反义脱氧寡核苷酸诱导HL-60细胞分化及对c-myc基因表达的影响

目的 研究二个针对c-myc基因的反义脱氧寡核苷酸（简称反义核酸）对急性白血病细胞HL－60的分化及基因表达的作用。方法 以人工合成二个硫代寡核苷酸作用于HL－60细胞后,采用流式细胞仪检测c-myc蛋白表达和HL－60细胞分化抗原,RT－PCR方法检测c-myc基因表达,并在光镜下观察以瑞特染色及NBT染色的HL－60细胞形态。结果 经反义核酸作用后,c-myc蛋白的表达有明显下降,与作用浓度与时间相关。急性白血病HL－60细胞出现中,晚幼粒细胞增多,出现CD15增高,HLA－DR及CD34降低是细胞分化的表现。同时RT－PCR分析c-myc基因扩增明显减少。结论 反义核酸对急性白血病细胞HL－60的诱导分化的同时抑制c-myc基因表达。     

HL-60细胞端粒酶活性的调控因素

目的 探讨HL－60细胞端粒酶活性的调控因素。方法 用脂质体介导法将LXSN－wt-p53逆转录病毒质粒导入人髓性白血病细胞系HL-60中,用c-myc,bcl-2基因反义脱氧寡核苷酸作用HL－60细胞,用全反式维甲酸（ATRA）诱导HL－60细胞分化后,采用TRAP－ELISA－PAGE法测定端粒酶活性,观察野生型p53基因、c-myc,bcl-2,全反式维甲酸（ATRA）对HL－60细胞端粒酶活性的影响。结果 野生型p53基因不影响HL－60细胞的端粒酶活性;bcl-2及c-myc反义寡核苷酸可下调HL－60细胞的端粒酶活性;ATRA在诱导HL－60细胞分化的同时,可使HL－60细胞的端粒酶活性降低。结论 HL－60细胞端粒酶活性受到c-myc,bcl-2,全反式维甲酸（ATRA）的调节。     

c-myc反义寡核苷酸对HL-60细胞增殖及c-myc基因表达的影响

目的：观察c-myc基因反义寡核苷酸(ASODN)对HL-60细胞增殖及c-myc基因表达的抑制作用．探讨ASODN作为药物进行白血病基因治疗的可行性、方法：应用c-myc反义寡核苷酸封闭HL-60细胞c-myc基因、RTPCR方法检测该基因表达抑制情况．流式细胞仪进行细胞周期分析,倒置显微镜观察细胞形态变化．绘制细胞生长曲线,MTT法检测细胞增殖状态。结果：c-myc基因反义寡核苷酸转染HL-60细胞后,c-myc基因表达明显受抑;S期细胞比值由55.6％降至16．7％;细胞生长受抑,增殖能力减弱,其抑制作用具有序列特异性及剂量依赖性。结论c-myc基因反义寡核苷酸对HKL-60细胞增殖及c-myc基因的表达具有明显的抑制作用,有望成为抑制白血病细胞增殖的核酸药物。     

反义核酸对人白血病HL—60细胞中c—myc基因表达的抑制

研究两个反义核酸（18mer，21mer）对人白血病HL—60细胞中c－myc基因表达的抑制作用。用HL－60活细胞计数，RNA含量的RT－PCR测定和c－myc基因蛋白的免疫组化染色检查。结果：两个反义寡核苷酸都能抑制HL－60细胞的增殖，增殖抑制率为11％～75％。反义核酸还抑制c－mycmRNA和Myc蛋白的表达，而对c－mcy基因正常表达的红白血病细胞K562的增殖和PHA刺激的人淋巴细胞的增殖没有影响。结论：反义寡核苷酸能抑制c－myc基因的过度表达。     

hTERT基因反义核酸诱导红白血病细胞凋亡的研究

目的 研究人类端粒酶反义核酸对K-562细胞增殖的影响.方法 采用脂质体介导的基因转染的方法将端粒酶反义核酸导入K-562细胞,用荧光染色观察端粒酶反义核酸诱导K-562细胞凋亡的量效和时效关系,用电镜、DNA琼脂糖凝胶电泳和流式细胞术检测细胞凋亡.结果 端粒酶反义核酸对K-562生长有抑制作用,细胞凋亡率呈剂量和时间依赖性.正义核酸元此效应.结论 端粒酶反义核酸可诱导K-562细胞凋亡,它有可能成为白血病治疗的新靶点.     

