶性增殖,提示cyclin E可能成为宫颈癌基因治疗中的一个新的靶点.     

诺帝对HPV16型亚基因永生化人宫颈上皮细胞的诱导分化作用

目的 研究诺帝(Nordy)对HPV16型亚基因(E6、E7)永生化人宫颈上皮细胞(H8细胞)的诱导分化作用.方法 MTT法检测诺帝对H8细胞增殖的抑制作用,流式细胞术(FCM)分析细胞周期,免疫细胞化学S-P法检测增殖细胞核抗原Ki67的表达,TRAP-ELISA法检测端粒酶活性变化.结果 诺帝能够明显抑制H8细胞增殖;可阻滞细胞周期于G0/G1期,S期细胞减少;细胞核内Ki67蛋白的表达水平明显下降;端粒酶活性明显降低.结论 诺帝对H8细胞有诱导分化作用,这种作用可能是通过抑制增殖,阻滞细胞周期,降低端粒酶活性来实现的.     

顺铂诱导宫颈癌HeLa细胞凋亡及对FHIT,Ki67和Bax表达的影响

目的研究顺铂对人宫颈癌HeLa细胞生长的作用以及对FHIT,Bax,Ki67表达的影响,初步探讨其作用机制。方法采用MTT法测定1μg／ml,5μg／ml,10μg／ml,15μg／ml的顺铂对Helm细胞增殖的影响;流式细胞仪检测1μg／ml,5μg／ml,10μg／ml顺铂作用24h后的细胞凋亡情况;免疫细胞化学法测定用药前后FHIT,Bax,Ki67在宫颈癌HeLa细胞上的表达。结果MTT比色法表明顺铂抑制体外培养的HeLa细胞生长并且呈时效和量效关系（P〈0．05）;流式细胞术测细胞凋亡率显示不同浓度顺铂作用于HeLa细胞24h后,各组细胞亚G1峰与对照组相比差异有统计学意义（P〈0．05）;免疫组化法结果显示顺铂可以使FHIT和Bax的表达上调,而Ki67的表达则下调（P〈0．05）。结论顺铂对宫颈癌HeLa细胞体外生长具有明显抑制作用,能通过促进FHIT和Bax的表达,抑制Ki67的表达来诱导肿瘤细胞凋亡。     

CHK1 shRNA对HeLa细胞凋亡和细胞周期的影响

目的 采用RNA干扰(RNA interference, RNAi)技术沉默CHK1基因的表达,观察其对高表达CHK1的宫颈癌细胞系HeLa细胞增殖、凋亡的影响.方法 构建针对CHK1的短发夹状RNA(short hairpin RNA, shRNA)真核表达质粒,将该质粒通过脂质体转染法导入HeLa细胞,以RT-PCR和Western blot法分别检测其CHK1基因和蛋白的表达,流式细胞仪检测细胞凋亡和细胞周期的变化,MTT法检测细胞的增殖.结果 shRNA能明显降低HeLa细胞表面CHK1的表达,与对照组和空载体转染组相比, shRNA转染组HeLa细胞CHK1 mRNA水平下降了66%,蛋白水平下降了60%(P<0.05).此外,shRNA转染组的HeLa细胞凋亡率明显增加,增殖活性明显降低, 而且G2/M期细胞百分率显著下降.对照组、空载体转染组和shRNA转染组的G2/M期细胞百分率分别为(53.96±1.35)%、(54.08±1.39)%和(15.10±0.87)%(P<0.05).结论 CHK1shRNA能明显增加HeLa细胞的凋亡,抑制该细胞的增殖,削弱其G2/M期阻滞,为进一步研究CHK1在肿瘤治疗中的作用机制提供实验基础.     

P57^kip2、PCNA、Ki67在银屑病皮损中的表达

目的探讨有丝分裂抑制因子P57^kip2、增殖细胞核抗原PCNA和Ki67蛋白表达在银屑病发病机制中的作用。方法以免疫组化S-P法检测44例寻常型银屑病皮损和10例正常表皮内P57^kip2、PCNA、Kip67蛋白的表达水平。结果银屑病皮损内P57^kip2,PCNA、Kip67蛋白表达率显著高于正常对照（P〈0．05）,阳性细胞分布在角朊细胞各层,正常表皮呈阴性或仅于基底层有弱阳性表达。结论银屑病皮损内存在细胞周期调控失常,这种不正常性与银屑病角朊细胞过度增殖和不正常分化相关,在银屑病的发病机制中起一定作用。     

