增强型RACE技术克隆辐射诱导小鼠肠上皮新基因RS1

目的 在获得了辐射诱导小鼠肠上皮新基因RS1 EST序列的基础上获得全长cDNA。方法RT-PCR方法对RS1基因进行表达谱分析，找到表达丰度较高的组织提取总RNA作为模板，应用增强RACE技术即结合生物素探针富集靶cDNA的方法克隆RS1的cDNA末端。结果克隆到RS1片段3′端约2kb的序列。该序列5′端包含已知的RS1片段，3′端具有明显的polyA加尾信号，有编码区的终止密码子。明确了RS1的正、负链及其蛋白编码方向，为RS1 5′端的克隆提供了必要信息。结论 结果与本实验的设计完全一致，说明这一方法对从表达丰度低，难以设计最佳基因特异性引物的EST序列克隆其对应的全长cDNA是可行的，同时为下一步研究RS1在小鼠肠上皮辐射应激反应中的作用和被辐射诱导表达的调控模式奠定了基础。     

一低剂量辐射诱导新基因的转录调控和初步功能分析

目的：克隆低剂量辐射诱导基因，研究辐射对其转录调控作用和生物学功能。方法：用mRNA差异显示技术分离辐射诱导表达基因，用RACE技术获取cDNA旁侧序列，Northern杂交分析基因的转录调节，生物信息学分析基因的结构和功能。结果：获得包括3'端在内的辐射诱导新基因LRIGx的cDNA片段，序列同源性比较显示与人染色体20ql 1.2-12一段DNA高度同源（＞99％），Northern杂交结果揭示该基因转录子全长约8．5kb，在0．2Gy照射后2h出现诱导表达，4h后转录子水平为对照细胞的5倍多，也受0．02Gy更低剂量照射诱导表达，2Gy大剂量照射后1h出现短暂诱导表达，但不如低量照射明显，2h后恢复正常水平，生物信息学分析结果显示该基因编码产物含有解旋酶活性保守区，结论：分离鉴定出一低剂量辐射反应基因，其编码蛋白可能参与DNA代谢（如修复）等细胞辐射反应过程。     

运用抑制消减杂交构建辐射诱导EST库

目的 克隆并鉴定低剂量辐射射诱导基因,为探讨低剂量辐射生物学效应分子机理提供有益信息。方法 0．5Gyγ射线照射人胚肺细胞后,用抑制消减杂交技术（Suppression Subtractive Hybridizaation,SSH)构建低剂量辐射诱导EST库。用反向Northern杂交法对库中SEST片段进行筛选,挑取阳性克隆测序,并在GenBank序列数据中进行同源性比较。结果 得到受照后表达升高90个EST序列,代表21个基因的转录产物,部分基因的功能已明确。从功能上分析,这些基因产物的生物学作用涵盖了细胞周期、信号转导、细胞骨架、代谢、蛋白合成等几个重要的细胞生物学代谢反应过程,显示出细胞对低剂量辐射反应过程的多样性。另外,实验还获得4个新cDNA序列。结论 利用抑制消减杂交技术,从辐射前后HEL细胞中,得到低剂量辐射诱导EST片段,它们与细胞周期、增殖、代谢、信号转导、应激反应等相关,这些基因可能在细胞的低剂量辐射效应中起到重要作用。     

IL—6相关基因的克隆与鉴定

目的：克隆和鉴定IL－6作用相关基因将有助于揭示IL－6信号转导机制和发现新的信号分子,方法：以来源于IL－6处理和未处理的U937细胞mRNA的双链cDNA作为检测子和驱动子,进行cDNA代表性异分析,结果：分离了14个差异表达基因序列（EST）,反向RNA Nortghern杂交筛选到9个差异表达序列,经测序及序列分析,其中7个差异表达的EST代表在细胞生命活动或信号转导中有重要的作用的已知基因,2个EST代表与IL－6作用相关的新基因,Northern印迹和时间表达普进一步证明了P52和P31代表的新基因与IL－6作用的相关性,结论：上述结果提示这些差异cDNA序列可能与IL－6信号转号作用密切相关。     