苦参促粒系造血机制及对白血病HL—60细胞的诱导凋亡作用

目的：进一步探讨苦参促粒系造血机制及新的抗白血病作用机理。方法：建立实验性环磷酰胺（Cy:0.08g/kg)低白细胞血症小鼠模型,观察苦参对粒系造血的影响和对白血病HL－60细胞的诱导凋亡作用。结果：苦参对Cy所致外周血白细胞和中性粒细胞数下降具有对抗和促恢复作用（P＜0．01）,能增加骨髓有核细胞、粒－巨噬系祖细胞（CFU－GM）数（P＜0．01）促进CFU－GM增殖并诱导其向粒系、巨噬系分化,且其促粒系造血作用与鲨肝醇一致。此外,苦参与明显诱导白血病HL－60细胞凋亡,呈药物浓度－粒应关系。结论：苦参有望用于防治化疗所致的白细胞减少及通过诱导细胞凋亡发挥其抗肿瘤作用。     

血管内皮生长因子反义核酸与高三尖杉酯碱联用对白血病细胞的增敏效应

目的　探讨血管内皮生长因子(VEGF)反义核酸与高三尖杉酯碱(homoharringtonin ,H)联用,对HL6 0和K5 6 2细胞药物敏感性的影响。方法　采用实验筛选所得的最优反义核酸(A7) ,2 0mer,全硫代修饰;以脂质体介导进行转染2 4h开始加入高三尖杉酯碱,继续培养4 8h ,共72h ,用MTT法计算细胞生长活力,求IC50 值,用ELISA法检测培养液中VEGF蛋白的浓度,用Giemsa染色观察细胞凋亡形态学改变,用流式细胞仪检测细胞凋亡百分数。结果　VEGF反义核酸可显著降低对HL6 0和K5 6 2细胞H的IC50 值,下调VEGF蛋白的表达,增加H诱导的HL6 0和K5 6 2细胞凋亡。结论　VEGF反义核酸与H联用对HL6 0和K5 6 2细胞具有增敏效应,VEGF反义核酸可增强H诱导的凋亡作用;同时反证内源VEGF蛋白具有降低HL6 0和K5 6 2细胞对H的敏感性。     

bcr3/abl2和c-myb基因反义寡核苷酸联用对慢性髓细胞白血病的作用

探讨多癌基因反义寡核苷酸对慢性髓细胞白血病的作用及其相互作用的影响。方法用台盼蓝拒染,集落形成,逆转录－多聚酶链反应及流式细胞仪技术研究反义寡核苷酸对Ｋ５６２细胞株和ＣＭＬ骨细胞的作用。结果ｃ－ｍｙｂ反义寡核苷酸通过促进ＣＭＬ,细胞凋亡,发挥对ｂｃｒ／ａｂｌ反义寡核苷酸的协同作用。结论多癌基因反义核酸的联合应用可为ＣＭＬ基因治疗提供一项新手段。     

反义bcl-2基因抗白血病作用的研究

目的 研究反义bcl-2基因抗白血病作用及其特点,探讨反义基因或联合药物体外净化和治疗白血病可行性。方法 （1）RT－PCR和蛋白印迹方法检测HL－60、U937、K562、CEM白血病细胞株以及常见白血病类型的bcl-2 mRNA和P26蛋白表达情况。（2）选择高表达bcl-2基因的HL－60细胞株作为靶细胞,用人工合成bcl-2正反义硫代寡聚脱氧核苷酸（PS－ODN）体外培养处理。检测bcl-2 mRNA和P26蛋白的变化;DNA梯形分析细胞凋亡,锥虫蓝拒染法和克隆培养观察细胞生长;同时将HL－60细胞与PS－ODN培养孵育7天后的活细胞腹腔接种Scid鼠,半巢式RT－PCR和病理分析该HL－60细胞在体内生物学行为改变。（3）建立三种白血病细胞株CEM、K562、HL－60 Scid鼠白血病模型和有效监测与追踪白血病细胞株的方法,掌握体内白血病细胞株生物学行为;用bcl-2正反义PS－ODN腹腔给药治疗HL－60 Scid鼠白血病模型,观察治疗后体内白血病进展变化。（4）用RT－PCR方法克隆bcl-2基因和构建其两种不同的反义RNA逆转录病毒表达载体。（5）转染高表达bcl-2的HL－60细胞,比较两种反义RNA在对抗bcl-2的作用与降低内源性bcl-2蛋白水平上的异同性。观察两种反义RNA介导的靶基因抑制对烷化溶血磷脂（ALP）和四种化疗药物诱导的HL－60细胞凋亡的影响。（6）RT－PCR检测基因转染HL－60在化疗药物作用下FGFβ1表达。结果 （1）白血病细胞株表达bcl-2有差异,bcl-2 mRNA和它的P26蛋白不平行。（2）三种白血病细胞株HL－60,K562,CEM可在Scid鼠增殖,产生典型白血病浸润模型特征,白血病增殖和浸润程度与白血病细胞生物特性有关,其顺序为CEM＞K562＞HL－60。（3）人工合成的bcl-2反义硫化寡脱氧核苷酸（ASPO）能够下调HL－60细胞bcl-2表达,诱导凋亡,抑制增殖和克隆形成;同时使其失去在体内的致白血病能力。（4）bcl-2反义硫代寡脱氧核苷酸,腹腔给药能够抑制肿块增长,白血病扩张,延长Scid鼠生存期,呈剂量依赖性。（5）部分编码区的反义RNA能够降低HL－60细胞内源性Bcl-2蛋白水平,提高ALP和四种化疗药物对HL－60杀伤率,促进它们诱导的HL－60细胞凋亡。（6）反义基因转染的HL－60细胞在化疗药物作用下负调控因子TGFβ1基因表达增加。结论 bcl-2反义基因可有效对抗bcl-2原癌基因表达,发挥明显的抗白血病作用,为体外净化白血病细胞和体内治疗白血病提供依据。     