ATRA诱导HPV16型亚基因永生化人宫颈上皮细胞分化的实验研究

目的:研究ATRA对HPV16型亚基因(E6、E7)永生化人宫颈上皮细胞(H8细胞)的诱导分化作用及机制.方法:H8细胞经ATRA处理后,用MTT法测定ATRA的抗增殖效应,光镜、电镜观察细胞形态变化,流式细胞术(FCM)检测细胞周期,免疫组化SABC法检测增殖细胞核抗原Ki67表达水平的变化,PCR-ELISA法检测端粒酶活性变化,荧光免疫细胞化学检测HPV和E6蛋白表达变化.结果:ATRA使H8细胞增殖抑制;细胞形态朝良性方向分化;细胞堆积于G1期,S期细胞减少;细胞核内Ki67的表达水平下降;端粒酶活性下降.结论:ATRA对H8细胞有明显诱导分化作用,这种作用可能是通过抑制增殖,阻滞细胞周期,降低端粒酶活性来实现的.     

靶向siRNA对人子宫颈癌细胞的抑制作用

目的构建增殖细胞核抗原（PCNA）的小发夹结构RNA（shRNA）的真核表达载体并在人HeLa细胞表达，同时观察PCNAshRNA对HeLa细胞体外增殖及生物学特性的影响。方法将PCNAcDNA的shRNA引物插入真核表达载体pGenesil-1，构建真核表达质粒pGenesil-1-PCNA（1—4），并通过酶切和测序等方法进行鉴定，将真核表达质粒pGenesil-1-PCNA（1—4）转染HeLa细胞，运用Western blot方法检测PCNA蛋白的表达，流式细胞仪分析细胞周期变化。结果PCNAshRNA能显著抑制人HeLa细胞的生长，阻滞细胞于G0／G1期，PCNA的蛋白表达同时受到抑制。结论PCNAshRNA能显著抑制人HeLa细胞的生长，其抑制作用可能通过阻断PCNA蛋白表达实现，实验结果为进一步研究PCNAshRNA对子宫颈癌的基因治疗奠定了基础。     

银屑病患者皮损间充质干细胞对HaCaT细胞增殖的影响

目的探讨银屑病患者皮损间充质干细胞（mesenchymal stem cells,MSCs）对HaCaT细胞增殖的影响,揭示银屑病可能的免疫发病机制。方法寻常性银屑病患者8例,进行期4例,静止期4例,银屑病皮损面积和严重程度（PASI）评分范围为1．6—18．0,平均11．64。健康对照组8例,取自我院泌尿外科和整形外科手术切除的正常皮肤。分离、培养患者皮损与健康人皮肤MSCs,流式细胞术进行细胞鉴定;将第5代皮肤MSCs与HaCaT细胞共培养,并设自然增殖组,采用实时细胞分析系统进行HaCaT细胞增殖检测,培养74h后用细胞计数法检测HaCaT细胞的数量。结果倒置显微镜下,银屑病组与健康对照组皮肤MSCs的细胞形态相似,细胞表面抗原均高表达CD29、CD44、CD73、CDg0、CDl05,而CD34、CD45及HLA—DR表达阴性。皮肤MSCs可抑制HaCaT细胞的增殖（P〈0．05）,与健康对照相比,银屑病患者皮损MSCs抑制HaCaT细胞增殖的能力显著减弱[患者组细胞数为（2．35±0．254）×105,对照组细胞数为（2．04±0．122）×105,P〈0．05]。结论银屑病患者皮损MSCs抑制角质形成细胞增殖的能力减弱,这可能是银屑病的发病机制之一。     

