前房注射聚苯乙烯微球诱导小鼠慢性高眼压研究

背景 以往国内关于青光眼研究的造模方法中大多存在高眼压维持时间较短的问题.目前前房内注射聚苯乙烯微球建立小鼠慢性高眼压模型的方法已在国外应用,但国内尚缺乏对该模型的评价.目的 评价前房内一次性注射聚苯乙烯微球建立小鼠慢性高眼压模型的方法学及应用价值.方法 将42只SPF级成年C57BL/6L雌性小鼠用随机数字表法随机分为3个组,正常对照组小鼠不进行任何处理;PBS组小鼠前房内一次性注射PBS溶液2μl;微球组小鼠左眼前房内一次性注射聚苯乙烯微球2μl.各组小鼠均于注射后2周和4周行裂隙灯显微镜检查,采用TonoLab回弹式眼压计测量眼压;并于相应时间点观察结束后处死动物,制备眼球的组织学切片和视网膜铺片,在光学显微镜下观察前房角情况;采用质量分数4％荧光金经上丘逆行标记视网膜神经节细胞（RGCs）,在荧光显微镜下计数各组小鼠视网膜铺片中RGCs的存活密度和神经纤维的数量;采用免疫组织化学染色法检查视网膜铺片中β-Ⅲ-微管蛋白阳性细胞数. 结果 前房注射后2周和4周,微球组小鼠眼压均明显高于正常对照组和PBS组,差异均有统计学意义（P＜0.05）.微球注射后2周小鼠平均眼压达高峰,为（29.67±2.34）mmHg（1 mmHg=0.133 kPa）,之后眼压逐渐下降,4周时小鼠的平均眼压为（15.71±1.23）mmHg,但明显高于术前,差异均有统计学意义（P＜0.05）.微球组小鼠前房注射后裂隙灯显微镜下可见角膜水肿,但前房内未见明显的炎症反应,眼球组织病理学检查可见微球聚集在前房角.前房注射后2周和4周,微球组RGCs存活密度分别为（4 542.82±653.72）个/mm2和（3 623.12±628.79）个/mm2,明显低于正常对照组的（6 979.33±678.49）个/mm2和（6 963.91±497.29）个/mm2,差异均有统计学意义（t=17.729、28.569,P＜0.05）,亦明显低于PBS组的（6 843.21 ±573.42）个/mm2和（6 937.53±465.24）个/mm2,差异均有统计学意义（t=16.975、29.145,P＜0.05）,且注射后4周RGCs的存活数量较2周时明显减少,差异有统计学意义（t=6.951,P＜0.05）.前房注射后2周和4周,微球组小鼠视网膜β-Ⅲ-微管蛋白阳性细胞数为（4 576.36±479.64）个/mm2和（3 712.90±660.31）个/mm2,均少于正常对照组的（6 725.94±619.42）个/mm2和（6 741.90±663.60）个/mm2,差异均有统计学意义（t=18.811、22.182,P＜0.05）,亦明显少于PBS组的（6 757.85±463.59）个/mm2和（6 773.17±471.35）个/mm2,差异均有统计学意义（t=18.953、22.605,P＜0.05）,微球组注射后4周视网膜β-Ⅲ-微管蛋白阳性细胞数少于2周时,差异有统计学意义（t=7.253,P＜0.05）.注射后2周微球组小鼠视网膜神经纤维密度为（193.08±32.75）个/mm2,4周时为（139.00±38.24）个/mm2,明显低于正常对照组的（305.57±81.21）个/mm2和（297.46±52.60）个/mm2,差异均有统计学意义（t=8.900、16.883,P＜0.05）,亦明显少于PBS组的（312.63±70.62）个/mm2和（269.37±61.63）个/mm2,差异均有统计学意义（t=7.731、15.959,P＜0.05）,微球组注射4周时视网膜神经纤维密度低于2周时,差异有统计学意义（t=7.442,P＜0.05）.结论 前房一次性注射聚苯乙烯微球的方法可引起小鼠的持续性高眼压,并造成RGCs和神经纤维的进行性损害,与人类青光眼的病理变化过程类似.     

