原子力显微镜观测小分子化合物J2对大鼠角膜移植术后内皮细胞膜表面的影响

目的 探讨应用原子力显微镜(AFM)观察大鼠角膜移植术后的内皮细胞,观测小分子J2化合物对角膜内皮细胞超微结构的影响.方法 队列研究方法.将30只取右眼行穿透性角膜移植术后的实验大鼠编号后计算机随机抽号分为2组,每组15只.A组为J2药实验组,B组为安慰剂对照组.每组于术后第5、10、15、20、25天,分别计算机选号随机取下3只大鼠的角膜植片,经苏木素-咿红染色及AFM样品固定.两组AFM观测数据平均粗糙度(Ra)、平均峰值高度(Rp)、平均低谷高度(Rv)采用单因素方差分析.结果 A组植片平均存活时间为(33.12±6.80)d,B组为(18.87±4.19)d,两组比较差异有统计学意义(F=47.7449,P=0.000).AFM观测发现两组样品在植片存活第5天均显示为较规则的六边形结构,直径约15μm,可见细胞表面的凹凸不平结构.随着时间延长,两组样品出现不同改变,术后第20天:B组样品的细胞结构无法辨认,凹凸不平的表面分辨困难,而A组的细胞仍然保持结构清晰.Ra、Rp和Rv在同期比较中,两组结果存在差异有统计学意义.术后第5天,A组:Ra(97.64±31.58)nm,Rp(297.79±25.19)nm,Rv(545.55±25.83)nm;B组:Ra(112.61±34.29)nm,Rp(265.06±24.17)nm,Rv(544.41±21.78)nm(Fa=30.9416,P=0.0000;Fp=263.6018,P=0.0000;Pv=1.2013,P=0.2735).术后第10天,A组:Ra(102.98±32.98)nm,Rp(711.38±21.94)nm,Rv(639.89±22.58)nm;B组:Ra(222.85±31.28)nm,Rp(111.22±20.35)nm,Rv(746.49±23.17)nm(Fa=2086.4535,P=0.0000;Fp=53768.4676,P=0.0000;Pv=3257.3178,P=0.0000).术后第15天,A组:Ra(87.44±34.97)nm,Rp(344.18±21.09)nm,Rv(482.61±22.27)am;B组:Ra(197.64±35.72)nm,Rp(510.76±24.98)nm,Rv(545.62±23.17)nm(Fa=1458.1057,P=0.0000;Fp=7788.6963,P=0.0000;Pv=1153.2860,P=0.0000).术后第20天,A组:Ra(85.85±32.53)nm,Rp(348.69±21.26)nm,Rv(367.65±23.12)nm;B组:Ra(201.36±34.12)nm,Rp(788.58±20.34)am,Rv(563.33±21.01)nm(Fa=1801.1215,P=0.0000;Fp=67 057.9516,P=0.0000;Pv=11 770.2195,P=0.0000).术后第25天,A组:Ra(104.97±32.47)nm,Rp(395.05±20.38)nm,Rv(396.17±21.59)nm;B组:Ra(43.85±31.28)nm,Rp(249.88±20.79)nm,Rv(154.88±22.37)nm(Fa=551.4134,P=0.0000;Fp=7458.9255,P=0.0000;Pv=18 070.5189,P=0.0000).结论 角膜移植术后,A、B两组的角膜内皮细胞应用AFM观测可发现在Ra、Rp及Rv比较上存在差异,小分子化合物J2可延迟角膜移植发生排斥反应的时间.

Abstract：

Objective To study the cell membrane of corneal endothelium with a micromolecular compound J2 in corneal allograft of rat using atomic force microscopy(AFM).Methods Cohort study.Subjects were divided into two groups: group A (n = 15): experimental group; group B(n = 15): placebo control group. At the fifth, tenth, fifteen, twentieth, twenty-fifth day after penetrating keratoplasty, the donor implant was separated from receipt bed, one part of which was stained by HE and the others fixed into AFM sample. Amplitude and height images were obtained in the tapping mode with a scan rate of 2 Hz and an integral gain of 0. 3 to 0. 5. Statistical analysis was performed using single-factor analysis of variance and P value was calculated. Results The average transplant survival time in group A was(33. 12 ±6. 80) d, and those in group B was (18. 87 ± 4. 19) d. There were significant difference between two group (F = 47. 7449, P = 0. 00 ) . There were obvious differences on ultrastructure measured by AFM between two groups. At the fifth day after penetrating keratoplasty, regular hexagonal structure of corneal endothelium was observed by AFM in both two group. The diameter of corneal endothelium was about 15 μm, uneven microstructure of cell could be found. The time being, different changes were arose in two group: a clear microstructure could be found in group A, however the microstructure of cell could not be recognized in group B. One way analysis of variance showed that significant differences on parameters ( Ra,Rp and Rv) were found between two groups ( P ＜0. 05 ). At the fifth day after penetrating keratoplasty, group A:Ra (97.64±31.58)nm, Rp(297. 79 ±25. 19)nm, Rv(545. 55 ±25. 83)nm; group B: Ra(112. 61 ±34.29) nm, Rp(265.06±24. 17) nm, Rv(544.41 ±21. 78)nm(Fa =30. 9416,P=0. 0000; Fp =263. 6018,P = 0.0000; Pv = 1.2013, P =0.2735). At the tenth day after penetrating keratoplasty, group A:Ra(102.98± 32.98)nm, Rp(711.38±21.94)nm, Rv(639. 89 ±22. 58) nm; group B:Ra (222. 85 ±31. 28) nm, Rp (111. 22 ±20. 35) nm, Rv (746. 49 ± 23.17) nm( Fa = 2086. 4535, P = 0.0000; Fp = 53768. 4676, P = 0.0000; Pv =3257.3178, P = 0.0000). At the fifteenth day after penetrating keratoplasty, group A:Ra (87.44±34.97)nm, Rp(344. 18 ±21. 09)nm, Rv(482.61 ±22.27)nm; group B:Ra( 197. 64 ±35. 72) nm, Rp(510.76±24.98)nm, Rv(545. 62 ±23. 17) nm( Fa = 1458. 1057,P =0. 0000; Fp =7788. 6963, P = 0. 0000;Pv = 1153. 2860,P =0.0000). At the twentieth day after penetrating keratoplasty, group A:Ra (85. 85±32.53)nm, Rp(348. 69 ±21. 26)nm, Rv(367. 65 ±23. 12)nm; group B: Ra (201. 36 ±34. 12) nm, Rp (788.58 ± 20.34) nm, Rv (563.33 ± 21.01 ) nm ( Fa = 1801. 1215, P = 0.0000; Fp = 67 057. 9516,P = 0. 0000; Fv = 11 770. 2195, P = 0. 0000 ) . At the twenty-fifth day after penetrating keratoplasty, group A:Ra (104. 97 ±32.47)nm, Rp(395.05 ±20.38)nm, Rv(396.17 ±21.59)nm; group B: Ra(43. 85 ±31. 28) nm, Rp(249. 88 ± 20. 79) nm, Rv( 154. 88 ±22. 37) nm(Fa =551. 4134, P = 0.0000; Fp = 7458.9255, P = 0.0000; Pv = 18 070.5189, P = 0.0000). Conclusions The morphology and ultrastructure of corneal endothelium in group A with J2 were different from group B by observation with AFM. J2 was an effect micromolecular in prevention of corneal allograft rejection.     