β-catenin在硬皮病皮损中的表达及其对人表皮角质形成细胞上皮-间质转化的影响

  目的  探讨β-连环蛋白(β-catenin)在系统性硬皮病(SSc)患者皮损中的表达及其对人表皮角质形成细胞上皮-间质转化(EMT)的影响。  方法  采用免疫组织化学SP法检测45例SSc患者皮损组织及20例健康成人皮肤组织中β-catenin、Snail1、上皮性钙黏附蛋白(E-cadherin)的表达情况。采用不同质量浓度Wnt10b〔0(空白对照)、2、4 ng/mL〕处理人表皮角质形成细胞HaCaT 48 h,免疫荧光实验检测β-catenin在HaCaT细胞中的定位;实时荧光定量PCR检测HaCaT细胞中Snail1、Snail2 mRNA水平;Western blot法检测HaCaT细胞中β-catenin、波形蛋白(Vimentin)、神经性钙黏附蛋白(N-cadherin)、E-cadherin蛋白表达。  结果  β-catenin、Snail1、E-cadherin阳性率在SSc患者皮损组织中依次为100%、88.89%和2.22%,在健康成人皮肤组织中依次为0%、10.00%和95.00%,两组比较差异均有统计学意义(P < 0.05)。与空白对照组比较,不同质量浓度Wnt10b(2、4 ng/mL)处理可诱导HaCaT细胞中β-catenin表达上调并促进β-catenin由细胞质向细胞核中转位,同时还可以提高HaCaT细胞中Snail1和Snail2 mRNA表达(P < 0.05),并上调Vimentin、N-cadherin蛋白表达和下调E-cadherin蛋白表达(P < 0.05)。  结论  SSc皮损中存在异常活化的Wnt/β-catenin信号通路及异常表达的EMT相关蛋白,且激活Wnt/β-catenin信号通路可促进HaCaT细胞EMT的发生。     

以表皮干细胞与HaCaT细胞为种子细胞构建组织工程皮肤的比较研究

目的 比较人表皮干细胞(epidermal stem cells,ESCs)与人永生化角质细胞HaCaT作为种子细胞构建组织工程皮肤的差异.方法 Ⅳ型胶原快速黏附法分选表皮干细胞,无血清培养基DK-SFM培养,取第2代备用;应用DK-SFM培养HacaT细胞,取对数生长期的细胞备用;利用组织工程技术构建真皮等价物(dermal equivalent);将上述备用的两种种子细胞分别接种在真皮替代物的表面,构建组织工程皮肤,先后进行浸没培养和气-液面器官型培养,从形态学、物理特性、HE染色等方面观察比较培养物的差异.结果 以ESCs构建的组织工程皮肤收缩快,分层分化近似于正常皮肤,具有较好的张力和韧性.以HaCaT细胞构建的组织工程皮肤分层少,生长慢,张力韧性较差.两种皮肤的直径都随培养时间的增加而缩短,且在3～7 d各检测时相点间有显著性差异(P＜0.05).结论 ESCs比永生化的HaCaT细胞更适合作为种子细胞构建组织工程皮肤.     

绞股蓝总皂苷对光老化HaCaT细胞中p38MAPK蛋白和c-Jun mRNA表达的抑制作用

目的：观察绞股蓝总皂苷含药血清对光老化HaCaT细胞p38促分裂原活化蛋白激酶(p38MAPK)蛋白和Jun基因（c-Jun ）mRNA表达的影响,探讨绞股蓝总皂苷含药血清抗皮肤光老化的作用机制。方法：采用中波紫外线(UVB)照射建立光老化HaCaT细胞模型,加低、中、高剂量绞股蓝总皂苷含药血清于光老化HaCaT细胞模型培养液中培养,并设空白对照组、空白血清组和UVB模型组。采用Western blotting和RT-PCR方法检测各组细胞p38MAPK蛋白和c-Jun mRNA的表达水平。结果：与空白对照组比较,UVB模型组细胞p38MAPK蛋白和c-Jun mRNA表达显著上调,差异有统计学意义（P<0.01）;与UVB模型组比较,低、中和高剂量含药血清组细胞p38MAPK蛋白和c-Jun mRNA表达显著下调,差异有统计学意义（P<0.01）;与空白血清组比较,低、中和高剂量含药血清组细胞p38MAPK蛋白和c-Jun mRNA表达下降(P<0.01)。结论：绞股蓝总皂苷含药血清可能通过抑制p38MAPK蛋白和c-Jun mRNA表达抑制皮肤光老化。     