脂质体介导hTERT反义寡核苷酸对HL60细胞增殖及凋亡的影响

目的 研究经脂质体介导转染端粒酶逆转录酶(hTERT)反义寡核苷酸(ASODN)对HL-60细胞增殖、凋亡的影响.方法 运用四唑盐比色(MTT)法检测HL-60细胞的增殖、Annexin VFITC/PI双标记法细胞早期凋亡流式检测法检测HL-60细胞的凋亡.结果 hTERT ASODN组(终浓度10 μmol/L)、脂质体介导hTERT ASODN组(终浓度0.5 μmol/L)均能抑制HL60细胞增殖,诱导HL-60细胞凋亡,两组比较差异无显著性.各ASODN组对HL-60的抑制作用及诱导凋亡作用均弱于阿糖胞苷(终浓度10 μmol/L)(P<0.01).结论 脂质体的介导增强了hTERT AS0DN抑制HL-60细胞增殖及诱导凋亡的作用效果.脂质体介导hTERT ASODN有可能成为化疗外治疗急性白血病的有益补充.     

中药"拮新康"对白血病细胞凋亡的影响

为探讨中药“拮新康”对白血病细胞凋亡的影响。采用形态学及DNA凝胶电泳方法观察其对白血病细胞株HL 6 0及K5 6 2细胞凋亡的影响 ,结果示 :①电镜观察可见凋亡细胞和凋亡小体 ,DNA凝胶电泳可见典型的梯形带改变 ;②一定浓度范围内的拮新康经适当作用时间后可诱导白血病HL 6 0 ,K5 6 2细胞凋亡 ,但诱导K5 6 2细胞凋亡所需时间较HL 6 0长且剂量较大。提示拮新康可诱导白血病细胞凋亡 ,与剂量和时间有一定的关系 ,为临床治疗白血病提供了实验依据。     

水蛭提取物对人白血病HL60细胞体外抑制作用研究

目的：研究水蛭提取物对人白血病HL-60细胞的体外抑制作用.方法：用液氮快速冻融法制备水蛭提取物,将不同浓度提取物作用HL-60细胞,观察提取物对HL60生长与增殖的影响、诱导调亡效应、并计算出水蛭提取物作用HL-60的半数抑制浓度（IC50）.结果：浓度高于0.1mg/mL的水蛭提取物对HL60有抑制作用,且呈时间和剂量依赖性;水蛭提取物作用HL60细胞48h的IC50为1.4mg/mL;另外水蛭提取物也具有诱导HL60细胞凋亡作用.结论：水蛭提取物可抑制HL60细胞增殖并诱导调亡.     

Experimental study on induction of apoptosis of leukemic cells by Boswellia carterii Birdw extractive]

The purpose of the study was to investigate the apoptosis of leukemic cells induced by Boswellia Carterii Birdw(BCB). The target leukemia cell line HL60 and bone marrow leukemic cells from 30 acute non-lymphocytic leukemic(ANLL) patients (3 M1 11 M2a 10 M3 1 M4a 5 M5b) were studied. Apoptosis was detected by morphological observation, DNA electrophoresis, percentage of DNA fragmentation test and flow cytometric cell cycle analysis. It is concluded that BCB can induce apoptosis in ANLL cells and HL60 cells.     

