人骨形态发生蛋白质7基因转染兔骨髓基质干细胞向成骨细胞的分化

背景：骨形态发生蛋白质是目前发现惟一的一类具有成骨能力的细胞因子，它能刺激基质干细胞向成软骨细胞和成骨细胞方向分化。目的：应用基因工程方法，观察人骨形态发生蛋白质7基因转染兔骨髓基质干细胞向成骨细胞的定向分化。设计：单一样本观察。 单位：中山大学附属第一医院骨科。材料：pcDNA1．1／AMP-hBMP7质粒。 方法：实验于2004-05／2005-03在中山大学附属第一医院外科实验室完成。全骨髓培养法培养兔骨髓基质干细胞，在体外分别转染poD．NA1．1／AMP-hBMP7和pcDNA1．1／AMP并留置空白对照。检测转染基因的转录和表达，观察细胞形态和生长情况，通过对感染细胞的碱性磷酸酶染色、钙盐染色、电镜观察胞质中钙质成分以及检测骨钙素鉴定其成骨分化表型。 主要观察指标：①兔骨髓基质干细胞的形态及生长。②表达产物的鉴定。③碱性磷酸酶染色（钙钴法）结果。④茜素红染色结果。⑤透射电镜观察结果。⑥扫描电镜观察结果。⑦骨钙素的测定结果。 结果：人骨形态发生蛋白质7基因存在于转染后的骨髓基质干细胞中并表达相应的mRNA。目的基因表达后的细胞形态略有变化，但生长曲线与未转染组无明显变化。骨钙素表达较未转染组明显增强。转染组细胞的碱性磷酸酶染色和钙盐染色均为阳性。 结论：人骨形态发生蛋白质7基因转染可促进兔骨髓基质干细胞向成骨细胞表型分化。     

人骨形态发生蛋白7基因转染对骨髓间充质干细胞增殖及成骨分化性能的影响

背景:骨组织工程中一个重要的研究内容就是如何保持并提高成骨细胞的体内外成骨能力,采用基因转移技术有可能为此问题的解决提供一种新的有效方法.目的:探讨逆转录病毒介导的人骨形态发生蛋白7基因转染对兔骨髓间充质干细胞增殖和向成骨细胞分化的影响.设计:以细胞为研究对象,分组对照,重复观察测量.对象:实验2001-07/2003-07在南方医科大学附属南方医院创伤骨科实验室完成.新西兰大白兔4只由第一军医大学动物实验中心提供,雌雄不拘,体质量1.0～1.5 kg.方法:构建人骨形态发生蛋白7逆转录病毒载体,使用含目的基因的病毒液感染骨髓间充质干细胞,免疫组织化学方法检测人骨形态发生蛋白7蛋白的表达.四甲基偶氮唑盐法检测细胞增殖能力,使用流式细胞仪检测细胞周期,NPP法检测碱性磷酸酶合成情况.主要观察指标:主要结局:①细胞增殖检测结果.②碱性磷酸酶检测结果.次要结局:①转染骨髓间充质干细胞中人骨形态发生蛋白7蛋白的表达.②细胞周期检测结果.结果:经骨形态发生蛋白7基因转染的兔骨髓间充质干细胞免疫组织化学检测显示有人骨形态发生蛋白7的阳性表达.经人骨形态发生蛋白7基因转染的兔骨髓间充质干细胞增殖能力无明显改变(P＞0.05).经转染的骨髓间充质干细胞碱性磷酸酶合成(294.592&;#177;86.567)nkat/L与转染空载体(155.231&;#177;86.567)nkat/L、未转染的骨髓间充质干细胞(160.866&;#177;91.585)nkat/L相比较差异有显著性意义(F=5.660,P＜0.05).结论:经骨形态发生蛋白7基因转染的骨髓间充质干细胞能够合成表达外源骨形态发生蛋白7,人骨形态发生蛋白7基因转染能够促进体外培养的骨髓间充质干细胞向成骨细胞转化,可用于以骨髓间充质干细胞为种子细胞的组织工程化骨组织的构建和进一步应用.     