两种慢性高眼压大鼠模型视网膜结构和眼压变化的评估

目的 评估两种慢性高眼压大鼠模型的升眼压效果和视网膜结构的改变.方法 分别通过前房内注射微珠(微珠组)和结扎3支巩膜上静脉(结扎组)的方法制作两种慢性高眼压大鼠模型(每组6只).使用TonoPen眼压计测量大鼠眼压,模型制作当天及其后每周测量大鼠眼压,大鼠右眼为实验眼,左眼为对照眼(假手术眼).采用荧光金上丘逆标的方法标记视网膜神经节细胞并计数;使用免疫荧光标记的方法观察大鼠视网膜结构的改变.结果 造模后1-8周微球组和结扎组大鼠眼压均升高;其中结扎组眼压为(27.20±1.83) mmHg(1 kPa=7.5 mmHg),其对照眼眼压为(19.80±1.35) mmHg(P=0.001,n=6);微珠组眼压为(27.40±1.88) mmHg,其对照眼眼压为(19.40±1.00) mmHg(P=0.000,n=6).造模后8周,巩膜上静脉结扎组视网膜神经节细胞丢失37.9％、39.6％和33.5％(均为P=O.000,n=6),前房内注射微珠组丢失37.3％、39.4％和32.3％(均为P=0.000,n=6),两组视网膜神经节细胞的丢失数量比较差异均无统计学意义(P =0.855、0.949、0.634,n=6).高眼压模型8周后,相较于对照组,微珠组和结扎组视网膜神经节细胞核数量均有明显减少,组织厚度变薄,但两组间差异无统计学意义[对照组厚度(7.32±0.39) μm,结扎组厚度(4.97±0.33)μm,微珠组厚度(5.00 ±0.31) μm].前房内注射微珠组在部分组织切片可发现微珠污染.结论 巩膜上静脉结扎和前房内注射微珠均可以使大鼠眼压稳定增高.巩膜上静脉结扎具有实施方便和价格低的优势,并且没有微珠污染的缺点.     

灯盏细辛对兔高眼压视网膜神经节细胞活性的作用

目的观察灯盏细辛对慢性高眼压兔视网膜神经节细胞活性的保护作用。方法对20只健康新西兰白兔右眼前房内注射40g·L-1甲基纤维素,制成慢性高眼压模型,左眼眼压均正常,随机分成灯盏细辛治疗组(n=10,高眼压+灯盏细辛治疗亚组和正常眼压+灯盏细辛治疗亚组)和未治疗组(n=10,单纯高眼压亚组和单纯正常眼压亚组)。治疗组于高眼压模型制作后第7d开始行灯盏细辛悬浊液灌胃,60d后制作眼球标本。常规石蜡切片,AgNOR染色观察RGCs细胞核内的银染颗粒。采用计算机图像分析系统对RGCs细胞核内的银染颗粒进行定量分析。结果高眼压2亚组较正常眼压2亚组的RGCs细胞核内银染颗粒明显减少,其差异有显著性意义(P<0.05);其中高眼压+灯盏细辛治疗亚组较单纯高眼压亚组银染颗粒多(P<0.05)。结论40g·L-1甲基纤维素前房注射建立慢性高眼压模型可导致RGCs细胞核内银染颗粒减少,灯盏细辛对高眼压后RGCs活性有一定的保护作用。     

玻璃体内注射酵母多糖对视神经夹伤大鼠RGCs的保护作用

目的 观察眼内注射酵母多糖对视神经夹伤大鼠视网膜神经节细胞(RGCs)的保护作用.方法 SD大鼠45只,随机分为3组,以荧光金逆行标记RGCs 1周后,行左眼视神经钳夹伤,右眼为假手术对照.3 d后分别于各对应组大鼠左眼玻璃体腔注射PBS或酵母多糖5μL,所有大鼠存活21 d处死,每组各取5只大鼠行视网膜冰冻切片,余做视网膜铺片,计算RGCs标识率(左眼RGCs数μ右眼RGCs数)× 100%,并行统计学分析.结果 酵母多糖组、PBS组和单纯钳夹组中RGCs标识率分别为:(19.22±2.51)%、(1.86 ±3.09)%和(1.78±2.61)%,酵母多糖组中存活RGCs较单纯钳夹组和PBS组差异有统计学意义(P=0.000),单纯钳夹组和PBS组差异无统计学意义(P=0.925).结论 酵母多糖玻璃体腔注射后,能诱导眼内炎症反应,从而对视神经夹伤大鼠RGCs的存活具有一定的保护作用.     