银屑病病人发病与皮损中角朊细胞凋亡及T细胞亚群的关系

①目的探讨银屑病的发病与皮损中角质形成细胞(角朊细胞)凋亡及T细胞亚群的关系.②方法 采用末端脱氧核苷酰转移酶(TdT)介导的d-UTP生物素缺口末端标记(TUNEL)技术、流式细胞技术,检测银屑病病人皮损中角朊细胞凋亡情况,采用免疫组织化学染色方法(SABC)检测皮损组织中T淋巴细胞亚群(CD4+、CD8+、CD25+)的原位表达情况.③结果银屑病病人皮损中角朊细胞发生凋亡的比例高于正常对照组,但病程的不同阶段角朊细胞凋亡指数(AI)不同,以进行期为最高(F＝270.06,q＝3.12、2.85,P＜0.01).银屑病病人皮损组织部位表皮及真皮CD4+、CD8、CD25+T细胞的原位表达均显著高于对照组,进行期皮损组织表皮及真皮的CD4+、CD25+T细胞的原位表达均显著高于静止期,而CD8+T细胞表皮的原位表达明显低于静止期,差异均有显著性(F＝104.20～1097.00,q＝3.06～6.21,P＜0.01).④结论角朊细胞凋亡可能是银屑病发病过程中的重要事件,T细胞亚群的改变在银屑病的皮损形成过程中有重要作用,细胞因子对角朊细胞凋亡有调节作用.     

Snail基因慢病毒载体的构建及其促进结肠癌细胞上皮间质化的研究

【目的】 构建Snail基因慢病毒载体,研究Snail基因的表达与结肠癌细胞上皮间质化的关系。【方法】 利用Gateway Technology法构建Snail基因表达质粒和空白对照质粒,行慢病毒包装,成功构建Snail基因慢病毒载体后,在结肠癌细胞系caco2中转染Snail基因质粒及空白载体对照,构建稳转细胞株caco2- Snail和caco2-vc,并在LoVo细胞中瞬时转染上述质粒,对Snail及E-钙黏蛋白(E-cadherin)的表达进行检测,并用划痕、Tanswell实验对细胞的迁移侵袭能力进行研究。【结果】 成功构建Snail基因慢病毒载体并经测序证实：在转染Snail的细胞株中有明显的Snail基因及蛋白表达,其上皮标记E-cadherin的表达比转染空载体的对照组细胞明显下调,且其迁移侵袭能力要强于对照组细胞。【结论】 Snail基因慢病毒载体在宿主细胞中表达稳定可靠,可以作为研究上皮间质化很好的工具,Snail基因有明显促进结肠癌细胞上皮间质化的作用。     

机械损伤对人皮肤角质形成细胞氧化应激和前列腺素E2分泌的影响

目的探讨机械损伤对人皮肤角质形成细胞前列腺素E2(PGE2)分泌的影响及其可能的机制。方法将体外培养的人皮肤角质形成细胞(HaCaT)分为损伤组、NADPH氧化酶(NOX)抑制剂氯化二亚苯基碘鎓(DPI)预处理组和抗氧化剂N-乙酰半胱氨酸(NAC)预处理组,三组细胞经划痕法建立体外机械损伤细胞模型,以未建模的HaCaT细胞作为对照组。于建模后不同时点收集损伤组、DPI预处理组和对照组的细胞及各组细胞的培养上清液,分别采用荧光探针技术和化学发光法测定细胞内活性氧(ROS)的生成和NOX活性,以酶联免疫吸附试验检测各组细胞培养上清液中前列腺素E2(PGE2)的质量浓度。结果建模后各时点,损伤组和DPI预处理组细胞内ROS生成和NOX活性均显著高于对照组(P<0.05或P<0.01);DPI预处理组建模后各时点细胞内ROS生成和NOX活性均显著低于损伤组(P<0.05或P<0.01)。各组细胞培养上清液中PGE2质量浓度的检测结果显示:建模后各时点,损伤组、DPI预处理组和NAC预处理组均显著高于对照组(P<0.01),DPI预处理组和NAC预处理组均显著低于损伤组(P<0.01)。结论机械损伤后人皮肤角质形成细胞...     

寻常型银屑病皮损区表皮Smurf2表达及其意义

目的探讨寻常型银屑病皮损区Smad泛素化调节因子2(Smadubiquitinationregulatoryfactor2,Smurf2)的表达及其意义。方法采用逆转录聚合酶链式反应(RTPCR)和SP免疫组化法分别检测寻常型银屑病皮损和对照正常皮肤中Smurf2的表达情况。结果RTPCR显示,寻常型银屑病皮损中Smurf2表达水平上调。与对照正常皮肤相比,寻常型银屑病皮损区表皮角质形成细胞Smurf2的免疫组化染色显著增强。结论寻常型银屑病皮损区表皮Smurf2表达增强。