原子力显微镜观测甲状腺相关眼病患者外周血T细胞

目的 应用原子力显微镜(AFM)对甲状腺相关眼病(TAO)患者外周血T细胞的膜表面进行观测,比较与正常T细胞的异同.方法 采用病例对照研究方法,选择42例TAO患者作为TAO组,根据病情将其分为活动期组(18例)和静止期组(24例),另外选择92例正常人作为正常组.经免疫磁珠法分离得到外周血T细胞,细胞培养进一步将T细胞纯化.流式细胞分析法对T细胞进行鉴定并检测其纯度,AFM原位扫描细胞样品.3组AFM观测数据采用单因素方差分析和Dunnett-t检验.结果 3组T细胞在形态上均呈现较为规则的圆形;正常组T细胞直径约在7～8μm,高度在600～850 nm之间;而TAO急性期T细胞直径偏大,约在9～11 μm之间,表面的凹凸不平较明显,可见颗粒状突起及凹陷,边缘还可观察到有细微的树枝状突起分布;静止期T细胞直径略小,约在8～10μm之间,而膜表而凹凸不平的程度介于其他两组之间.平均粗糙度、峰数、平均峰值高度、平均低谷高度、表面积差值指标在3组中有所不同(F=28.809,58.213,169.789,35.933,121.325;P<0.05),而峰数、表面积差值则存在两两差异(P=0.047,0.002).结论 应用AFM可观测到TAO患者外周血T细胞与正常T细胞膜表而的超微结构有所不同,而且TAO活动期和静止期的T细胞形态上也有差别.     

原子力显微镜观测甲状腺相关眼病患者外周血T细胞

目的 应用原子力显微镜(AFM)对甲状腺相关眼病(TAO)患者外周血T细胞的膜表面进行观测,比较与正常T细胞的异同.方法 采用病例对照研究方法,选择42例TAO患者作为TAO组,根据病情将其分为活动期组(18例)和静止期组(24例),另外选择92例正常人作为正常组.经免疫磁珠法分离得到外周血T细胞,细胞培养进一步将T细胞纯化.流式细胞分析法对T细胞进行鉴定并检测其纯度,AFM原位扫描细胞样品.3组AFM观测数据采用单因素方差分析和Dunnett-t检验.结果 3组T细胞在形态上均呈现较为规则的圆形;正常组T细胞直径约在7～8μm,高度在600～850 nm之间;而TAO急性期T细胞直径偏大,约在9～11 μm之间,表面的凹凸不平较明显,可见颗粒状突起及凹陷,边缘还可观察到有细微的树枝状突起分布;静止期T细胞直径略小,约在8～10μm之间,而膜表而凹凸不平的程度介于其他两组之间.平均粗糙度、峰数、平均峰值高度、平均低谷高度、表面积差值指标在3组中有所不同(F=28.809,58.213,169.789,35.933,121.325;P<0.05),而峰数、表面积差值则存在两两差异(P=0.047,0.002).结论 应用AFM可观测到TAO患者外周血T细胞与正常T细胞膜表而的超微结构有所不同,而且TAO活动期和静止期的T细胞形态上也有差别.     