人骨形态发生蛋白7基因转染对骨髓间充质干细胞增殖及成骨分化性能的影响

背景骨组织工程中一个重要的研究内容就是如何保持并提高成骨细胞的体内外成骨能力,采用基因转移技术有可能为此问题的解决提供一种新的有效方法.目的探讨逆转录病毒介导的人骨形态发生蛋白7基因转染对兔骨髓间充质干细胞增殖和向成骨细胞分化的影响.设计以细胞为研究对象,分组对照,重复观察测量.对象实验2001-07/2003-07在南方医科大学附属南方医院创伤骨科实验室完成.新西兰大白兔4只由第一军医大学动物实验中心提供,雌雄不拘,体质量1.0～1.5 kg.方法构建人骨形态发生蛋白7逆转录病毒载体,使用含目的基因的病毒液感染骨髓间充质干细胞,免疫组织化学方法检测人骨形态发生蛋白7蛋白的表达.四甲基偶氮唑盐法检测细胞增殖能力,使用流式细胞仪检测细胞周期,NPP法检测碱性磷酸酶合成情况.主要观察指标主要结局①细胞增殖检测结果.②碱性磷酸酶检测结果.次要结局①转染骨髓间充质干细胞中人骨形态发生蛋白7蛋白的表达.②细胞周期检测结果.结果经骨形态发生蛋白7基因转染的兔骨髓间充质干细胞免疫组织化学检测显示有人骨形态发生蛋白7的阳性表达.经人骨形态发生蛋白7基因转染的兔骨髓间充质干细胞增殖能力无明显改变(P＞0.05).经转染的骨髓间充质干细胞碱性磷酸酶合成(294.592±86.567)nkat/L与转染空载体(155.231±86.567)nkat/L、未转染的骨髓间充质干细胞(160.866±91.585)nkat/L相比较差异有显著性意义(F=5.660,P＜0.05).结论经骨形态发生蛋白7基因转染的骨髓间充质干细胞能够合成表达外源骨形态发生蛋白7,人骨形态发生蛋白7基因转染能够促进体外培养的骨髓间充质干细胞向成骨细胞转化,可用于以骨髓间充质干细胞为种子细胞的组织工程化骨组织的构建和进一步应用.     

外源性人骨形态发生蛋白-2基因在兔骨髓基质细胞中的稳定表达及其诱导成骨作用

目的：通过观察携带外源性人骨形态发生蛋白-2(human bone morphorgenetic protein-2，hBMP-2)基因的骨髓基质细胞(bone marrow stromal cells，MSCs)生物学性状变化和检测MSC分泌hBMP-2的含量，探讨hBMP-2基因在MSC中的稳定表达。方法：应用脂质体介导的方法将携带hBMP-2基因的重组载体PcD-NA3-hBMP2导人体外培养的兔MSC中，用G418筛选获得阳性细胞，应用ELISA检测MSC表达并分泌hBMP-2水平，并绘制细胞的生长曲线。     

构建人骨形态发生蛋白2及血管内皮生长因子165基因共表达重组腺病毒在兔骨髓基质干细胞中的表达

目的：构建人骨形态发生蛋白2及血管内皮生长因子基因共表达腺病毒并观察其在兔骨髓基质干细胞中的表达。 方法：实验于2005-03／12在解放军第四军医大学唐都医院全军骨肿瘤研究所完成。①分别克隆人骨形态发生蛋白2及血管内皮生长因子基因，分别依次亚克隆至穿梭载体构建重组穿梭质粒pAdT-B2V并酶切鉴定；后经PmeI酶切线性化后与骨架质粒感受态细胞AdEasier-1 Cells经电穿孔法同源重组得到腺病毒质粒pAdBMP-7并酶切鉴定。②PacI酶切线性化后的pAdBMP-7腺病毒质粒转染293细胞包装后获得复制缺陷型重组腺病毒AdBMP-7，在荧光显微镜下计算表达绿色荧光蛋白细胞个数，测定AdB2V滴度。③将AdBMP-7体外感染兔骨髓基质干细胞后，以荧光显微镜观察绿色荧光蛋白表达及反转录-聚合酶链反应方法鉴定外源基因的表达，以B-肌动蛋白为内参照，未感染细胞为对照。④AdB2V感染兔骨髓基质干细胞后72h以免疫细胞化学染色方法检测外源基因的表达，以未感染组为对照。 结果：①酶切鉴定表明外源基因已插入到pAdTrack—CMV穿梭质粒且腺病毒重组质粒pAdBMP-7构建成功。②经293细胞包装3d后可观察到绿色荧光蛋白表达，氯化铯梯度离心法最终获得约3&;#215;10^9 efu／L滴度的重组腺病毒。③体外感染兔骨髓基质干细胞后荧光显微镜观察及反转录-聚合酶链反应证实外源基因可在兔骨髓基质干细胞中表达，未感染组为阴性。④AdB2V感染兔骨髓基质干细胞后以免疫细胞化学染色均观察到外源基因的阳性表达，未感染组呈阴性表达。 结论：成功构建人骨形态发生蛋白2及血管内皮生长因子165基因共表达重组腺病毒，证实了其在兔骨髓基质干细胞的表达，为骨再生的局部联和基因治疗打下基础。     