慢性高眼压模型鼠视网膜神经节细胞及视神经中9位丝氨酸磷酸化糖原合酶激酶3β的表达变化

目的 观察慢性高眼压模型鼠视网膜神经节细胞(retina ganglion cells,RGCs)和视神经中9位丝氨酸磷酸化糖原合酶激酶3β[p-GSK3β(ser9)]的表达变化,探讨GSK3β是否在慢性高眼压RGCs及视神经退行性病变中发挥作用.方法 取健康SD大鼠30只,随机分为3组:模型对照组、慢性高眼压模型2周组、慢性高眼压模型4周组,每组10只.取大鼠右眼,采用巩膜上静脉结扎并烧灼法建立大鼠慢性高眼压模型.分别于造模后2周和4周取5只大鼠眼球行冰冻切片,尼氏染色观察RGCs数目,免疫荧光染色观察RGCs和视神经中p-GSK3β(ser9)的变化;各组取另外5只大鼠眼视网膜,Western blot检测p-GSK3β(ser9)及总-GSK3β的表达.结果 造模前3组大鼠右眼眼压差异无统计学意义(P=0.89);造模后3组间眼压差异有统计学意义(P＜0.01),慢性高眼压模型2周组和4周组眼压与模型对照组比较明显升高,分别升高了59.13％和26.93％,差异均有统计学意义(均为P＜O.01).视网膜尼氏染色RGCs计数发现模型对照组RGCs数为(149±12)个,慢性高眼压模型2周组和4周组RGCs数较模型对照组明显减少,分别为(120±10)个和(86±7)个,差异均有统计学意义(均为P＜0.05);且4周组比2周组进一步减少(P＜0.01).慢性高眼压模型2周组和4周组视网膜中p-GSK3β(ser9)阳性着色,同模型对照组相比,其RGCs层及视神经中p-GSK3β(ser9)染色荧光减弱;4周组较模型对照组减弱更明显.与模型对照组相比,慢性高眼压模型2周组和4周组视网膜中总-GSK3β的表达差异无统计学意义(F=0.24,P=0.79);而3组间p-GSK3β(ser9)表达差异有统计学意义(P＜0.01),与模型对照组相比,慢性高眼压模型2周组和4周组视网膜中p-GSK3β(ser9)分别减少了19.89％和36.46％(均为P ＜0.05).慢性高眼压模型4周组比2周组视网膜中p-GSK3β(ser9)表达持续减少,差异具有统计学意义(P＜0.05).结论 慢性高眼压模型鼠RGCs数目减少,RGCs和视神经中p-GSK3β(ser9)表达减少,推测p-GSK3β(ser9)表达变化可能参与了慢性高眼压模型鼠RGCs及视神经退行性病变.     

超声微泡介导增强型绿色荧光蛋白基因转染视网膜神经节细胞的体内实验

目的 验证超声微泡介导增强型绿色荧光蛋白(EGFP)基因能否在体内成功转染视网膜神经节细胞(RGCs),是否比传统的转染方式效率高以及这种转染方式是否损伤RGCs.方法 将SD大鼠50只随机分为4组:正常对照组(n=5)、单纯质粒组(n=15)、质粒+超声组(n=15)、超声微泡组(n=15).采用玻璃体腔注射试剂的方法,正常对照组注射5 μl生理盐水;单纯质粒组,注射5μl质粒;质粒+超声组,注射5μl质粒后,立即用0.5 W/cm2超声波辐照大鼠眼球60 s,工作时间控制为1/3(即辐照5s,停10 s,共60 s);超声微泡组,注射质粒微泡混悬液5 μl后,立即用前述同等能量超声波辐照大鼠眼球.7d后,取大鼠眼球制作视网膜铺片、冰冻纵切片及视网膜EGFPmRNA的RT -PCR.用荧光显微镜观察铺片及切片中EGFP在RGCs的表达情况.用RGCs计数观察RGCs损伤情况[1-2].用RT-PCR对EGFPmRNA进行半定量检测.结果 超声微泡介导EGFP基因转染RGCs的效率明显高于正常对照组、单纯质粒组和质粒+超声组,且对RGCs无明显损伤.结论 在低频超声波的照射下,超声微泡能够在体内安全、有效地介导EGFP基因转染RGCs.     