原子力显微镜观测甲状腺相关眼病患者外周血T细胞

目的 应用原子力显微镜(AFM)对甲状腺相关眼病(TAO)患者外周血T细胞的膜表面进行观测,比较与正常T细胞的异同.方法 采用病例对照研究方法,选择42例TAO患者作为TAO组,根据病情将其分为活动期组(18例)和静止期组(24例),另外选择92例正常人作为正常组.经免疫磁珠法分离得到外周血T细胞,细胞培养进一步将T细胞纯化.流式细胞分析法对T细胞进行鉴定并检测其纯度,AFM原位扫描细胞样品.3组AFM观测数据采用单因素方差分析和Dunnett-t检验.结果 3组T细胞在形态上均呈现较为规则的圆形;正常组T细胞直径约在7～8μm,高度在600～850 nm之间;而TAO急性期T细胞直径偏大,约在9～11 μm之间,表面的凹凸不平较明显,可见颗粒状突起及凹陷,边缘还可观察到有细微的树枝状突起分布;静止期T细胞直径略小,约在8～10μm之间,而膜表而凹凸不平的程度介于其他两组之间.平均粗糙度、峰数、平均峰值高度、平均低谷高度、表面积差值指标在3组中有所不同(F=28.809,58.213,169.789,35.933,121.325;P<0.05),而峰数、表面积差值则存在两两差异(P=0.047,0.002).结论 应用AFM可观测到TAO患者外周血T细胞与正常T细胞膜表而的超微结构有所不同,而且TAO活动期和静止期的T细胞形态上也有差别.     

原子力显微镜观测甲状腺相关眼病患者外周血T细胞

目的 应用原子力显微镜(AFM)对甲状腺相关眼病(TAO)患者外周血T细胞的膜表面进行观测,比较与正常T细胞的异同.方法 采用病例对照研究方法,选择42例TAO患者作为TAO组,根据病情将其分为活动期组(18例)和静止期组(24例),另外选择92例正常人作为正常组.经免疫磁珠法分离得到外周血T细胞,细胞培养进一步将T细胞纯化.流式细胞分析法对T细胞进行鉴定并检测其纯度,AFM原位扫描细胞样品.3组AFM观测数据采用单因素方差分析和Dunnett-t检验.结果 3组T细胞在形态上均呈现较为规则的圆形;正常组T细胞直径约在7～8μm,高度在600～850 nm之间;而TAO急性期T细胞直径偏大,约在9～11 μm之间,表面的凹凸不平较明显,可见颗粒状突起及凹陷,边缘还可观察到有细微的树枝状突起分布;静止期T细胞直径略小,约在8～10μm之间,而膜表而凹凸不平的程度介于其他两组之间.平均粗糙度、峰数、平均峰值高度、平均低谷高度、表面积差值指标在3组中有所不同(F=28.809,58.213,169.789,35.933,121.325;P<0.05),而峰数、表面积差值则存在两两差异(P=0.047,0.002).结论 应用AFM可观测到TAO患者外周血T细胞与正常T细胞膜表而的超微结构有所不同,而且TAO活动期和静止期的T细胞形态上也有差别.     

原子力显微镜观测甲状腺相关眼病患者外周血T细胞

目的 应用原子力显微镜(AFM)对甲状腺相关眼病(TAO)患者外周血T细胞的膜表面进行观测,比较与正常T细胞的异同.方法 采用病例对照研究方法,选择42例TAO患者作为TAO组,根据病情将其分为活动期组(18例)和静止期组(24例),另外选择92例正常人作为正常组.经免疫磁珠法分离得到外周血T细胞,细胞培养进一步将T细胞纯化.流式细胞分析法对T细胞进行鉴定并检测其纯度,AFM原位扫描细胞样品.3组AFM观测数据采用单因素方差分析和Dunnett-t检验.结果 3组T细胞在形态上均呈现较为规则的圆形;正常组T细胞直径约在7～8μm,高度在600～850 nm之间;而TAO急性期T细胞直径偏大,约在9～11 μm之间,表面的凹凸不平较明显,可见颗粒状突起及凹陷,边缘还可观察到有细微的树枝状突起分布;静止期T细胞直径略小,约在8～10μm之间,而膜表而凹凸不平的程度介于其他两组之间.平均粗糙度、峰数、平均峰值高度、平均低谷高度、表面积差值指标在3组中有所不同(F=28.809,58.213,169.789,35.933,121.325;P<0.05),而峰数、表面积差值则存在两两差异(P=0.047,0.002).结论 应用AFM可观测到TAO患者外周血T细胞与正常T细胞膜表而的超微结构有所不同,而且TAO活动期和静止期的T细胞形态上也有差别.     

原子力显微镜观测甲状腺相关眼病患者外周血T细胞

目的 应用原子力显微镜(AFM)对甲状腺相关眼病(TAO)患者外周血T细胞的膜表面进行观测,比较与正常T细胞的异同.方法 采用病例对照研究方法,选择42例TAO患者作为TAO组,根据病情将其分为活动期组(18例)和静止期组(24例),另外选择92例正常人作为正常组.经免疫磁珠法分离得到外周血T细胞,细胞培养进一步将T细胞纯化.流式细胞分析法对T细胞进行鉴定并检测其纯度,AFM原位扫描细胞样品.3组AFM观测数据采用单因素方差分析和Dunnett-t检验.结果 3组T细胞在形态上均呈现较为规则的圆形;正常组T细胞直径约在7～8μm,高度在600～850 nm之间;而TAO急性期T细胞直径偏大,约在9～11 μm之间,表面的凹凸不平较明显,可见颗粒状突起及凹陷,边缘还可观察到有细微的树枝状突起分布;静止期T细胞直径略小,约在8～10μm之间,而膜表而凹凸不平的程度介于其他两组之间.平均粗糙度、峰数、平均峰值高度、平均低谷高度、表面积差值指标在3组中有所不同(F=28.809,58.213,169.789,35.933,121.325;P<0.05),而峰数、表面积差值则存在两两差异(P=0.047,0.002).结论 应用AFM可观测到TAO患者外周血T细胞与正常T细胞膜表而的超微结构有所不同,而且TAO活动期和静止期的T细胞形态上也有差别.     