外源性人骨形态发生蛋白-2基因在兔骨髓基质细胞中的稳定表达及其诱导成骨作用

目的:通过观察携带外源性人骨形态发生蛋白-2(humanbonemor-phorgeneticprotein-2,hBMP-2)基因的骨髓基质细胞(bonemarrowstromalcells,MSCs)生物学性状变化和检测MSC分泌hBMP-2的含量,探讨hBMP-2基因在MSC中的稳定表达。方法:应用脂质体介导的方法将携带hBMP-2基因的重组载体PcD-NA3-hBMP2导入体外培养的兔MSC中,用G418筛选获得阳性细胞,应用ELISA检测MSC表达并分泌hBMP-2水平,并绘制细胞的生长曲线。结果:从细胞的培养基中可检测到hBMP-2蛋白质。转染后阳性细胞的倍增时间和生长时间没有因为目的基因的导入而改变,与正常培养的细胞相比差异无显著性意义。结论:hBMP-2基因在MSC中可获得较高水平的稳定表达并能分泌hBMP-2蛋白质,为骨缺损修复中内源性hBMP-2作用的发挥提供可能。     

骨髓基质细胞作为人骨形态发生蛋白-2基因受体细胞的可行性研究

目的:通过检测hBMP-2基因在受体细胞中瞬时表达水平,探讨骨髓基质细胞作为hBMP-2基因受体细胞的可行性。方法:应用脂质体介导的方法将携带hBMP-2基因的重组载体PcDNA3-hBMP-2导入体外培养的骨髓基质细胞中,分别应用原位技术和酶联免疫吸附方法检测目的基因在受体细胞内mRNA和蛋白质的存在与表达状况。结果:在mRNA水平,可检测到hBMP-2基因在阳性细胞进行了转录;在蛋白质水平,从细胞的培养基中可检测到hBMP-2蛋白质。结论:骨髓基质细胞可以作为hBMP-2基因的受体细胞,基因表达可分泌hBMP-2蛋白质。     

构建人骨形态发生蛋白2及血管内皮生长因子165基因共表达重组腺病毒在兔骨髓基质干细胞中的表达

目的:构建人骨形态发生蛋白2及血管内皮生长因子基因共表达腺病毒并观察其在兔骨髓基质干细胞中的表达。方法:实验于2005-03/12在解放军第四军医大学唐都医院全军骨肿瘤研究所完成。①分别克隆人骨形态发生蛋白2及血管内皮生长因子基因,分别依次亚克隆至穿梭载体构建重组穿梭质粒pAdT-B2V并酶切鉴定;后经PmeI酶切线性化后与骨架质粒感受态细胞AdEasier-1Cells经电穿孔法同源重组得到腺病毒质粒pAdBMP-7并酶切鉴定。②PacI酶切线性化后的pAdBMP-7腺病毒质粒转染293细胞包装后获得复制缺陷型重组腺病毒AdBMP-7,在荧光显微镜下计算表达绿色荧光蛋白细胞个数,测定AdB2V滴度。③将AdBMP-7体外感染兔骨髓基质干细胞后,以荧光显微镜观察绿色荧光蛋白表达及反转录-聚合酶链反应方法鉴定外源基因的表达,以β-肌动蛋白为内参照,未感染细胞为对照。④AdB2V感染兔骨髓基质干细胞后72h以免疫细胞化学染色方法检测外源基因的表达,以未感染组为对照。结果:①酶切鉴定表明外源基因已插入到pAdTrack-CMV穿梭质粒且腺病毒重组质粒pAdBMP-7构建成功。②经293细胞包装3d后可观察到绿色荧光蛋白表达,氯化铯梯度离心法最终获得约3×109efu/L滴度的重组腺病毒。③体外感染兔骨髓基质干细胞后荧光显微镜观察及反转录-聚合酶链反应证实外源基因可在兔骨髓基质干细胞中表达,未感染组为阴性。④AdB2V感染兔骨髓基质干细胞后以免疫细胞化学染色均观察到外源基因的阳性表达,未感染组呈阴性表达。结论:成功构建人骨形态发生蛋白2及血管内皮生长因子165基因共表达重组腺病毒,证实了其在兔骨髓基质干细胞的表达,为骨再生的局部联和基因治疗打下基础。     