蛇毒神经生长因子对高眼压下兔视网膜髓鞘碱性蛋白的影响

目的 通过对兔视网膜损伤后髓鞘碱性蛋白(MBP)的研究,观察蛇毒神经生长因子(vNGF)对慢性高眼压下兔视网膜神经节细胞(RGCs)的保护作用.方法 24只大白兔右眼前房注入0.3%复方卡波姆溶液0.1mL,制成兔慢性高眼压模型后,随机分为vNGF治疗组和平衡盐液对照组,分别于眼压缓慢升高2周后右眼玻璃体腔内注入vNGF和平衡盐液;3d后重复注药1次.分别于最后1次给药后第5d、10d取材;采用病理图像分析仪计数RGCs数目;进行MBP免疫组织化学染色分析.结果 前房注入复方卡波姆溶液后,眼压在1周内缓慢升高并维持到实验结束,平均眼压(32.93±6.33)mmHg.5d时实验组和对照组的RGCs分别为19.25±2.60和12.88±1.46;10d时实验组和对照组的RGCs分别为16.84±1.52和7.63±1. 72,差异均有统计学意义(P＜0.05).对照组MBP表达高于实验组.结论 vNGF能降低高眼压后视网膜MBP的含量,提高RGCs的存活数量,对RGCs损伤后的修复有明显的促进作用.     

超声微泡介导Ngb基因过表达对大鼠视网膜急性高眼压损伤的保护研究

目的 探讨超声微泡靶向破坏(ultrasound-targeted microbubble destruction,UTMD)技术介导的脑红蛋白(neuroglobin,Ngb)过表达对大鼠急性高眼压损伤的视网膜保护作用.方法 40只SD大鼠右眼进行基因转染,即利用UTMD将携带外源性Ngb基因的重组质粒转染至大鼠视网膜组织;左眼为对照组(未转染组),即只升高眼压.在转染后48 h,采用前房加压灌注升高眼压的方法制作急性高眼压模型,术后5 min、10min、30 min、60 min分别处死各组大鼠,摘取眼球,分离视网膜.Westernblotting检测Ngb在急性高眼压时表达的变化情况,测定并比较双眼的caspase-3活性.结果 UTMD介导外源性Ngb在视网膜各层均有表达,对视网膜没有造成损伤.未转染组Ngb表达水平呈时相性变化,在高眼压缺氧5～ 10 min时明显增高,在10min时达到峰值,随后开始下降,在60 min时最低.转染组Ngb表达水平明显高于未转染组,在缺氧30 min时达到峰值,随后开始下降.随着高眼压时间的延长,caspase-3活性逐渐增加,说明死亡的视网膜神经纤维层细胞越来越多.转染组的caspase-3活性明显低于未转染组,在相同时间点,两组之间差异均有统计学意义(均为P ＜0.05).结论 UTMD能够在体内安全、有效地介导Ngb基因转染至视网膜组织中.Ngb过表达可以降低视网膜对缺血缺氧的敏感性,起到视网膜组织保护作用.     

中药刺蒺藜对兔视网膜神经细胞的作用

目的:观察中药刺蒺藜对高眼压兔视网膜神经节细胞(RGCs)的作用。方法:将16只健康新西兰兔随机分为正常组(A组)、高眼压组(B组)和高眼压治疗组(C组),以20g/L甲基纤维素前房注射建立B,C组兔慢性高眼压模型,C组予以每日静脉注射刺蒺藜针剂5mg/kg,连续用药30d后摘取眼球进行RGCs观察及视网膜神经纤维层(RNFL)厚度测量。结果:造模后各组眼压均有升高,HE染色切片中C组RGCs变性程度及RNFL受损程度明显低于B组(P<0.01)。结论:中药刺蒺藜能在一定程度上保护高眼压状态下的视网膜神经节细胞。     

缺氧诱导因子-1信号通路在高眼压模型中的表达

目的:研究缺氧诱导因子-1(hypoxia inducible factor-1,HIF-1)信号通路在高眼压状态下的表达情况.方法:利用前房注射磁性微球法建立大鼠高眼压动物模型,通过荧光金逆行标记观察视网膜神经节细胞(retinal ganglion cells,RGCs)的存活情况,提取视网膜组织行Western印迹检测HIF-1α、血管内皮生长因子-A(vascular endothelial growth factor A,VEGF-A)-和促红细胞生成素(erythropoietin,EPO)的表达,并分析HIF-1α的变化趋势与眼压之间的关系.结果:高眼压1d时平均眼压为(40.33±2.94) mmHg,第3天为(68.83±2.85) mmHg,第10天时下降至(43.67±3.67) mmHg,后趋于稳定,与对照眼相比差异均有统计学意义(P＜0.01).高眼压2周时中央、中间和周边视网膜的RGCs存活率分别为61.1％±1.1％,68.5％±8.5％和73.6±3.6％,至高眼压3周迅速下降,分别为33.2％±3.2％,43.4％±3.4％和51.4％±2.1％.高眼压3d时,眼压值达最高,HIF-1α,VEGF-A和EPO的表达亦达高峰,与对照组相比差异均有统计学意义(P＜0.01);后随着眼压值下降,表达也随之逐渐减少.眼压升高3d,7d,2周分别与对照组的HIF-1α/GAPDH的蛋白灰度比和眼压值间的相关系数为0.977,0.886,0.763,差异具有统计学意义(P＜0.01).结论:HIF-1α的表达在一定条件下与眼压值呈正相关,该通路的早期激活可能在高眼压病程中扮演重要的角色.     