原子力显微镜观测甲状腺相关眼病患者外周血T细胞

目的 应用原子力显微镜(AFM)对甲状腺相关眼病(TAO)患者外周血T细胞的膜表面进行观测,比较与正常T细胞的异同.方法 采用病例对照研究方法,选择42例TAO患者作为TAO组,根据病情将其分为活动期组(18例)和静止期组(24例),另外选择92例正常人作为正常组.经免疫磁珠法分离得到外周血T细胞,细胞培养进一步将T细胞纯化.流式细胞分析法对T细胞进行鉴定并检测其纯度,AFM原位扫描细胞样品.3组AFM观测数据采用单因素方差分析和Dunnett-t检验.结果 3组T细胞在形态上均呈现较为规则的圆形;正常组T细胞直径约在7～8μm,高度在600～850 nm之间;而TAO急性期T细胞直径偏大,约在9～11 μm之间,表面的凹凸不平较明显,可见颗粒状突起及凹陷,边缘还可观察到有细微的树枝状突起分布;静止期T细胞直径略小,约在8～10μm之间,而膜表而凹凸不平的程度介于其他两组之间.平均粗糙度、峰数、平均峰值高度、平均低谷高度、表面积差值指标在3组中有所不同(F=28.809,58.213,169.789,35.933,121.325;P<0.05),而峰数、表面积差值则存在两两差异(P=0.047,0.002).结论 应用AFM可观测到TAO患者外周血T细胞与正常T细胞膜表而的超微结构有所不同,而且TAO活动期和静止期的T细胞形态上也有差别.     

原子力显微镜观测甲状腺相关眼病患者外周血T细胞

目的 应用原子力显微镜(AFM)对甲状腺相关眼病(TAO)患者外周血T细胞的膜表面进行观测,比较与正常T细胞的异同.方法 采用病例对照研究方法,选择42例TAO患者作为TAO组,根据病情将其分为活动期组(18例)和静止期组(24例),另外选择92例正常人作为正常组.经免疫磁珠法分离得到外周血T细胞,细胞培养进一步将T细胞纯化.流式细胞分析法对T细胞进行鉴定并检测其纯度,AFM原位扫描细胞样品.3组AFM观测数据采用单因素方差分析和Dunnett-t检验.结果 3组T细胞在形态上均呈现较为规则的圆形;正常组T细胞直径约在7～8μm,高度在600～850 nm之间;而TAO急性期T细胞直径偏大,约在9～11 μm之间,表面的凹凸不平较明显,可见颗粒状突起及凹陷,边缘还可观察到有细微的树枝状突起分布;静止期T细胞直径略小,约在8～10μm之间,而膜表而凹凸不平的程度介于其他两组之间.平均粗糙度、峰数、平均峰值高度、平均低谷高度、表面积差值指标在3组中有所不同(F=28.809,58.213,169.789,35.933,121.325;P<0.05),而峰数、表面积差值则存在两两差异(P=0.047,0.002).结论 应用AFM可观测到TAO患者外周血T细胞与正常T细胞膜表而的超微结构有所不同,而且TAO活动期和静止期的T细胞形态上也有差别.     

原子力显微镜观测甲状腺相关眼病患者外周血T细胞

目的 应用原子力显微镜(AFM)对甲状腺相关眼病(TAO)患者外周血T细胞的膜表面进行观测,比较与正常T细胞的异同.方法 采用病例对照研究方法,选择42例TAO患者作为TAO组,根据病情将其分为活动期组(18例)和静止期组(24例),另外选择92例正常人作为正常组.经免疫磁珠法分离得到外周血T细胞,细胞培养进一步将T细胞纯化.流式细胞分析法对T细胞进行鉴定并检测其纯度,AFM原位扫描细胞样品.3组AFM观测数据采用单因素方差分析和Dunnett-t检验.结果 3组T细胞在形态上均呈现较为规则的圆形;正常组T细胞直径约在7～8μm,高度在600～850 nm之间;而TAO急性期T细胞直径偏大,约在9～11 μm之间,表面的凹凸不平较明显,可见颗粒状突起及凹陷,边缘还可观察到有细微的树枝状突起分布;静止期T细胞直径略小,约在8～10μm之间,而膜表而凹凸不平的程度介于其他两组之间.平均粗糙度、峰数、平均峰值高度、平均低谷高度、表面积差值指标在3组中有所不同(F=28.809,58.213,169.789,35.933,121.325;P<0.05),而峰数、表面积差值则存在两两差异(P=0.047,0.002).结论 应用AFM可观测到TAO患者外周血T细胞与正常T细胞膜表而的超微结构有所不同,而且TAO活动期和静止期的T细胞形态上也有差别.     