反转录病毒介导人骨形态发生蛋白2基因修饰骨髓基质细胞的体内成骨效应

目的:构建人骨形态发生蛋白2反转录病毒表达载体,探讨以转人骨形态发生蛋白2基因骨髓基质细胞为种子细胞的组织工程骨修复骨缺损的可行性。方法:实验于2001-05/2003-01在北京大学医学部完成。①采用DNA重组技术,将骨形态发生蛋白2cDNA克隆到pLXSN反转录病毒质粒,经酶切及测序鉴定正确后,包装成为pLXSN/BMP2重组反转录病毒。取15d龄BALB/c系小鼠5只用于骨髓基质细胞的提取。将重组病毒感染小鼠骨髓基质细胞,经筛选后,聚合酶链反应鉴定人骨形态发生蛋白2cDNA在转基因骨髓基质细胞中的整合情况。②转基因骨髓基质细胞的骨形态发生蛋白2表达情况采用免疫印渍杂交和核糖核酸印渍杂交技术检测。转基因骨髓基质细胞碱性磷酸酶的表达采用钙-钴法染色检测,用以评定表达骨形态发生蛋白2的生物活性。③取6周龄BALB/c小鼠6只,将转基因骨髓基质细胞与羟基磷灰石构建人工骨植于小鼠骨骼肌内,体内成骨情况予组织学观察评估。结果:①pLXSN/BMP2质粒的鉴定结果:经酶切及DNA测序证实重组pLXSN/BMP2序列正确。②重组病毒的滴度测定结果:包装的病毒滴度为(6～8)×105cfu/mL。③基因整合及表达的分析:聚合酶链反应证实转基因骨髓基质细胞基因组中有骨形态发生蛋白2cDNA整合;核糖核酸印渍杂交和蛋白免疫印渍杂交证实转基因骨髓基质细胞稳定表达人骨形态发生蛋白2;钙-钴法染色证实转基因骨髓基质细胞碱性磷酸酶阳性。④小鼠体内成骨情况:甲苯胺蓝染色的组织切片镜下观察显示转骨形态发生蛋白2基因骨髓基质细胞构成人工骨可见少量软骨细胞及软骨基质存在,软骨细胞呈巢状分布。结论:成功地构建了pLXSN-BMP2重组反转录病毒载体,该载体不仅有效地表达骨形态发生蛋白2蛋白,表达的骨形态发生蛋白2能够诱导未分化的骨髓基质细胞向成骨细胞方向分化,且在体内肌肉环境下能促进成骨。     

转染hBMP-2基因的骨髓基质细胞与生物活性陶瓷复合材料异位成骨能力观察

目的：观察转染了hBMP-2基因的兔骨髓基质细胞(bone marrow stromal cells，MSC)与生物活性陶瓷(bioactive glass ceramicsics，BGC)复合后植入兔股部肌袋中生物复合材料的异位成骨能力。方法：实验时间为2003—07／2004—05。实验地点为锦州医学院解剖学骨组织工程研究所。应用脂质体介导的方法将携带hBMP-2基因的重组载体PcDNA3-hBMP2导人体外培养的MSC中，用G418筛选获得阳性细胞，应用ELISA检测hBMP-2基因在MSC内蛋白质水平的存在与表达状况；将携带hBMP-2基因的MSC与BGC复合并植入兔股部肌袋内，术后4周行组织学检察。结果：用ELISA方法从实验组细胞的培养基中可检测到约54ng的hBMP-2蛋白质。携带hBMP-2基因的MSC与BGC具有良好的生物相容性．且具有异位成骨能力。结论：MSC可以作为hBMP-2基因的受体细胞，基因表达可分泌hBMP-2蛋白质，与BGC复合后具有异位成骨能力．认为转染了hBMP-2基因的MSC可作为骨组织工程学中的种子细胞。     