人类内皮活化相关新基因EOLA1的发现及初步研究

为克隆一个在人脐静脉内皮细胞受脂多糖刺激后表达新序列标签ST5 5 (GenBank接受号BI12 16 4 6 )对应基因全长cDNA序列 ,作者在已知ST5 5序列基础上 ,采用快速扩增cDNA末端(RACE)技术延伸ST5 5的 3′和 5′末端以获取其全长cDNA序列 ,并经Northern印迹杂交验证 ,再对序列进行生物信息学分析 ,获得一个新的人类基因 ,命名为内皮细胞高表达脂多糖相关因子 1(EOLA1) (GenBank接受号AY0 74 889) ,该基因定位于人染色体Xq2 7.3,推导编码蛋白EOLA1包含 15 8个氨基酸 ,预测EOLA1是与内皮细胞活化相关的新基因 ,可能在细胞内信号转导中发挥作用     

HIV-1 B′亚型CNHN24毒株 5′端和3′端长末端重复序列的测定及全基因组克隆的构建

目的：对我国HIV-1 B′亚型CNHN24毒株5′端和3′端长末端重复序列（LTR）进行扩增及测序并构建全基因组克隆。方法：利用PCR扩增出5′LTR和3′LTR片段；并利用高保真DNA聚合酶分别扩增出病毒全基因组的5′半分子和3′半分子DNA，然后依次将其克隆入低拷贝载体pLG338。结果与结论：完成CNHN24毒株5′LTR和3′LTR的测序并提交至GenBank，其登录号分别为AY860947和AY894352，使CNHN24株成为具有完整全序列的HIV毒株；获得可以稳定传代的全基因组克隆质粒pCN24，利用此克隆转染293T细胞后可以产生恢复病毒。     

一株西尼罗病毒基因组cDNA亚克隆的构建与鉴定

目的：构建我室保存的一株西尼罗病毒引进毒株（CH-01）基因组全长cDNA的亚克隆，为进一步构建该毒株的感染性全长cDNA克隆奠定基础。方法：根据CH-01病毒株基因组序列中含有的特异性酶切位点，利用DNAstar及Olig06软件设计5对引物。以感染细胞中的病毒RNA为模板，通过RT-PCR扩增出覆盖病毒基因组全长的5个cDNA片段，并分别将其克隆至pGEM-Teasy载体，通过片段间共有的酶切位点进行连接，最终获得基因组5′和3′半分子，并分别通过序列测定加以鉴定。结果与结论：已构建出西尼罗病毒CH-01株基因组的5′和3′半分子，经酶切鉴定和序列测定表明所获得的cDNA克隆为该株病毒的特异性序列。     

快速克隆SET家族新成员SET07

目的:本实验基于生物信息学资源,快速克隆获得SET基因家族新成员SET07,并预测其相关生物学性质,为进一步探讨该基因的功能奠定基础。方法:以含有SET结构域的EST片段为基础,电子延伸获得含有SET结构域的新的编码基因,通过RT-PCR技术从胎脾组织中克隆得到该基因的cDNA序列,利用Northern印迹技术证实SET07基因的全长,并利用生物信息学工具预测其相关生物学性质。结果:获得新的SET家族成员,命名为SET07基因,证实该基因全长为3388bp。分析发现其开放阅读框架为1114bp,编码347个氨基酸,相对分子质量38×103,等电点9.57,在羧基端含有SET结构域,与H4-K20甲基转移酶同源。结论:上述结果提示SET07基因可能具有甲基转移酶的功能,在调节细胞生长周期、控制肿瘤的发生发展中发挥重要作用。     

IRM-2小鼠全长cDNA文库的构建及鉴定

目的 分离和鉴定IRM-2小鼠辐射抗性相关基因。方法 采用SMART技术构建IRM-2小鼠全长cDNA文库,提取雄性IRM-2小鼠脾脏总RNA,以此为模板,通过逆转录酶PowerScript反转录合成第1链cDNA,通过长距离PCR合成并扩增双链 cDNA。该扩增产物经纯化、Sfi Ⅰ酶切、去除小于500 bp片段后,将cDNA连接到Sfi Ⅰ消化过的PDNR-LIB质粒载体中,用电转化法将重组质粒转化到大肠杆菌DH5α,得到IRM-2小鼠cDNA原始文库并用PCR法对文库的质量进行鉴定。随机从cDNA文库挑选130个阳性克隆进行测序,与GenBank基因库进行同源性比较。结果 构建的cDNA文库的容量为2.25×10⁶个克隆,重组率达95%,平均插入片段长度约1.2 kb,全长基因比例为55%。从cDNA文库挑选的阳性克隆中有21条EST序列与小鼠已知基因不同源,在GenBank的EST数据库的注册号为DW474856~DW474876。结论 成功构建了IRM-2小鼠全长cDNA文库,21条EST提示IRM-2小鼠体内可能存在辐射抗性相关基因,为进一步分离和鉴定辐射抗性相关基因奠定了基础。     