人羊膜上皮细胞培养液抑制角膜新生血管的实验研究

背景 角膜新生血管(CNV)是一种常见的眼部病变,研究其发病机制及其抑制剂是眼科研究的热点和难点. 目的 研究人羊膜上皮细胞(AECs)培养液对CNV的抑制作用及机制. 方法 消化法培养及鉴定人AECs,并收集培养液,酶联免疫吸附试验(ELISA)法检测色素上皮衍生因子(PEDF)和白细胞介素1受体拮抗剂( IL-1Ra)在培养液中的质量浓度.兔角膜上皮细胞分离后分别用无血清DMEM培养基、人AECs培养液、混合培养液(DMEM+人AECs培养液)培养48 h,采用实时定量聚合酶链反应(QRT-PCR)法检测不同培养液培养的角膜上皮细胞中血管内皮生长因子(VEGF)及碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)的表达.用含质量分数10％胎牛血清的DMEM培养基培养人脐静脉血管内皮细胞(UVECs),并分别加入无血清DMEM、混合培养液和人AECs培养液,划痕法和细胞计数试剂盒8(CCK8)法检测各组培养液对人UVECs迁移的影响.分别在上述3种培养基中加入终质量浓度为50 μg/L的bFGF,CCK8法检测各培养液中人UVECs的增牛情况.在原子力显微镜(AFM)下观察人AECs培养液对人UVECs超微结构的影响. 结果 人羊膜培养和传代细胞角蛋白免疫组织化学染色阳性证实为人AECs.与无血清DMEM组相比,人AECs培养液组的兔角膜上皮细胞VEGF mRNA(1.00±0.22 vs.2.98±0.46)及bFGF mRNA( 1.00±0.36vs.2.55±0.48)的表达均明显下降,差异均有统计学意义(P=0.001、0.002);培养后不同时间人AECs培养液组人UVECs的增生吸光度(A)值明显下降,差异均有统计学意义(P＜0.05),人UVECs的迁移率下降,差异有统计学意义(P＜0.05).AFM观察见人AECs培养液组的血管内皮细胞膜粗糙、表面颗粒紊乱,细胞间连接及伪足减少.ELISA法检测人AECs培养液中PEDF的质量浓度为(70.41 ±0.68) μg/L,IL-1Ra的质量浓度为(153.56±0.36) ng/L,无血清DMEM组中未检出.结论 人AECs培养液可抑制角膜上皮VEGF及bFGF的表达,抑制血管内皮细胞的增生和迁移,细胞结构和功能改变,这可能是其抑制CNV的机制之一.     

影响准分子激光原位角膜磨镶术前后球差变化的诸因素分析

目的探讨准分子激光原位角膜磨镶术（laserinsitu keratomileusis,LASIK）的切削深度、治疗光区直径和术后角膜后表面前凸对术后球差变化的影响。方法随机选取采用波前像差引导的LASIK治疗的近视患者94例（185眼）,患者屈光系统四阶球差值采用Zywave像差仪测量,术后第6个月患者球差值与术前值相减所得即为球差变化值（用ΔSA表示）。角膜后表面的前凸值采用Orbscan-IIz裂隙光扫描地形图测量,记录术中治疗光区直径和切削深度。采用多元逐级回归方法分析手术中切削深度、治疗光区直径和术后角膜后表面前凸与术后球差变化的相关性。结果术前四阶球差值为（-0.08±0.16）μm,手术切削量均值为（96.11±24.63）μm,治疗光区直径为（6.39±0.25）mm。术后第6个月,四阶球差值为（-0.96±0.61）μm,ΔSA为（-0.89±0.62）μm,角膜后表面前凸值为（44.00±12.00）μm。经相关性分析,ΔSA变化与切削量（r=-0.50,P〈0.01）和术后角膜后表面前凸（r=-0.49,P〈0.01）呈负相关,与切削光区直径（r=0.31,P〈0.01）呈正相关。结论LASIK治疗近视后,患者的四阶球差呈负性增大趋势,球差变化值与手术切削深度及术后角膜后表面前凸呈负相关,与切削区直径呈正相关。     

兔角膜内皮细胞球形培养的活性和细胞表型

背景 组织工程角膜内皮层的构建和细胞注射疗法需要足够数量的角膜内皮细胞（CECs）,因此如何在体外培养大量高活性的角膜内皮种子细胞是当前亟需解决的问题. 目的 建立兔CECs高活性三维（3D）球形培养方法,探索培养细胞的生物学特性. 方法 酶消化法分离和培养兔CECs并进行传代,经低黏附振动培养法产生兔CECs球,倒置相差显微镜下观察培养细胞的形态;采用扫描电子显微镜观察CECs球的表面超微结构;用吖啶橙染色法鉴定CECs球中细胞的活性;采用CCK-8试剂盒检测细胞的吸光度（A450）值,判断细胞的增生情况.将CECs球接种到6孔细胞培养板贴壁培养1周,球形培养的细胞为球形培养组,常规培养的细胞为常规培养组.采用免疫荧光法检测闭锁小带蛋白1（ZO-1）和Na＋/K＋-ATP酶在细胞中的表达.结果 经球形培养的CECs呈聚集生长,培养1周细胞形态为六角形或多边形,融合成单层,呈铺路石状排列;扫描电子显微镜下可见兔CECs球体周围有细胞爬出,未长散的细胞球中细胞与细胞之间结合紧密,球体表面凹凸不平.吖啶橙染色表明,细胞球中90％细胞呈绿色荧光;球形培养组细胞平均A450值为1.524±0.013,常规培养组细胞平均A450值为1.265±0.021,球形培养组细胞增生值明显增加,2个组间差异有统计学意义（t=-3.436,P=0.010）.免疫荧光检测表明,培养的细胞中ZO-1和Na＋/K＋-ATP酶阳性细胞膜对FITC呈绿色荧光,细胞核DAPI染色呈蓝色荧光.结论 CECs的3D球形培养方法培养的细胞可保持细胞的高活性、高增生能力和细胞表型,为构建组织工程角膜内皮及细胞疗法提供了更好的角膜内皮种子细朐.     