骨形态发生蛋白2和音猬因子体外诱导骨髓间充质干细胞向成骨细胞的分化

背景:研究表明,骨形态发生蛋白2和音猬因子联合诱导干细胞的定向分化存在理论上的可能性,但目前联合诱导间充质干细胞的方向纷繁复杂,且众说纷纭.目的:观察骨形态发生蛋白2和音猬因子在体外联合和单独应用促进骨髓间充质干细胞向成骨细胞分化的能力.设计、时间及地点:随机分组设计,对比观察,于2008-12在江苏大学临床医学院实验室完成.材料:6周龄SPF级SD大鼠10只,体质量140～160 g,雌雄不拘,用于间充质干细胞的获得、培养和传代.重组人骨形态发生蛋白2、音猬因子为PeproTech公司产品.方法:将SD大鼠的间充质干细胞分离培养后分为4组:重组人骨形态发生蛋白2组:加入100 mg/L重组人骨形态发生蛋白2:音猬因子组:加入20 μg/L音猬因子:联合组:100 mg/L重组人骨形态发生蛋白2联合20 μg/L音猬因子作用于SD大鼠间充质干细胞:对照组:不加任何干预措施.主要观察指标:倒置相差显微镜观察细胞形态学的变化;MTT法检测细胞培养第3,6,9,12天细胞增殖数和细胞碱性磷酸酶活性;以及成骨细胞表型的检测和Ⅰ型胶原蛋白免疫印迹分析,以比较各组诱导成骨能力的差异.结果:①间充质干细胞培养24 h后部分贴壁,贴壁细胞呈圆形或椭圆形,第7天左右细胞铺满瓶底,多为梭形.条件培养基培养3 d后,联合组细胞由长梭形转变为多角形.随后重组人骨形态发生蛋白2组细胞发生成骨样改变,音猬因子组细胞未见明显形态学改变.②相同时间点联合组、重组人骨形态发生蛋白2组、音猬因子组细胞吸光度均高于对照组(P<0.05).联合组和重组人骨形态发生蛋白2组在各时间点碱性磷酸酶表达量均高于音猬因子组和对照组(P<0.05).③间充质干细胞经诱导培养7 d后,碱性磷酸酶细胞化学染色联合组和重组人骨形态发生蛋白2组呈阳性,联合组可见胞质中棕黄色颗粒,音猬因子组和对照组阴性.诱导培养14 d后,Ⅰ型胶原免疫荧光染色音猬因子组和对照组均为阴性,联合组和重组入骨形态发生蛋白2组为阳性,但联合组细胞数量明显增多,细胞间融合较好,重组人骨形态发生蛋白2组细胞融合欠佳.矿化沉积茜素红染色音猬因子组和对照组仍为阴性,联合组和重组人骨形态发生蛋白2组为阳性,联合组细胞间可见红色的钙结节.④蛋白免疫印迹分析显示,与对照组相比,联合组和重组人骨形态发生蛋白2组Ⅰ型胶原蛋白表达增加,联合组尤其明显,音猬因子组与之接近.结论:骨形态发生蛋白2和音猬因子在体外能明显促进间充质干细胞向成骨细胞分化并且具有明显的协同相关性.     

体外诱导人骨髓间充质干细胞向成骨细胞的分化

背景：常规诱导方法诱导的细胞生长缓慢，数量少，使用生长因子可加快诱导速度，但生长因子价格昂贵限制了它的使用。目的：验证未加生长因子的诱导液体外诱导人骨髓间充质干细胞向成骨细胞分化的效率。设计、时间及地点：对比细胞学观察，于2007-07／2008-02在青岛大学医学院附属医院中心实验室完成。材料：骨髓来源自体干细胞移植治疗糖尿病患者，均征得患者同意。方法：采用密度梯度法分离培养骨髓间充质干细胞，应用0．1μmol／L地塞米松、10mmol／L β-甘油磷酸钠、50μmol／L维生素C对第3代骨髓间充质于细胞进行诱导，同时设立对照组，不加入诱导剂。主要观察指标：相差强微镜观察骨髓间充质干细胞的形态变化，诱导后经碱性磷酸酶染色和钙结节染色观察细胞形态变化。结果：第3代骨髓间充质干细胞在相差显做镜下呈均匀分布生长，形态为长梭形。经成骨诱导7d后培养细胞逐渐汇合呈铺路石状，随着诱导时间的延艮，局部细胞呈重叠牛长，间充质逐渐堆积、间充质中矿盐沉积，形成多个结节，并逐渐融合。培养14d可形成倒置显做镜下可见的褐色点状矿化结节中心；培养21d形成小片状矿化结节，von Kossa法测定可见钙结节争黑色，碱性磷酸酶活性测定为阳性。结论：骨髓间充质干细胞易诱导分化为成骨细胞，且增殖快，成骨能力强。     