乳香提取物诱导急性非淋巴细胞性白血病细胞凋亡的实验研究

目的：研究乳香提取物诱导急性非淋巴细胞性白血病细胞凋亡作用。方法：应用形态学观察、ＤＮＡ电泳、ＤＮＡ片段百分率、流式细胞仪分析检测白血病细胞凋亡。结果：乳香提取物能诱导急性非淋巴性白血病细胞凋亡。结论：乳香提取物具有诱导急非淋白血病细胞凋亡作用     

Wilms肿瘤基因反义寡苷酸对白血病细胞凋亡的影响

目的 了解Ｗｉｌｍｓ肿瘤基因（ＷＴ１）反义寡核苷酸（ＡＳＯ）对白血病细胞凋亡的作用。方法 应用ＷＴ１ＡＳＯ以及足叶乙甙（ＶＰ－１６）作用Ｋ５６２、ＨＬ－６０细胞系,然后应用流式细胞仪测定ＤＮＡ含量以确定白血病细胞的凋亡数。结果 Ｋ５６２细胞系经ＷＴ１ ＡＳＯ作用２４ｈ和６０ｈ后细胞凋亡数分别为１４．６％和２６．８％;而ＷＴ１有义寡核苷酸（ＳＯ）组分别为３．１％（２４ｈ）和３．９％（６０ｈ）;加入少     

槲皮素对NB4,HL—60细胞形态、PML mRNA及蛋白表达的影响

目的 探讨槲皮素对NB4,HL-60细胞的形态、PML mRNA及蛋白的表达影响。方法 以NB4,HL-60细胞为研究对象,细胞形态学观察采用Wright′s染色法及荧光染色法;PML蛋白细胞内分布定位采用免疫荧光技术;PML mRNA表达采用RT-PCR法。结果 1）经槲皮素处理后,各组细胞形态学上均出现凋亡特征性改变。2）槲皮素处理后NB4细胞内融合蛋白降解,PML聚积于POD结构,随后降解;在HL-60细胞,PML发生相似改变。3）槲皮素处理后各组细胞PML mRNA表达均无显著影响。结论 在槲皮素诱导下,PML在蛋白水平参与诱导白血病细胞凋亡机制;槲皮素能诱导,NB4,HL-60细胞凋亡,抑制白血病细胞生长。     

急性白血病骨髓基质细胞对HL-60细胞增殖、分化的影响

目的 为探讨急性白血病骨髓基质对HL-60细胞的影响。方法 骨髓基质与白血病细胞共培养，采用MTT检测基质对白血病细胞的粘附，流式细胞仪检测粘附的HL-60细胞周期，非特异性酯酶及过氧化物酶染色观察白血病细胞分化及绘制白血病细胞生长曲线。结果 白血病骨髓基质对HL-60细胞的粘附率及粘附的白血病细胞处于G0／G1期比例均明显高于正常骨髓基质；正常骨髓基质对HL-60细胞的生长抑制作用及诱导分化作用均明显强于白血病基质。结论 急性白血病骨髓基质对HL-60细胞的增殖、分化作用均存在异常。     

灵芝复方诱导HL-60白血病细胞凋亡的研究

应用体外集落与液体培养、细胞形态学观察、ＤＮＡ片段凝胶电泳及ＤＮＡ片百分率测定等方法观察灵芝复方对人骨髓ＣＦＵ－ＧＭ生长及ＨＬ－６０细胞增殖和凋亡的作用。发现灵芝复方在一定浓度范围内对人骨髓ＣＦＵ－ＧＭ生长有促进作用，而对白血病系ＨＬ－６０细胞集落生长则表现了剂量依赖性抑制；细胞形态学经为芝复方对ＨＬ－６０细胞凋亡具有剂量和时间依赖性诱导作用。８和１６ｍｇ／ｍｌ灵芝复方作用４８ｈ，可使ＨＬ－６０细     