水通道蛋白4基因对慢性高眼压小鼠视网膜中胶质纤维酸性蛋白表达的调控

背景 本课题组先前的研究发现,神经胶质纤维酸性蛋白（GFAP）在慢性高眼压模型小鼠视网膜星形胶质细胞和Müller细胞中表达增加,这一改变与视网膜神经节细胞（RGCs）的改变及疾病的发生及发展密切相关.水通道蛋白4（AQP4）在视网膜主要存在于神经胶质细胞中,青光眼发病过程中AQP4与GFAP表达的关系尚不清楚. 目的 研究慢性高眼压状态下AQP4基因在慢性高眼压情况下是否能够调控视网膜神经胶质细胞中GFAP的表达,探讨AQP4基因在青光眼RGCs损害中的作用.方法 利用小鼠巩膜外静脉烧烙法（烧烙静脉3～4支）建立雄性小鼠AQP4基因敲除（AQP4-/-）小鼠及其同背景雄性野生型（WT）小鼠左眼慢性高眼压模型,均取右眼作为对照眼.选择造模成功的两种小鼠各30只,分别于术后1、3、7、14和28 d各取6只小鼠用Icare回弹式眼压计测量小鼠眼压,分别于相应时间点分离取小鼠视网膜,通过Western blot 法检测AQP4-/-小鼠及WT小鼠视网膜神经胶质细胞中GFAP水平的变化,用t检验、三因素方差分析及SNK-q检验分析实验数据.结果 造模后1、3、7、14和28 d,AQP4-/-小鼠实验眼眼压均明显高于对照眼,差异均有统计学意义（t=15.29、16.02、13.77、14.34、12.40,均P＜0.05）;上述各时间点WT小鼠实验眼眼压均明显高于对照眼,差异均有统计学意义（t=17.65、14.91、15.97、13.41、12.53,均P＜0.05）.正常情况下AQP4-/-小鼠与WT小鼠视网膜组织中均有GFAP表达,WT小鼠对照眼、实验眼造模后1、3、7、14和28 d,视网膜中GFAP的表达量（GFAP/β-actin）分别为1.00±0.00、1.99 ±0.29、4.05±0.69、4.47±0.48、3.21±0.35、3.25±0.53;AQP4-/-小鼠对照眼、实验眼术后1、3、7、14和28 d视网膜中GFAP相对表达量（GFAP/β-actin）分别为1.00±0.00、1.69±0.31、2.27±0.55、2.79±0.39、1.93±0.31和1.54±0.40;造模后不同时间点小鼠视网膜中GFAP表达量差异有统计学意义（F=9.54,P＜0.05）,WT小鼠随着造模后时间的延长,视网膜总GFAP的表达量逐渐升高,而AQP4-/-小鼠视网膜中总GFAP的相对表达量逐渐下降,差异均有统计学意义（P＜0.05）.正常情况下WT小鼠与AQP4-/-小鼠视网膜组织中GFAP/β-actin差异无统计学意义（P＞0.05）,WT小鼠术后3、7、14和28 d视网膜中GFAP的表达值均显著高于AQP4-/-小鼠,差异均有统计学意义（t=4.51、7.95、6.12、5.76,P＜0.01）. 结论 慢性高眼压状态下AQP4基因可以上调小鼠视网膜神经胶质细胞中GFAP的表达,从而引起视网膜神经胶质细胞的活化,导致RGCs的损害.AQP4可能成为治疗青光眼的新靶点.     