人骨髓间充质干细胞向成骨细胞的诱导分化

目的诱导人骨髓间充质干细胞向成骨细胞分化。方法体外分离培养人骨髓间充质干细胞，将其分为对照组和诱导组两组。诱导组加入地塞米松、抗坏血酸和β-甘油磷酸，诱导成骨。采用免疫荧光染色的方法检测碱性磷酸酶（AKP）和骨桥蛋白（0PN）的表达；并通过RT-PCR检测骨桥蛋白mRNA的表达；利用硝酸银染色和茜素红染色两种特殊染色方法检测钙盐沉积。结果经诱导，诱导组细胞在呈典型的成骨细胞形态并有钙结节形成；免疫荧光染色结果显示诱导组细胞AKP和OPN均为强阳性表达，RT-PCR结果也显示诱导组细胞骨桥蛋白mRNA表达；两种特殊染色结果显示诱导组细胞有大量的钙盐沉积。而对照组细胞无上述形态改变和表达。结论人骨髓间充质干细胞在一定的诱导条件下能向成骨细胞分化。     

兔骨髓间充质干细胞体外培养向成骨和成脂方向的诱导分化

目的：骨髓间充质干细胞是存在于骨髓组织中多种干细胞的混和体，因其具有取材方便、扩增迅速、可自体移植并且具有多分化潜能等特点，是近年研究的热点。实验建立了体外分离、培养及鉴定兔骨髓间充质干细胞的方法，并通过此进一步验证其诱导成骨及成脂多向分化的潜能。 方法：实验于2006-08/2007—06在吉林大学药学院生物工程实验室完成，实验室属吉林大学重点实验室。①实验材料：四五月龄新西兰大白兔2只，由吉林大学基础医学院动物培养中心提供，体质量1．0～1．5kg，雌雄不限，实验动物级别为二级，实验过程中对动物处置符合动物伦理学标准。②实验方法：实验应用了密度梯度离心法与贴壁培养法相结合的方法从兔股骨、胫骨中分离、纯化骨髓间充质干细胞并在体外进行培养，以形态学及细胞表面标志的方法鉴定间充质干细胞，在倒置显微镜下观察细胞的形态特征，并利甩成骨诱导剂包括0．1μmol／L的地塞米松、50mg/L的维生素C、10mmol／L β-磷酸甘油钠和成脂诱导剂含10％FBS的L．DMEM、0．25μmol／L地塞米松、50μmol／L吲哚美辛、0．5mmol／LIBMX、10mg／L牛胰岛素诱导其向软骨细胞及脂肪细胞分化。 结果：①经原代及传代培养的骨髓间充质干细胞呈梭形，类似于成纤维细胞，骨髓间充质干细胞均一地表达CD29、CD44，而CD34、CD45均阴性表达。②成骨诱导14d后细胞不明显，未形成钙结节，21d后碱性磷酸酶钙钴法染色后大多数细胞的胞质呈棕黑色。③成脂诱导48h后，细胞内有小脂滴出现，2周后脂滴数量增加并相互融合，细胞（有）由长梭形变为圆形或多边形，油红O染色显示有大量脂质沉积。 结论密度梯度离心法与贴壁培养法相结合的方法是比较理想的骨髓间充质干细胞培养法，骨髓间充质干细胞经诱导培养后具有多向分?     

兔骨髓间充质干细胞体外培养向成骨和成脂方向的诱导分化

目的:骨髓间充质干细胞是存在于骨髓组织中多种干细胞的混和体,因其具有取材方便、扩增迅速、可自体移植并且具有多分化潜能等特点,是近年研究的热点.实验建立了体外分离、培养及鉴定兔骨髓间充质干细胞的方法,并通过此进一步验证其诱导成骨及成脂多向分化的潜能.方法: 实验于2006-08/2007-06在吉林大学药学院生物工程实验室完成, 实验室属吉林大学重点实验室.①实验材料:四五月龄新西兰大白兔2只, 由吉林大学基础医学院动物培养中心提供, 体质量1.0～1.5 kg, 雌雄不限, 实验动物级别为二级, 实验过程中对动物处置符合动物伦理学标准.②实验方法:实验应用了密度梯度离心法与贴壁培养法相结合的方法从兔股骨、胫骨中分离、纯化骨髓间充质干细胞并在体外进行培养,以形态学及细胞表面标志的方法鉴定间充质干细胞,在倒置显微镜下观察细胞的形态特征,并利用成骨诱导剂包括0.1 μmol/L的地塞米松、50 mg/L的维生素C、10 mmol/Lβ-磷酸甘油钠和成脂诱导剂含10?S的L-DMEM、0.25 μmol/L地塞米松、50 μmol/L吲哚美辛、0.5 mmol/L IBMX、10 mg/L牛胰岛素诱导其向软骨细胞及脂肪细胞分化.结果:①经原代及传代培养的骨髓间充质干细胞呈梭形,类似于成纤维细胞,骨髓间充质干细胞均一地表达CD29、CD44,而CD34、CD45均阴性表达.②成骨诱导14 d后细胞不明显,未形成钙结节,21 d后碱性磷酸酶钙钴法染色后大多数细胞的胞质呈棕黑色.③成脂诱导48 h后,细胞内有小脂滴出现,2周后脂滴数量增加并相互融合,细胞(有)由长梭形变为圆形或多边形,油红O染色显示有大量脂质沉积.结论:密度梯度离心法与贴壁培养法相结合的方法是比较理想的骨髓间充质干细胞培养法,骨髓间充质干细胞经诱导培养后具有多向分化潜能.     