光学相干断层扫描与视网膜电图检测大鼠视网膜光化学损伤

目的 比较频域光学相干断层成像（SD—OCT）检测与闪光视网膜电图（f-ERG）检测在蓝光诱导大鼠视网膜光损伤中的敏感性及其相互关系。方法 建立蓝光诱导大鼠视网膜光损伤模型,分别于照射后1d、3d、7d和14d,以SD—OCT测量视网膜外核层厚度,以f-ERG测量各波的反应振幅,分析大鼠外核层厚度与f-ERG各波反应振幅的关系。结果 蓝光照射后1d、3d、7d和14d大鼠平均视网膜外核层厚度依次为（36．54±3．82）μm、（27．07±2．70）μm、（25．37±2．32）μm和（19．54±1．79）μm,与对照组比较,在3d、7d和14d两组差异有统计学意义（F=8．992,8．838,9．183,P〈0．05）;ERG-a波振幅依次为（268．25±41．12）μv,（178．21±32．70）μv,（153．28±48．23）μv,（144．28±33．57）μv;ERG—b波振幅依次为（608．41±61．61）μv,（489．29±85．94）μv,（463．36±58．47）μv,（390．05±48．94）μv。与对照组相比,各波振幅明显降低,差异均有统计学意义（ERG-a波：F=a4．239,b9．443,b10．187,b10．872,aP〈0．05,bP〈0．01;ERG-b波：F=a3．976,b10．391,b10．787,b11．320,aP〈0．05,bP〈0．01;）。大鼠视网膜外核层厚度与f-ERG各波振幅均具有明显的正相关性（ERG-a：r=0．201,0．247,0．338,0．672,P〈0．05;ERG-b：r=0．131,0．278,0．345,0．578,P〈0．05）。结论 蓝光照射大鼠与对照组相比,f-ERG各波的反应振幅明显较对照组降低,可较早地反映光照导致视网膜功能受损;视网膜外核层厚度明显变薄,与前者具有明显相关性,两者分别从形态学及功能学共同揭示蓝光照射在活体大鼠视网膜中的改变。     

傅里叶频域光学相干断层成像技术在急慢性视神经损伤动物模型中的应用及评价

目的 评价傅里叶频域光学相干断层成像技术(FD-OCT)在大鼠急慢性视神经损伤动物模型中的应用及其与组织学研究的一致性.方法 利用经眶部视神经切断方法及巩膜上静脉烧灼方法建立大鼠急慢性视神经损伤动物模型.在急性视神经损伤模型中,于视神经切断术后即刻、3d、7d、10 d、14 d,分别用FD-OCT、视网膜神经节细胞(RGC)逆行标记、视神经纤维顺行标记方法检测视神经损伤状态.在慢性视神经损伤模型中,于巩膜上静脉烧灼术后即刻、1周、2周、3周、4周、5周、6周分别行上述方法检测.所有实验动物右眼为实验眼,左眼为对照眼.统计数据采用SPSS13.0软件进行分析,不同时间点的视网膜厚度比较采用重复测量资料的方差分析.结果 在急性视神经损伤动物模型中,视网膜厚度由术前(71.6±0.7)μm逐渐在术后3d、7d、10 d、14 d分别减薄至(71.0±0.9)μm、(67.4±1.7) μm、(58.6±2.2) μm、(54.6±1.2)μm,RGC数量在各时间点减少为对照组的(90.6±1.3)％、(53.1±3.8)％、(30.2±1.0)％、(11.3±4.6)％.在慢性视神经损伤动物模型中,视网膜厚度由术前(71.4±1.3) μm逐渐在术后1周、2周、3周、4周、5周、6周分别减薄至(70.4±1.1) μm、(65.9±1.2) μm、(59.9±1.0)μm、(57.3±2.4) μm、(54.7 ±2.9) μm、(51.3±2.6) μm,RGC数量在各时间点减少为对照组的(95.9±0.7)％、(91.9±0.9)％、(85.5±1.3)％、(82.3±0.9)％、(78.1±1.5)％、(74.5±1.4)％.两种动物模型中,视网膜厚度变薄及RGC数量减少与对照组相比差异均具有统计学意义.结论 FD-OCT对于评价慢性视神经损伤动物模型具有良好的应用价值,与组织学检测具有良好的一致性.(中国眼耳鼻喉科杂志,2012,12:20-25)     

Sirius眼前节分析系统与A型超声测厚仪对中央角膜厚度测量结果的对照分析

目的对照分析Sirius眼前节分析系统和A型超声测厚仪对中央角膜厚度(CCT)测量结果的差异,研究Sirius系统的准确性和可靠性。方法随机抽取屈光手术前175例(175只眼),分别应用Sirius(意大利科以康)和A超(DGH500)进行CCT测量,用SPSS13.0进行配对t检验。结果 Sirius系统测量的CCT平均值为(534.75±33.757)μm,A超所测CCT平均值为(550.70±35.037)μm。A超比Sirius测量的CCT厚15.95μm,有统计学差异(P<0.01),相关分析显示两种方法呈正相关(r=0.954,P=0.00)。因Sirius测量不受操作者影响且样本量较大,便以Sirius所测CCT分3组(1组CCT<500μm,2组CCT500～550μm,3组CCT>550μm),3组结果均为A超比Sirius测量的CCT厚,但都有很好的相关性。1组Sirius系统和A超的CCT分别为(478.96±13.408)μm和(496.70±20.003)μm,r 1=0.823,P=0.000;2组分别为(524.49±14.031)μm和(540.08±16.981)μm,r 2=0.794,P=0.000;3组分别为(571.08±15.769)μm和(586.90±18.952)μm,r 3=0.839,P=0.000。结论用Sirius三维地形图、眼前节分析系统进行屈光手术术前CCT测量,其结果可靠性好、影响因素少且操作简单、无创,具有很好的临床应用价值。     