大鼠急性视网膜缺血节细胞死亡时脑红蛋白的表达

目的 研究大鼠视网膜急性缺血中视网膜节细胞(RGCs)死亡时脑红蛋白(Nsb)的表达.方法 实验研究.采用特异性结扎大鼠视网膜动脉的方法造成视网膜急性缺血模型,按照结扎时间不同(0、15、30、60 min)分为A、B、C、D组,每组10只大鼠,均以左眼为实验眼.每组随机选取3只大鼠视网膜用于免疫印迹法检测,4只大鼠视网膜做HE染色节细胞计数及免疫组化染色荧光强度分析,3只大鼠做免疫电子显微镜观察.采用单因素方差分析对不同结扎时间Ngb蛋白定量及RGCs数目进行统计学分析,采用KSD-t检验进行两两比较.结果 视网膜完全结扎后,A、B、c、D组Ngb蛋白表达量分别为1.439±0.014、2.023±0.134、1.416±0.030及1.073±0.064;RGCs计数结果分别为4368±124、4296 ±96、4132±104、3973±115,组间比较差异有统计学意义(F=79.548,10.191,P<0.05).B组表达最高,之后逐渐降低,C组接近正常,此时与A组比较RGCs数量开始减少,D组Ngb的表达已明显低于A组,与A组比较RGCs数量进一步减少.在视网膜各层中,Ngb的表达以RGCs层为最高,其次为内丛状层与外丛状层.RGCs中Ngb主要分布在胞质,C组线粒体外室和线粒体嵴也发现有Ngb表达,而内核层及外核层细胞的胞质内始终未见Ngb的表达.结论 Ngb在大鼠RGCs急性缺血死亡时表达快速升高,主要表达于RGCs的胞质内,与RGCs的生存状态关系密切.     

色素上皮衍生因子对大鼠慢性高眼压视网膜神经节细胞的保护作用

目的探讨色素上皮衍生因子（PEDF）对慢性高眼压条件下大鼠视网膜神经节细胞（RGCs）的作用。方法雌性SD大鼠36只,随机分为高眼压＋PEDF组（A组）、高眼压＋去离子水组（B组）和假手术＋PEDF组（C组）,A组、B组模型的制作应用巩膜浅层静脉烧烙法建立慢性高眼压模型,C组仅剪开球结膜,不烧烙巩膜浅静脉。A组、C组在模型建立后即刻用10μL微量注射器于大鼠角膜缘后2mm处刺入玻璃体腔,抽出玻璃体2μL,再向玻璃体腔内注射0．05g／L重组大鼠PEDF2μL,B组同法注入等量的去离子水。在3d和14d后处死动物,摘除眼球,将视网膜组织行冰冻切片,用TUNEL法及Fluoro—Jade（FJ）荧光染色检测各组RGCs的凋亡和变性。结果术后3d、14d时A组和B组眼压均明显升高,与同时间点C组相比差异均有统计学意义（P〈0．05）;各组术后3d和14d间的眼压比较差异均无统计学意义（P〉0．05）。TUNEL检测显示,A组、C组3d和14d RGCs的凋亡数目均明显少于同时间点B组（P〈0．05）,A组14d的凋亡细胞数明显少于3d（P〈0．05）。FJ荧光染色结果显示,A组、C组3d和14d变性RGCs数均明显少于B组（P〈0．05）,A组14d的变性细胞数较3d时明显减少（P〈0．05）。结论玻璃体腔注射PEDF可减少慢性高眼压大鼠RGCs的凋亡和变性。     

Characterization of intraocular pressure pattern and changes of retinal ganglion cells in DBA2J glaucoma mice

AIM: To characterize the pattern of intraocular pressure (IOP) change and the deficit of retinal ganglion cells (RGCs) in DBA2J, which is most wellcharacterized chronic glaucoma mouse model and wild type (WT) C57bl/6 mice, and to study the relationship between IOP change and RGCs deficit. METHODS: IOP was monitored with a rebound tonometer in WT C57bl/6 and DBA2J mice from 3 to 15-monthold. Retinal function was evaluated by dark-adapted electroretinogram (ERG) in DBA2J and WT mice of 15monthold. A dye (Neurobiotin) was applied to optic nerve stump to retrograde label RGCs. TO-PRO-3 visualized all nuclei of cells in the RGC layer. RESULTS: The IOP in WT mice was 9.03±0.6 mm Hg on average and did not increase significantly as aging. The IOP in DBA2J mice, arranging from 7.2 to 28 mm Hg, was increasing significantly as aging, and it was normal at 3monthold compared with WT mice, slightly increased from 7-monthold and increased in 50% animals at 11monthold and in 38% animals at 15-monthold. The RGCs density in DBA2J mice started reducing by 7month-old, continuously decreased until reached about 20% of RGC in WT retina by 15monthold. RGC density was not linearly correlated with IOP in 15-monthold DBA2J mice. The amplitude of positive scotopic threshold response, and negative scotopic threshold response of ERG were significantly reduced in DBA2J mice of 15-monthold than that in agepaired WT mice. CONCLUSION: The present study found that DBA2J mice display pathological and functional deficits of the retina that was not linearly correlated with IOP.     