电针诱导人骨髓间充质干细胞向成骨细胞分化

背景:目前经报道的成骨诱导方法很多,为骨髓间充质干细胞的成骨诱导提出很多新的思路及方法.但是电针是否能诱导骨髓间充质干细胞向成骨细胞分化尚不清楚.目的:尝试应用电针治疗仪诱导人骨髓闻充质干细胞向成骨细胞分化,评价其作为骨组织工程种子细胞的可行性.方法:从患者髂后上棘抽取骨髓.分离培养鉴定为骨髓间充质干细胞后,取第3代细胞进行培养.当细胞铺满培养瓶底90%以上时进行胰酶消化,分别以3.0×103/cm2的浓度接种于6孔培养板中.实验随机分为3组:空白对照组:加入2 mL体积分数为10%胎牛血清的L-DMEM/F12培养液;化学诱导组:每孔内加2 mL含10%胎牛血清的L-DMEM培养液,当细胞贴壁生长达到60%-70%汇合时,加入骨诱导剂;电针刺激组:加入2 mL体积分数为10%胎牛血清的L-DMEM/F12培葬液,电针刺激.采取连续波输出,基波脉冲频率为50 Hz,基波脉冲宽度0.5 ms,持续作用30 min,共电针刺激28 d.相差倒置显微镜观察细胞形态变化:茜索红染色结果:细胞诱导14,28 d后碱性磷酸酶活性:RT-PCR测定细胞中骨钙素mRNA的表达:Western Blot测定细胞中骨钙素蛋白表达.结果与结论:①在28 d的诱导过程中,化学诱导组5-7 d细胞汇合成单层,细胞突起互相连接,并可重叠生长而不发生细胞间的接触抑制现象:电针刺激组9 d或10 d发现细胞体积大,呈三角形、多角形或鳞形;空白对照组细胞形态仍然是纺锤状.②化学诱导组和电针刺激组28 d在倒置相差显微镜下均观察到育矿化结节出现,进行茜素红均呈阳性反应,而空白对照组呈阴性反应.③骨髓间充质干细胞在体外进行诱导时化学诱导组和电针刺激组碱性磷酸酶水平在14,28 d高于空白对照组(P<0.05):且化学诱导组碱性磷酸酶14 d时高于电针刺激组(P<0.05),但28 d时差异无显著性意义(P>0.05).④空白对照组骨钙素mRNA及蛋白含量均低于化学诱导组和电针刺激组(P<0.05).提示电针可定向诱导人骨髓间充质干细胞向成骨细胞分化.     

胰腺十二指肠同源框蛋白1基因转染人骨髓间充质干细胞及向胰岛样细胞的分化

背景:随着人胰岛素基因及某些血糖调节酶基因的克隆,以及重组载体为基础的基因克隆技术的建立,使骨髓间充质干细胞更容易向胰岛素分泌细胞分化,且具有体外扩增明显而无致瘤性的优点.目的:利用胰腺十二指肠同源框蛋白1(pancreatic duodenal homeobox-1,PDX-1)基因转染人骨髓间充质干细胞,观察基因修饰向胰岛样细胞的分化情况.设计、时间及地点:细胞-基因学体外实验,于2008-01/07在青岛大学医学院附属医院中心实验室完成.材料:骨髓来源于糖尿病患者,由青岛大学医学院附属医院干细胞中心提供.方法:利用反转录聚合酶链技术构建PDX-1基因的cDNA,酶切后插入经相同酶切处理的含绿色荧光蛋白的空白载体PEGFP-N1,构成重组质粒,再进行Bgl Ⅱ、HindⅢ双酶切筛选、鉴定并测序.Percoll法分离培养入骨髓间充质干细胞,当细胞汇合至90%时胰蛋白酶消化传代.转染前1 d加入无抗生素培养基,将第3代细胞按5×105接种于6孔培养板,适量重组载体及脂质体溶解后混合形成DNA-脂质体混合物,培养5 h后更换普通培养液.同时设立对照组,在6孔板中进行空白质粒转染.主要观察指标:脂质体介导转染后,荧光显微镜观察细胞转染情况;免疫荧光染色检测PDX-1蛋白的表达;双硫腙染色鉴定细胞分化情况.结果:通过测序、凝胶电泳、酶切等确定PDX-1基因已正确插入重组质粒.荧光显微镜下,成功转染的骨髓间充质干细胞发出绿色荧光,质粒转染效率约70%.转染8 d的细胞PDX-1呈阳性表达,对照组细胞PDX-1呈阴性.转染后14 d可见半悬浮的胰岛样细胞团,双硫腙染色呈棕红色,而未转染的对照组细胞双硫腙染色不着色.结论:PDX-1基因重组载体能够导入人骨髓间充质干细胞且稳定表达,并可以转化为胰岛样细胞.     