登革1型病毒广州06株基因组全长感染性克隆的构建与鉴定

目的:构建本室新分离的登革1型病毒广州06株基因组全长感染性cDNA克隆,为深入研究登革病毒致病机制奠定基础.方法:根据登革1型病毒广州06株基因组全序列中单一酶切位点设计特异引物,分别扩增并克隆5个病毒亚基因组cDNA片段,将其逐一拼接连入pWSK 29低拷贝质粒载体,获得病毒全长cDNA克隆,并将其体外转录为RNA,再转染细胞获得恢复病毒.进一步通过RT-PCR扩增病毒5′和3′非编码区序列和特异性间接免疫荧光对其恢复病毒进行鉴定.结果和结论:构建获得登革1型病毒广州06株基因组全长感染性cDNA克隆,其恢复病毒与野生型病毒具有相似的生物学特性.     

浓缩铀诱发人白血病细胞凋亡及相关基因调控研究

目的　研究浓缩铀诱发人白血病HL 6 0细胞凋亡的损伤特征及对凋亡相关基因bcl 2和bax的调控作用。方法　研究受浓缩铀内照射不同时间诱发HL 6 0细胞凋亡的DNA凝胶电泳。运用免疫组织化学技术探讨浓缩铀对HL 6 0细胞bcl 2 bax的蛋白表达 ,以及RNA分子杂交技术探讨浓缩铀对HL 6 0细胞bcl 2mRNA的转录水平表达。结果　在浓缩铀作用下 ,HL 6 0细胞的DNA呈现出在核小体间断裂的阶梯状条带形成的凋亡特征 ;并且观察到对照HL 6 0细胞中bcl 2蛋白呈高度表达 ,为 (88± 7) % ,而受浓缩铀辐照后 ,可下调至 (6 1± 5 ) %。bax在对照细胞中的表达很低 ,在浓缩铀作用下 ,未见明显改变。而且受浓缩铀辐照后 ,可使HL 6 0细胞中bcl 2mRNA表达呈明显下调。结论　浓缩铀可诱发HL 6 0细胞凋亡发生 ,其诱发凋亡的程度随浓缩铀作用时间的延长而增加。并且发现浓缩铀诱发人白血病HL 6 0细胞的凋亡作用 ,与其下调凋亡相关基因bcl 2的表达相关联。     

室内氡暴露居民肺癌p53和k-ras基因突变

目的：检测室内高氡暴露地区居民肺癌P53和k-ras基因突变,方法：采用PCR扩增,PCR－SSCP电泳和序列分析方法。结果：9例标本中有5例p53PCR-SSCP电泳呈阳性结果,其中3例经克隆测序发现有碱基置换,结论：室内氡浓度在200－350Bq.m^-3.a^-1范围内的7例肺癌病例中有5例发生P53基因突变,P53基因突变还可能与肺癌患者的年龄吸烟史有关。     

2002年60Co放疗标准的IAEA-SSDL TLD国际比对

目的　参加IAEA的SSDL比对 ,检查SSDL6 0 Co放疗标准的准确度水平 ,保证量值传递的准确性。方法　IAEA在比对时邮寄TLD到本所SSDL ,经过测量后对每个TLD照射 2Gy ,IAEA对其进行评价后给出SSDL的比对偏差。结果　参加这次比对的偏差为 - 2 4 %。结论　根据IAEA的规定 ,该项比对的最大允许偏差为± 3 5 % ,所以这次比对是合格的。     