经瞳孔温热疗法对大鼠视神经钳夹视网膜神经节细胞的保护作用

目的探讨经瞳孔温热疗法（TTT）阈下反应对BN大鼠视神经钳夹后视网膜神经节细胞（RGCs）的保护作用。方法采用阈下TTT对BN大鼠视网膜进行照射后3d,通过逆行标记RGCs的方法,对TTT＋视神经钳夹组（A组）、TTT＋假手术组（B组）、单纯视神经钳夹组（C组）和空白对照组（D组）在视神经钳夹后1、2、4周进行RGCs计数并比较;检测视网膜TTT阈下反应的热休克蛋白70（HSP70）表达;观察TTT阈下反应对视网膜的影响。结果视神经钳夹后4周,A组RGCs数显著高于C组（P=0.006）,而1周和2周时2组之间差异无统计学意义（P〉0.05）;各时间点B组和D组的RGCs数差异无统计学意义（P〉0.05）。视网膜经阈下TTT干预后,HSP70表达高于对照眼。阈下TTT照射能引起视网膜组织形态上的改变。结论阈下TTT可显著提高视神经钳夹4周后RGCs的存活数量;其保护机制可能与诱导视网膜内源性HSP70表达、启动内源性保护机制有关。     

αB-晶体蛋白对急性高眼压大鼠视网膜神经节细胞轴突再生作用的研究

目的:研究αB-晶体蛋白对大鼠急性高眼压后视网膜组织中αB-晶体蛋白含量,视网膜神经节细胞(retinal ganglioncells,RGCs)中生长相关蛋白-43(growth associated protein-43,GAP-43)表达和全视野视网膜电流图(full-field ERG,F-ERG)的b波振幅差异,探讨αB-晶体蛋白对急性高眼压后RGCs轴突再生的影响。方法:采用随机分组设计的实验研究。本实验选择120只健康、无眼疾SD大鼠,随机分为以下4组:αB晶体蛋白组(αB)30只,生理盐水组(S)30只,假手术组(P)30只,急性高眼压组(H)30只,均以右眼为实验眼,分别于术后7d和14d各取5只术眼的视网膜,行Western-blot法,观察急性高眼压后视网膜中αB-晶体蛋白的表达;术后7,14,21d各取5只术眼的视网膜,行免疫组织化学法,观察急性高眼压后RGCs的GAP-43表达;术前和术后1mo时应用全视野ERG的b波振幅变化测定视网膜功能。组间数据比较采用单因素方差分析(One-wayANOVA),组间两两比较采用SNK-q检验。结果:αB组视网膜中αB-晶体蛋白的表达于术后7d较高,14d时表达减弱(P=0.000),但同一时间点明显高于其他三组(P=0.006,P=0.024,P=0.007;P=0.006,P=0.008,P=0.010);αB组RGCs的GAP-43表达于术后7d达高峰,14d时表达减弱,21d时仍有少量表达(P=0.000),但各时间点明显高于其他三组(P=0.001,P=0.002,P=0.001;P=0.015,P=0.002,P=0.006;P=0.005,P=0.003,P=0.005);ERG-b波振幅于术后1mo较低(P=0.014,P=0.004,P=0.003,P=0.006),其中术前各组ERG-b波振幅无明显差异(P=0.993),术后1mo时αB组ERG-b波振幅明显高于其他三组(P=0.000,P=0.004,P=0.002)。结论:外源性αB-晶体蛋白能够提高视网膜αB-晶体蛋白的表达;αB-晶体蛋白通过促进RGCs中GAP-43的表达,从而促进RGCs的轴突再生;αB-晶体蛋白可促进视网膜功能的恢复,对大鼠视网膜无毒性作用。     