腺病毒介导的人骨形态发生蛋白2基因转染骨髓间充质干细胞

背景：骨髓间充质干细胞作为骨、软骨创伤缺损及退变修复的种子细胞越来越受到关注。目的：分析人骨形态发生蛋白2基因转染对白色封闭群大鼠（SD大鼠）骨髓间充质干细胞的影响。方法：分离纯化SD大鼠骨髓间充质干细胞并体外扩增,通过腺病毒载体介导人骨形态发生蛋白2基因转染骨髓间充质干细胞,分别通过荧光显微镜观察荧光表达情况及蛋白质水平来测定转染后人骨形态发生蛋白2的表达,碱性磷酸酶定量测定鉴定成骨活性及MTT法评估人骨形态发生蛋白2转染对骨髓间充质干细胞的影响。结果与结论：从SD大鼠骨髓提取物中分离培养的细胞形态为梭形,呈铺路石状、漩涡状生长,经流式细胞仪检测及多项分化能力鉴定符合骨髓间充质干细胞的特征;经转染人骨形态发生蛋白2基因后,骨髓间充质干细胞表达人骨形态发生蛋白2、碱性磷酸酶;MTT法检测转染人骨形态发生蛋白2基因后,骨髓间充质干细胞增殖能力明显增强（P〈0．05）。说明人骨形态发生蛋白2基因转染骨髓间充质干细胞后可以持续、高效表达入骨形态发生蛋白2和碱性磷酸酶,在体外明显促进骨髓间充质干细胞的增殖。     

骨形态发生蛋白4和骨形态发生蛋白4/7基因转染对骨髓基质干细胞成骨活性差异的比较

背景:有文献报道骨形态发生蛋白(bone morphogenetic proteins,BMPs)异源二聚体比同源二聚体的活性高,目前国内外尚无BMP-4/7异源二聚体与BMP-4同源二聚体间诱导成骨活性比较的报道。目的:观察不同基因BMP-4、BMP-4/7对骨髓基质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs)成骨活性的差异,探讨融合基因BMP-4/7的生物学活性。方法:经脂质体转染分离培养的兔BMSCs,G418筛选出稳定表达株,利用RT-PCR法证明目的基因在BMSCs中的表达情况;以BMP-4和BMP4/7融合基因修饰的AAV载体,转染兔BMSCs,MTT法检测不同基因转染细胞的增殖能力;以BMP-4单基因和BMP-4/7融合基因修饰的AAV载体转染兔BMSCs7d后,测定两组细胞内碱性磷酸酶及骨钙素水平,观察成骨活性的变化。结果与结论:实验成功构建高滴度的分别携带BMP-4单基因、BMP-4/7融合基因的重组腺相关病毒载体AAV-BMP-4、AAV-BMP-4/7;RT-PCR结果证明目的基因能够在BMSCs中得到稳定表达。AAV-BMP-4及AAV-BMP-4/7载体转染效率分别为68.20%、72.18%;转染BMSCs后,细胞增殖能力均明显提高,BMP-4/7融合基因的细胞增殖能力活性高于BMP-4单基因。以BMP-4和BMP-4/7融合基因修饰的AAV转染细胞7d后,细胞内碱性磷酸酶活性明显上调,骨钙素水平升高,成骨活性均增强;两种基因比较,BMP-4/7融合基因成骨活性强于BMP-4单基因(P<0.01)。提示BMP-4、BMP-4/7修饰的AAV载体转染效率高,对BMSCs均有成骨活性,其中BMP-4/7融合基因成骨活性强于BMP-4单基因。