ADP-核糖基化因子抑制剂在实验性碱烧伤诱导角膜新生血管中的作用及其机制

背景角膜新生血管（CNV）是导致角膜盲的主要原因之一,研究表明,ADP一核糖基化因子（ARF）对肿瘤细胞的增生有调节作用,抑制ARF能抑制血管的形成,但ARF抑制剂对CNV是否发挥作用尚不清楚。目的探讨ARF抑制剂在碱烧伤诱导的CNV形成过程中的作用及其机制。方法7～8周龄清洁级雄性BABL／c小鼠60只按照随机数字表法分为PBS对照组和ARF抑制剂干预组,每组各30只。所有小鼠采用角膜碱烧伤诱导法构建CNV模型,ARF抑制剂干预组小鼠于造模后1周腹腔内注射0．5g／LARF抑制剂溶液0．5ml,每周3次,共1周,PBS对照组小鼠以同样方式注射0．5mlPBS。各组分别取24只小鼠,于造模后0、4、7、14d采用实时定量PCR（real—timePCR）和Westernblot法检测小鼠角膜组织中ARFmRNA和蛋白的动态表达,并于造模后14d,采用Westernblot法检测各组小鼠角膜组织中血管内皮生长因子（VEGF）的表达。各组另取6只小鼠,于造模后2、4、7、14d裂隙灯显微镜下观察CNV形成情况,并于造模后14d,采用全视网膜铺片免疫荧光组织化学法检测角膜组织中CD31在CNV中的表达。体外实验中应用ARF抑制剂干预人视网膜血管内皮细胞（RECs）,CCK8法和细胞划痕法检测ARF对人RECs增生和迁移的影响。实验动物的使用和喂养遵循视觉及眼科学研究协会有关规定及苏州大学《实验动物管理及使用指南》。结果造模后PBS对照组和ARF抑制剂干预组小鼠角膜组织中ARFmRNA在各个时间点均有表达,在造模后14d达高峰,各组小鼠角膜中ARFmRNA的表达随着时间的延长而增加,差异有统计学意义（F时间=65．17,P=0．00）,不同时间点的组间比较差异无统计学意义（F＊＊=1．98,P=0．18）;造模后14d,ARF抑制剂干预组实验后不同时间点ARF蛋白水平相对表达值比较差异有统计学意义（F=10．77,P=0．00）。裂隙灯显微镜下检查发现,ARF抑制剂干预组CNV相对面积为0．45±0．05,PBS对照组为0．72±0．11,2个组间差异有统计学意义（t=-3．87,P〈0．05）。全角膜铺片免疫荧光组织化学法检测表明,ARF抑制剂干预组小鼠角膜组织CD31表达面积明显小于PBS对照组。造模后14d,Westernblot法检测显示,ARF抑制剂干预组VEGF蛋白表达水平为1．20＋0．21,明显低于PBS对照组的2．47±0．33,差异有统计学意义（t=-5．62,P〈0．05）。CCK8法检测结果显示,随着ARF抑制剂质量浓度的增加,ARF抑制剂对人RECs的抑制率增加,差异有统计学意义（F=8．47,P=0．02）。细胞划痕实验后24h,100μg／L和1000μg／LARF抑制剂干预组人RECs迁移距离分别为（5．46±1．32）μm和（5．04±1．68）μm,与PBS对照组的（8．49±1．18）μm相比明显减小,差异均有统计学意义（t=-2．94、-2．91,P〈0．05）。结论ARF抑制剂能抑制碱烧伤诱导的CNV发生,可能与其下调VEGF的表达以及抑制血管内皮细胞的增生和迁移有关。     

小梁切除术中透明质酸钠对角膜内皮细胞的影响

目的探讨小梁切除术中应用透明质酸钠对角膜内皮细胞数量和形态的影响。方法接受小梁切除术的原发性急性闭角型青光眼75例（75眼）,随机分为两组：治疗组37例（37眼）,前房内及巩膜瓣下注入1%透明质酸钠0.1ml并保留;对照组38例（38眼）,则注入平衡盐溶液（BSS）0.1ml。采用非接触型角膜内皮显微镜分别于术前及术后第1周、第3个月进行角膜内皮细胞检查并分析其数量和形态参数的变化,同时观察术后眼压、前房形成情况、滤过泡及并发症。结果治疗组术前、术后第1周及第3个月角膜内皮细胞密度分别为（2183±325）个/mm2、（2096±332）个/mm2、（2112±261）个/mm2;平均细胞面积分别为（462.7±42.8）μm2、（422.9±53.1）μm2、（430.8±55.2）μm2;细胞面积变异系数分别为（47.3±15.7）%、（48.1±12.5）%、（42.6±10.9）%;六角型细胞百分率分别为（52.3±14.8）%、（51.6±13.3）%、（55.7±11.2）%;术后第1周及第3个月各参数与术前比较,差异均无统计学意义（P〉0.05）。对照组术前、术后第1周及第3个月角膜内皮细胞密度分别为（2098±314）个/mm2、（1631±388）个/mm2、（1855±402）个/mm2;平均细胞面积分别为（462.7±42.8）μm2、（562.7±73.8）μm2、（536.6±65.1）μm2;细胞面积变异系数分别为（49.5±14.3）%、（59.2±12.6）%、（58.7±12.3）%;六角型细胞百分率分别为（53.2±16.1）%、（40.4±13.2）%、（42.6±11.8）%,术后第1周及第3个月的各参数与术前比较,差异均有统计学意义（P〈0.05）。术后第1周及第3个月,治疗组的角膜内皮细胞损失率分别为4.0%及3.3%,均低于对照组的17.5%及11.6%（P〈0.05）。治疗组术后浅前房发生的眼数、程度均低于对照组（P〈0.05）。术后第1周及第3个月,不同前房深度组的角膜内皮损失率之间均有统计学差异（P〈0.01）。术后前房深度越浅,角膜内皮细胞的损失率越大,两者有     