银杏叶提取物对急性缺血再灌注后视网膜神经节细胞的保护作用

目的探讨银杏叶提取物（EGb761）对大鼠急性高眼压诱导缺血再灌注模型中视网膜神经节细胞（RGCs）的保护作用。方法60只SD大鼠随机分为5组,右眼为损伤眼,行前房穿刺灌注形成110mmHg的眼压维持60min,左眼未损伤,作为空白对照。损伤后2h及此后每日1次灌胃给药,各组分别给予生理盐水5mg／kg、1％灯盏细辛5mg／kg、0．25％EGb761 5mg／kg、1％EGb7615mg／kg和4％EGb761 5mg／kg。动物损伤后第23天用荧光金行双上丘逆行标记,第28天取眼球标本做视网膜铺片并拍摄照片,计数RGCs并计算其的存活率。结果生理盐水组、1％灯盏细辛组、0．25％EGb761、1％EGb761和4％EGb761组RGCs存活率分别为66．58％、75．62％、74．92％、76．57％、79．87％。生理盐水组与各EGb761组之间差异均有统计学意义（q=0．00,q=0．19,q=0．10,P〈0．01）,不同质量浓度EGb761组之间差异均无统计学意义（q=0．22,q=0．13,q=0．45,P〉0．05）;1％灯盏细辛组与生理盐水对照组比较差异有统计学意义（q=0．16,P=0．02）,与0．25％EGb761组、1％EGb761组、4％EGb761组比较差异均无统计学意义（q=0．20,q=0．01,q=0．50,P〉0．05）。结论在急性高眼压诱导缺血再灌注模型中,银杏叶提取物能有效地保护RGCs。     

Induction of heat shock protein 72 protects retinal ganglion cells in a rat glaucoma model

PURPOSE: To investigate whether heat shock protein (Hsp) 72 is induced in retinal ganglion cells (RGCs) in experimental rat glaucoma and whether the induction of Hsp72 by heat stress or zinc (Zn(2+)) administration can increase survival of RGCs in the model. METHODS: Intraocular pressure (IOP) was elevated unilaterally in Wistar rats with argon laser irradiation of the trabecular meshwork 5 days after intracameral injection of india ink. Immunohistochemical staining for Hsp72 was performed. The rats with elevated IOP were treated with heat stress once a week (six rats) or intraperitoneal injection of zinc (10 mg/kg) every two weeks (six rats). Untreated rats with elevated IOP served as a control group (six rats). Quercetin, an inhibitor of Hsp expression was injected in the rats with heat stress (six rats) and zinc injection (seven rats). Subsequent to 4 weeks of IOP elevation, RGCs were counted. RESULTS: The IOP increase compared with the contralateral eyes was 48% +/- 4% throughout the study period. Hsp72 was detected only in the eyes with elevated IOP at 1 and 2 days and was weakly detected at 1 week of IOP elevation. A single administration of zinc strongly induced Hsp72 in RGCs of rats with elevated IOP for 2 weeks. Treatment with heat stress or zinc in rats with elevated IOP increased RGC survival after 4 weeks of IOP elevation, compared with the untreated control group (P = 0.004, n = 6). Quercetin reversed the positive effect of heat stress or zinc injection on RGC survival. CONCLUSIONS: These results demonstrate the possibility of a novel therapeutic approach to glaucoma through an enhanced induction of the endogenous heat shock response.     

热休克蛋白72（HSP72）对大鼠青光眼模型视网膜神经节细胞和视神经的保护作用

目的　探讨热休克蛋白72（heat shock protein 72,HSP72）对大鼠青光眼模型视网膜神经节细胞（retinal ganglial cells,RGCs）和视神经的保护作用。方法　选取Wistar大鼠46只，采用随机数字表法将所有大鼠分为正常对照组（6只）和实验组（40只），实验组40只大鼠中8只不作处理（实验对照组），在制作青光眼模型后2 d，给予16只大鼠热休克反应处理（热休克反应组），16只大鼠硫酸锌腹腔注射（硫酸锌注射组）。观察及比较治疗前后各组大鼠眼压、RGCs中HSP72抗体含量、RGCs平均密度。结果　激光后3 d、7 d、14 d、28 d，各组大鼠右眼眼压均较激光前有所上升，且各组间差异均无统计学意义（均为P>0.05）。正常对照组大鼠不同时间点HSP72抗体在RGCs中无表达，激光后3 d实验组各组大鼠RGCs中HSP72抗体含量缓慢上升，7 d、14 d达高峰，此后逐渐下降至接近正常水平。激光后，实验组各组大鼠RGCs中HSP72抗体含量显著高于正常对照组，且热休克反应组RGCs中HSP72抗体含量均高于实验对照组，低于硫酸锌注射组，差异均有统计学意义（均为P<0.05）。激光后3 d、7 d、14 d、28 d实验组各组大鼠RGCs平均密度均明显低于正常对照组，且热休克反应组RGCs平均密度显著高于实验对照组和硫酸锌注射组，差异均有统计学意义（均为P<0.05）。结论　热休克蛋白反应可在青光眼模型大鼠RGCs中诱导HSP72的生成，且对青光眼性RGCs和视神经具有保护作用。