依维莫司和LBH589对耐药急性髓系白血病细胞增殖、凋亡及多药耐药相关蛋白表达的影响

目的 探讨雷帕霉素衍生物依维莫司(RAD001)或联合组蛋白去乙酰化酶抑制剂LBH589对耐药急性髓系白血病细胞株HL-60/ADM细胞增殖、凋亡和逆转耐药的影响.方法 采用不同浓度RAD001或联合LBH589处理HL-60/ADM细胞,四甲基偶氮唑盐(MTT)法检测细胞增殖活力,Hoechst33342染色法和AnnexinV-FITC/PI染色流式细胞仪检测细胞凋亡、阿霉素摄取率和多药耐药相关蛋白1(MRP1)表达评估逆转耐药效应.进一步检测处理前后细胞信号通路蛋白变化,探讨其机制.结果 10～50 μmol/L RAD001均能够抑制HL-60/ADM细胞增殖、诱导凋亡,在作用48和72 h时30 μmol/L药物浓度达到最大抑制效果,进一步增加药物浓度细胞增殖抑制率并没有明显增加(P＜0.05).不同浓度RAD001和LBH589联合处理HL-60/ADM细胞,没有明显的协同抑制增殖作用[协同指数(CI)≥1.0].10 μmol/LRAD001处理HL-60/ADM细胞可以明显下调细胞表面MRP1表达(93.90%±4.20%比79.10%±3.28%,P＜0.05),提高HL-60/ADM细胞阿霉索蓄积率(8.53%±0.68%比15.37%±1.46%,P＜0.01).深入机制研究表明,RAD001可以阻断PI3K/AKT/mTOR信号通路活性,通过上调P53抑制MRP1蛋白的活性.结论 RAD001与LBH589联合没有协同抑制HL-60/ADM细胞增殖作用.但RAD001单药能够有效抑制HL-60/ADM细胞增殖,诱导凋亡,通过阻断PI3K/AKT/mTOR信号通路抑制细胞MRP1蛋白的表达,提高细胞阿霉素摄取率而逆转耐药.

Abstract：

Objective To investigate the effects of everolimus ( RAD001 ) or plus panobinostat (LBH589) on the proliferation, apoptosis and drug resistance in chemoresistant acute myeloid leukemic cells.Methods HL-60/ADM cells were treated with RAD001 alone or with LBH589.Proliferation and apoptosis were evaluated by 3-( 4, 5 ) -dimethylthiahiazo ( -z-y1 )-3, 5-di-phenytetrazoliumromide ( MTT )assay, Hoechst33342 and AnnexinV-FTTC/PI stain.The altered expressions of multidrug resistance-associated protein 1 ( MRP1 ) and intercellular adriamycin accumulation were analyzed by flow cytometry.The change in protein level was analyzed by Western blot.Results Effective proliferative inhibition and apoptotic induction in HL60/ADM cells were observed in the treatment of 10 -50 μmol/L RAD001.The maximal effect was shown for the concentration of 30 μmol/L RAD001 at 48 and 72 hours.The inhibition ratio remained unchanged with the adjustment of drug doses (P ＜0.05).Moreover, there was no synergistic effects in the treatment with different concentration of RAD001 and LBH589 (CI ≥ 1.0).A down-regulation of MRP1 (93.9% ±4.2% vs 79.10% ± 3.28% ) and an up-regulation of adriamycin ( 8.53% ± 0.68% vs 15.37% ± 1.46% ) were induced by the treatment with 10 μmol/L RAD001 ( both P ＜ 0.01 ).RAD001 inhibited the p53-dependent expression of MRP1 via an inhibition of phosphoinositide 3-kinase (PI3K)/AKT/mTOR signaling pathway.Conclusion The combined treatment of RAD001 and LBH589 has no synergistically inhibitory effect on HL60/ADM cells.But the sole treatment of RAD001 may inhibit proliferation, induce apoptosis and accumulate intercellular adriamycin through a down-regulated expression of MRP1 in HL60/ADM cells via an inhibition of PI3K/AKT/mTOR signaling pathway.     

细胞因子调节脐血CD3AK细胞诱导HL-60细胞凋亡

目的 :探讨重组肿瘤坏死因子α(rhTNF α,TNF α)、重组粒细胞集落刺激因子 (rhG CSF ,G CSF)对脐血CD3AK细胞诱导HL 6 0细胞凋亡的影响。方法 :用细胞形态学观察 ,DNA琼脂糖电泳 ,原位末端标记法检测HL 6 0 ,CD3AK细胞诱导的HL 6 0 ,TNF α诱导的HL 6 0 ,CD3AK与TNF α共同诱导的HL 6 0 ,CD3AK与G CSF共同诱导的HL 6 0进行检查分析。结果 :HL 6 0自然凋亡率 (4.6 0± 1.71) % ,;CD3AK细胞诱导的HL 6 0凋亡率 (15 .6 0±3.2 1) % ;TNF α(5ng/ml)诱导的HL 6 0的凋亡率 (5 .2 0± 2 .0 7) % ;CD3AK与TNF α共同诱导的HL 6 0凋亡率 (36 .70± 4 .4 0 ) % (F =94 ,P <0 .0 1)。CD3AK与G CSF共同诱导的HL 6 0凋亡率 (4.88± 2 .2 3) % (F =5 8,P <0 .0 1)。结论 :TNF α协同CD3AK细胞诱导HL 6 0凋亡 ;G CSF抑制CD3AK细胞诱导HL 6 0凋亡。