糖尿病黄斑水肿患者病变程度与脉络膜厚度的关系

目的　利用频域光学相干断层扫描深度增强（enhanced depth imaging spectral domain optical coherence tomography，EDI SD-OCT）观察糖尿病黄斑水肿（diabetic macular edema，DME）患者脉络膜厚度（choroidal thickness，CT）的变化及结构特点，探讨DME病变程度与CT的关系。方法　纳入2型糖尿病患者共123例204眼，其中69眼诊断为DME（DME组），135眼无黄斑水肿为对照组。DME眼依据OCT形态学特点进一步分为视网膜弥漫性增厚（diffuse retinal thickness，DRT）型（34眼）、黄斑囊样水肿（cystoid macular edema，CME）型（19眼）和浆液性视网膜脱离（serous retinal detachment，SRD）型（16眼），利用EDI-OCT分别测量黄斑中心凹下CT和以黄斑为中心上、下、鼻、颞500 μm、1000 μm、1500 μm、2000 μm处CT。结果　DME组黄斑中心凹下CT为（326.72±90.15）μm，对照组为（320.17±106.46）μm，两组之间无统计学差异，但黄斑中心凹下CT与视网膜厚度间具有明显正相关关系（r=0.270，P=0.025）。DME亚型CT分别为:DRT型（303.94±81.47）μm、CME型（304.42±73.98）μm和SRD型（401.63±88.80）μm，SRD型CT明显高于其他亚型（P<0.05），此外，SRD型的周边CT同样呈现均匀一致的增厚；鼻侧CT从500 μm至2000 μm呈距离敏感性降低（P<0.05），但SRD型鼻侧CT降低幅度明显变缓（P=0.195）。结论　SRD型黄斑水肿患者CT在中心凹下及周边部均显著增厚，CT与DME病变程度之间有一定相关性。     

两种飞秒激光制作准分子激光原位角膜磨镶术角膜瓣形态学和角膜生物力学指标的比较

目的评估并比较IntraLase飞秒激光和ZiemerLDV飞秒激光制作的准分子激光原位角膜磨镶术（LASIK）角膜瓣的均匀性、可预测性、精确性和重复性以及术后角膜生物力学各指标的变化。方法前瞻性、平行对照研究。对接受飞秒激光制瓣的LASIK手术患者30例（60眼）进行随访,14例使用IntraLase飞秒激光制作角膜瓣．16例使用ZiemerLDV飞秒激光制作角膜瓣,2组预期制得的角膜瓣厚度均为110μm。术前及术后1周、1个月、3个月使用Visante眼前节光学相干断层扫描（OCT）测量中央角膜厚度．并对制得的角膜瓣水平及垂直方向各7个点（角膜顶点以及距离顶点鼻、颞侧和上、下方各为1．0、2．0、3．0mm处）的厚度进行测量。对2组术前及术后1个月、3个月应用眼反应分析仪测量角膜阻力因子（CRF）和角膜滞后量（CH）的变化。数据采用重复测量方差分析和独立样本t检验。结果术后1周、1个月、3个月IntraLase组制得角膜瓣角膜顶点处平均角膜瓣厚度分别为（125±11）Ixm、（125±10）μm和（126±7）Ixm．各时间点2个方向上不同测量点间的角膜瓣厚度差异有统计学意义（F=11．85、12．638、8．78、8．18、4．81、5．39,P〈0．01）。ZiemerLDV组分别为（106±6）μm、（109±7）μm、（109±5）μm,各时间点两个方向上不同测量点间的角膜瓣厚度差异有统计学意义（F=28．20、9．43、18．00、7．14、5．65、4．92,P〈O．01）。术后1周、1个月、3个月IntraLase组制得角膜瓣各测量点的厚度与预期制得的角膜瓣厚度的差值平均值分别为（20．9±3．8）μm、（19．0±3．0）μm、（18．7±3．3）txm,ZiemerLDV组分别为（2．1±3．7）μm、（2．5±3．2）μm、（1．7±2．4）μm,2组各时间点角膜瓣测量点的厚度与预期厚度的差值比较,差异均有统计学意义（P〈0．01）。IntraLase组制得的角膜瓣各测量点的厚度与预期制得的角膜瓣厚度的差值标准差在7～15μm之间,ZiemerLDV组在4～8μm之间。术后1个月、3个月IntraLase组CRF值分别为（7．26±1．45）mmHg、（7．12±1．18）mmHg,CH值分别为（8．53±1．07）mmHg、（8．48±1．02）mmHg,ZiemerLDV组CRF值分别为（6．61±0．65）mmHg、（6．59±0．71）mmhg,CH值分别为（7．99±0．90）mmHg、（7．88±0．86）mmHg,均较术前显著降低,差异有统计学意义（P〈0．01）,但2组间差异无统计学意义（P〉0．05）。结论ZiemerLDV制瓣较IntraLase在可预测性、精确性和重复性方面更有优势。2种飞秒激光制瓣的LASIK术后角膜生物力学各参数均较术前显著降低．但两者间无差异。