103Pd放射性支架持续照射犬胆管的放射性损伤的实验研究

目的　寻找动物胆管金属内支架植入方法 ,观察动物胆管植入1 0 3 Pd放射性支架 ,胆管腔内照射的放射性损伤。方法　实验动物为雄性健康杂种犬 ,体重 1 5～ 2 0kg。麻醉下经手术植入1 0 3 Pd放射性金属支架于犬的胆管腔内 ,1 0 3 Pd的放射性活度分别为 1 2 5× 1 0 4kBq、1 6 6× 1 0 4kBq、2 2 2× 1 0 4kBq、2 5 9× 1 0 4kBq、2 9 6× 1 0 4kBq和 3 7× 1 0 5kBq ,植入后 30d取出1 0 3 Pd放射性金属支架和胆管 ,后者经组织切片HE染色 ,光镜下进行放射性损伤的评价。结果　放射性活度为 1 2 5× 1 0 4kBq ,光镜下可观察到黏膜损伤 ;放射性活度为 2 2 2× 1 0 4kBq时胆管放射性损伤达肌层 ;放射性活度为3 7× 1 0 5kBq时放射性损伤达胆管壁外膜 ,出现胆管穿孔。根据不同放射性活度照射后 ,胆管的放射性损伤的放射性活度效应曲线得出 ,ED50 为 2 8 2× 1 0 4kBq。结论　1 0 3 Pd金属支架胆管腔内近距离照射有明显的剂量 效应关系 ,为该放射性支架应用于临床治疗胆管良、恶性狭窄提供重要的实验依据     

室内氡暴露居民外周血淋巴细胞DNA损伤及微核细胞发生率

目的：观察室内氡暴露居民外周血淋巴细胞DNA损伤及微核细胞发生率。方法：采用单核细胞凝胶电泳和微核检测两种方法。观察了我国甘肃省窑洞内氡暴露居民及对照居民外周血淋巴细胞DNA损伤及微核细胞发生率。结果：窑洞和普通住房居民（室内空气中氡浓度分别为200－350Bq.m^－3及37．5-77.1Bq.m^－3)的细胞迁移发生率分别为1．68％和1．43％，人发生细胞迁移百分别为57．1％和54．3％。50岁以上窑洞和普通住房居民细胞迁移和人发生细胞迁移率分别为2．14％、75．0％和2．00％、64．7％。窑洞和普通住房居民微核细胞发生率分别为1．07％和0．78％。结论：窑洞居民外周血淋巴细胞DNA损伤及微核细胞发生率略高于普通住房居民，P值接近0．05。     

103Pd放射性支架抑制再狭窄的作用及对平滑肌细胞凋亡基因表达的影响

目的　观察1 0 3Pd放射性支架对兔腹主动脉中膜平滑肌细胞凋亡相关基因Bcl 2及BaxmRNA表达的影响 ,探讨其防治血管成形术后再狭窄的作用机理。方法　将雄性新西兰大白兔 5 0只随机分为普通支架组及1 0 3Pd放射性支架组 ,设正常对照。分别于术后 3、7、14、2 8和 5 6d取材 ,进行病理形态学研究 ,并用原位杂交的方法测定血管中膜平滑肌细胞中Bcl 2mRNA及BaxmRNA的表达。结果　光镜下发现 ,放射性支架组管腔狭窄程度明显低于普通支架组 ,术后第 5 6天最显著(P <0 0 1)。与对照组比较 ,术后 3～ 2 8d普通支架组与放射性支架组Bcl 2mRNA表达均明显增加 ,而放射性支架组的表达则较普通支架组降低 (P <0 0 1)。BaxmRNA的表达 ,术后第 3～ 2 8天两支架组均超过对照组 ,而放射性支架组的表达较普通支架组显著增加 (P <0 0 1)。Bcl 2mRNA与BaxmRNA的比值显示 ,普通支架组术后第 3、14和 2 8天均大于对照组 (P <0 0 1) ,放射性支架组虽也大于对照组 ,但无统计学差异 (P >0 0 5 )。术后第 3～ 2 8天 ,放射性支架组的比值均小于普通支架组(P <0 0 5 )。结论　1 0 3Pd放射性支架增加细胞凋亡的BaxmRNA表达 ,减少抑制细胞凋亡的Bcl 2mRNA表达 ,使凋亡细胞比例增加 ,降低再狭窄的发生     

32P液体球囊在血管组织中的剂量分布

目的　研究放射性液体球囊治疗冠状动脉再狭窄时在血管组织内的剂量分布。方法　用模拟实验和理论计算两种方法估算剂量分布。结果　模拟测量和理论计算的剂量平均值分别为 9 0 ,9 7mGy·min-1 ,两者差异为 7 8%。结论　3 2 P液体球囊的剂量分布在轴向上均匀 ,在径向上快速衰减     

野生型p53基因转染卵巢癌SKOV-3细胞对放疗敏感性的影响

目的 探讨γ射线照射抑制平滑肌细胞（SMC）增殖的信号传递途径。方法 培养的动脉平滑肌细胞分别接受吸收剂量为3.5、7．0、14Gy^60Coγ射线照射后，以^3H-TdR掺入法测定平滑肌细胞增殖程度，放射活性法测定蛋白激酶C（PKC）及丝裂素活化蛋白激酶（MAPK）活性。结果 7．0、14Gy^60Coγ射线能明显抑制平滑肌细胞增殖，同时有MAPK、PKC活性明显降低。结论 7．0、14Gy^60Coγ射线抑制血管平滑肌细胞增殖可能是通过降低MAPK、PKC活性途径实现的。     

氡染毒小鼠外周血细胞差异表达基因的筛选与鉴定

目的 在建立氡染毒小鼠模型的基础上,筛选和鉴定氡染毒小鼠外周血细胞差异表达基因。方法 采用HD-3型多功能氡室对BALB/c小鼠动态吸入染毒,建立实验动物模型。按照小鼠吸入氡及其子体的累积剂量分为实验组(累积剂量105 WLM)和对照组(室内本底浓度,1 WLM)。采用RNA转录物5'末端启动机制技术(SMART)和抑制性消减杂交技术(SSH)构建正、反向消减cDNA文库,选取含有插入cDNA片段的克隆进行反向Northern杂交筛选上调或下调的阳性克隆。克隆的测序结果进行同源性检索和生物信息学分析。结果 在成功构建了消减cDNA文库基础上,挑取白斑390个,获得312个含有插入片段的单克隆,进行反向Northern杂交,分析基因的上调或下调水平。选取差异表达克隆41个进行测序及生物信息学分析,最终获得10条已知功能或有注释的差异基因片段和3条未知的表达序列标签(EST)。筛选出的差异表达基因涉及氧化损伤、细胞增殖和肿瘤发生等多方面的功能。结论 氡染毒可引起一系列基因表达的上调或下调,利用SSH技术可以筛选到氡染毒的差异表达基因,为探讨氡损伤机制提供参考。     

肝动脉化疗栓塞治疗肝癌患者的X射线辐射评价

目的　研究经肝动脉化疗栓塞 (THACE)治疗肝癌过程中 ,患者受到的X射线辐射 ,为THACE放射防护提供依据。方法　回顾性分析 82例HCC患者的辐射剂量资料 ,DSA机 (Angiostar Plus)配置穿透电离室型剂量监测系统 (DiamentorK1andDiamentorED) ,在线读取面积剂量乘积DAP(cGy cm2 )和入射表面剂量ESD(mGy) ,采用Monte Carlo转换因子估算有效剂量ED(mSv)。并分析近期 10例THACE患者 ,在提高基值管电压、减低透视脉冲频率和摄影帧数下对辐射剂量的影响。结果　 82例HCC患者透视时间 (35 3± 2 1 1)min ,摄影 (2 34± 10 8)帧 ,DAP为 (2 174 8± 12 4 2 4 )cGy cm2 ,ESD为 (96 4± 6 32 )mGy ,ED为 (34 8± 19 9)mSv。透视对总DAP的贡献 (2 4 0± 12 7) %小于摄影 (75 9± 12 7) % ,透视对ESD值的贡献 (4 9 8± 14 9) % ,与摄影相似 (5 1 6± 14 2 ) %。近期的 10例THACE患者的每分钟透视剂量、每帧摄影剂量及总剂量都比HCC患者明显降低。结论　在THACE过程中患者受到一次性较大剂量X射线照射。适度提高基值管电压、减低透视脉冲频率和缩减摄影帧数 ,可以有效降低患者的辐射剂量